Chapitre 1 : La culture cellulaire animale

I- Historique
C’est au début du 19ème siècle qu’on commence à faire de la culture cellulaire en mettant des organes (explants,
morceaux d’organes) dans une boîte de pétri, sur un milieu riche qui était du sang coagulé. Ils arrivaient à faire de
la survie cellulaire grâce à ce milieu riche (sang : fournisseur de nutriments de faible poids moléculaire pour la
culture). On avait le mélange de cellules avec la MEC et un certain nombre de molécules en quantité suffisante
pour permettre la survie, c’est comme si on avait déplacé l’organe du milieu vivant dans une boite de pétri, mais
les cellules n’étaient pas individualisées, elles avaient des contacts avec les autres cellules de ce tissu, et donc
elles avaient des informations, et ça suffisait pendant un certain temps pour faire de la survie : assez de
macromolécules, et assez de jonction cellule-cellule pour qu’il y ait survie.

Ensuite dans les années 1930 on a pu cultiver des agents pathogènes (come le virus de la polyoménite) sur un
tissu nerveux embryonnaire humain. Il y avait 2 idées assez neuves (de Sabine) : on s’est dit qu’on devrait prendre
des cellules d’un organisme très jeune (cellules très jeunes), et on se dit qu’elles ont un potentiel de division très
important car elles sont capables de se diviser pour donner un organisme adulte, donc on s’est dit qu’elles
seraient plus facilement cultivables. Et ensuite, l’idée c’était que pour cultiver l’agent pathogène qui se multiplie
sur un certain type cellulaire, on a besoin d’enrichir le milieu en ce type cellulaire. On a optimisé le support (on a
rajouté des nutriments dans le coagulum). Et là on a réussi à faire de la culture à partir d’explants, ce n’était pas
que de la survie puisqu’il y avait vraiment de la division cellulaire.

Enfin Dulbecco et ses équipes ont testé une liste de produits (nutriments) pour savoir ce qu’il y a dans ce
coagulum et qui est essentiel à la survie, pour savoir ce qu’il faut sur un milieu pour faire survivre les cellules.

L’autre avancée dans les années 50 : Avant de mettre en culture un explant, on essaie de dissocier les unes des
autres et les accrocher sur un support (verre neutralisé : sans charges) : on dissocie les cellules pour que chacune
s’accroche au support. Les cellules interagissent les unes aux autres par des protéines extracellulaires donc on
utilisait des protéases (trypsine).

On a pu ainsi définir des conditions de culture et un milieu de culture. Aujourd’hui on utilise du plastique et on
optimise ce support par des modifications du plastique (charges différentes, molécules d’adhésion), et comme
agent dispersant des tissus, on utilise des protéases comme la collagénase ou la trypsine.

Très simplement comment on fait ? On prend un organisme, plus il est jeune, plus les cellules seront
indifférenciées et donc moins dépendantes de certains facteurs (plus autonome), et donc elles seront plus
facilement cultivables in vitro. Souvent on prend un explant d’embryon qu’on coupe ou qu’on digère avec des
enzymes (protéases). Ensuite on le met dans un milieu de culture et les cellules vont adhérer si ce sont des
cellules adhérentes, et sinon elles restent en suspension.

On travaille en milieu stérile, dans des boites. Ou alors si on est dans un milieu plus industriel, on multiplie les
capacités de support, on utilise des bioréacteurs. On est capable de faire de la culture en continu (dès que les
cellules se sont divisées on en éjecte une partie, on n’a pas besoin de surveiller les cellules tous les jours pour
faire les échanges). Donc on est capables de cultiver un très grand nombre de cellules mais toujours sans
connaitre tous les paramètres.
 II- Quels sont les besoins cellulaires sur les milieux de culture ?
1) Les nutriments

Ce qu’il faut faire c’est reproduire au mieux l’environnement physiologique de chaque type cellulaire. Selon le
type de manip qu’on fait, on a besoin de nutriments différents, on est plus ou moins exigeants.

a. Les nutriments essentiels

Ce sont les substrats de métabolisme énergétique et structural (il faut qu’on puisse avoir une cellule qui a
suffisamment d’énergie et suffisamment de protéines structurales pour se maintenir dans sa forme), des
vitamines, des sels minéraux et des ions inorganiques.

Il faut mettre des nutriments de faible poids moléculaire : ils serviront de substrats pour la biosynthèse, le
métabolisme ou même de catalyseurs de ces réactions enzymatiques. Il faut :

- Des ions : qui assurent un rôle physiologique et qui interviennent notamment dans le potentiel redox de la
membrane cellulaire, dans la balance osmotique, des cofacteurs de réaction enzymatique. Sodium, calcium,
potassium, magnésium, zinc etc.  tout ça en bonne concentration.
- Des sucres : ils ont 2 rôles : source de carbone pour le métabolisme et la biosynthèse, et source d’énergie :
glucose, galactose, lactate et d’autres si besoin. Le plus souvent c’est le glucose qu’on utilise, mais pour les
cellules nerveuses on met du lactate (car le glucose ne rentre pas directement dans les cellules nerveuses).
- Des acides aminés : Les vertébrés sont capables de synthétiser certains acides aminés et pas d’autres, donc
on pourrait penser que selon le type cellulaire on ajoute ce qui manque. Mais non, on ajoute tous les acides
aminés, même si certaines cellules sont capables de synthétiser certains acides aminés.
- Vitamines : la biotine, l’acide folique, la thiamine, l’acide ascorbique, la choline etc.
- Sources de pyrimidines et de purines : adénine et thymidine suffisent pour créer toutes les purines et
pyrimidines, celles qui sont essentielles pour l’ADN ou sous d’autres formes dans la cellule
- Sources de lipides : acide oléique et cholestérol suffisent à produire tous les lipides

Et pour chaque élément, Dulbecco a fait varier la concentration pour déterminer la concentration idéale (sans
effets toxiques), tout en gardant constant les autres éléments. Donc il faut faire attention à ce qu’on ait une
concentration optimale de chaque élément. Donc le milieu de base qu’on utilise dans 90% des cultures cellulaires,
on l’a appelé DMEM (D en référence à Dulbecco).

Il faut aussi vérifier qu’il n’y ait pas d’effets de facteurs toxiques ou inhibiteurs (peut être par excès d’éléments
essentiels : exemple si on met trop de glucose, on change l’osmolarité et donc on a un effet cytotoxique). Dans les
purifications des produits, on vérifie qu’on n’a pas d’agents inhibiteurs (car on a toujours des produits purs à
99%).

b. Autres nutriments

On ne sait pas ce qu’il y a dedans, mais on sait que dans le sérum on a l’essentiel des facteurs indispensables pour
la prolifération de la plupart des cellules. On dit la plupart des cellules car on ne sait pas cultiver les cellules
nerveuses in vitro, (même si on sait leur faire faire quelques divisions) donc ça veut dire qu’il manque des choses
dans le sérum, ou que les facteurs inconnus sont en concentrations trop faibles dans le sérum.

Les autres nutriments sont des facteurs de croissance et des facteurs d’attachement. On en connait un certain
nombre mais pas tous. On sait juste qu’ils sont retrouvés dans le sérum.

On a différents types de sérum : fœtal, du nouveau-né (riche en variabilité et quantité de ces facteurs), et sérum
d’adulte qui est beaucoup plus pauvre. Plus on grandit, plus on s’appauvrit en diversité et en quantité de ces
facteurs d’attachement et de croissance.
Au jour d’aujourd’hui on est incapables de lister tous les facteurs dans le sérum qui sont indispensables. Il existe
dans le sérum plein de facteurs indispensables pour la survie mais qui sont inconnus pour nous. La plupart des
cellules ne peuvent pas se multiplier dans un milieu défini, c’est-à-dire qui contient tous les facteurs qu’on connait
actuellement.

Les facteurs sont très conservés au cours de l’évolution et très conservés dans l’espèce. Par exemple avec du
sérum aviaire on peut faire pousser des cellules de poulet aussi bien que des cellules de veau. Ces facteurs ne
sont pas forcément identiques mais ils ont des fonctions conservées.

Parmi ceux qu’on connait : ce sont des polypeptides de faible poids moléculaire (60 à 30 KDa) qui s’attachent à
des récepteurs membranaires, quelques fois des récepteurs intracellulaires. Ils vont dans la cellule par des
mécanismes actifs (ou passifs si c’est des petites molécules), et ensuite ils se fixent sur leurs récepteurs
intracellulaires. Ces facteurs agissent sur les cellules voisines : ils sont produits par un type cellulaire et agissent
sur les cellules voisines soit de même type (stimulation autocrine) soit de type différent (stimulation paracrine).

La concentration plasmidique (dans le sérum) est très faible, et varie en fonction de l’âge du sérum (nouveau-né :
concentrations plus élevées que chez l’adulte). Chez l’embryon, on a une variabilité très importante car on doit
faire de la différenciation donc ils doivent recevoir pleins de signaux différents. Quand on fait des cultures in vitro,
la plupart du temps on prend du sérum embryonnaire (souvent de veau pour des raisons de quantité). Par contre
pour certains types cellulaires, on a des spécificités d’espèce : pour certaines cellules d’oiseaux, il faut absolument
un facteur aviaire qui n’est pas présent chez le veau, donc on sera obligés de mettre un peu de sérum aviaire. On
a quand même des spécificités d’espèces pour certains types cellulaires.

Il existe un certain nombre de familles dont les principales sont :

- Le PDGF : facteur de croissance de plaquettes

- Epidermal GF : pour l’EGF et TGFα. Facteurs de croissance des cellules épithéliales.
- Fibroblast GF, Nerve GF et TGFβ. Le TGFβ est un facteur d’arrêt de croissance et non de croissance (Tumor
Growth Factor)

Autres nutriments :

- Facteurs essentiels pour l’ensemble des tissus de l’organisme : l’insuline, la transferrine : pour la transduction
de signal au niveau de la cellule.
- Facteurs spécifiques d’un type cellulaire : IL2 pour les LT
- Protéines d’attachement : albumine (pour la fixation et transport d’acides gras), fibronectine, collagène,
(polylysine = produit de synthèse qui mime certains facteurs d’attachement)

C’était les milieux indéfinis : c’est-à-dire dans lesquels on met soit :

- du sérum : facteurs de croissance, albumine, transferrine, hormones)

- ou alors on met des extraits de tissus : on met du milieu cellulaire qu’on retrouve dans un foie (on fait
macérer le foie dans un milieu physiologique et on récupère toutes les macromolécules du foie, donc on a un
extrait cellulaire du foie qui contient tous les éléments nécessaires à la survie cellulaire et à la différenciation
- ou alors un milieu conditionné : on cultive des cellules hépatiques, in vitro, elles vont produire des
macromolécules et on les récupère pour les mettre soit sur des cellules hépatiques soit sur un autre type
cellulaire : c’est un milieu enrichi en facteurs produits par du tissu in vitro (on peut faire ça pour voir l’impact
d’un tissu sur un autre au niveau différenciation ou mort cellulaire ou autre)

Par opposition, le milieu défini ne contient que des éléments qu’on connait. C’est-à-dire qu’on ne met pas de
sérum, pas d’extraits de tissu, pas de milieu conditionné, mais on met du FGF, de l’EGF, de la transferrine, de
l’insuline etc. Il n’y a que quelques types dont les fibroblastes qui arrivent à se multiplier dans ce type de milieu.

2) Les nécessités physiologiques

Ce sont :

- La température : pour nous, les mammifères 37°C. On s’adapte à la température de l’organisme (ex : la
mouche c’est plutôt à une température ambiante)
- L’humidité : on se met à 85% d’hygrométrie pour pas que les cellules manquent d’humidité, on évite
l’assèchement.
- Le taux de CO2 : in vivo, suite au métabolisme cellulaire et aux activités musculaires on a un taux de CO2 de 1 à
10%, donc pour être dans les mêmes conditions, on se met dans une étuve qui apporte un taux de CO2 assez
important. Quand on ne fait pas de manip spécifique sur la problématique d’oxygénation des cellules, on se
met à un taux de CO2 de 5%. Donc il ne faut pas ouvrir trop longtemps les boites en dehors de l’étuve sinon le
taux de CO2 chute, et donc mort cellulaire.
- Le pH : détermine entre autre le potentiel redox de la cellule. On travaille à un pH très constant, identique à
celui des cellules in situ : donc entre 7,15 et 7,45.
- Osmolalité : il faut une pression osmotique identique à ce qu’on a in situ (concentration en sels de la cellule)
on se met dans les mêmes conditions par l’apport en NaCl, et le glucose aussi et tous les paramètres qui
peuvent faire varier la pression osmotique.

Pour le pH : ce pH doit être fixe et on sait aussi que les cellules ont besoin d’oxygène. Mais dans l’organisme, la
concentration en CO2 est non négligeable, avec une pression de 5,3kPa. Donc pour reproduire ces phénomènes
physiques, on utilise un système tampon qui va utiliser du bicarbonate HCO3- avec l’oxygène atmosphérique de
5%.

Les cellules font du métabolisme donc produisent du CO2. Le CO2 + H2O du milieu se transforme en HCO3- + H+
donc on a un phénomène d’acidification du milieu. Donc on doit contrôler la concentration de CO2 et H2O, il ne
faut pas que ce soit trop élevé. Pour ça, on ajoute du bicarbonate de sodium dans le milieu. Le CO2 de l’air se
dissout dans le milieu et on a un équilibre entre HCO3- et CO2. Il faut contrôler la quantité de bicarbonate du
milieu pour garder le pH dans la gamme très fine de pH : on rajoute 1,5 à 2,2 g/L de bicarbonate de sodium pour
5% de CO2.

Le milieu a une certaine couleur car on y met un colorant qui change de couleur selon le pH. On a mis un certain
volume de bicarbonate pour que cet équilibre soit stable entre les ions H+ et la concentration de CO2. Mais si on a
un métabolisme trop important (les cellules se divisent plus que ce qu’on pense), au bout d’un moment cet
équilibre va être déplacé : les ions H+ sont surproduits, le milieu devient jaune. Si le milieu devient jaune, il faut
changer le milieu pour apporter de nouveaux nutriments (car métabolisme cellulaire important) et une
concentration en bicarbonate pour conserver le bon pH.

 C’est une astuce visuelle assez pratique : modification de couleur révèle un certain niveau de
métabolisme.

3) Les nécessités cellulaires

Dans la boîte de culture on doit permettre des contacts entre cellules et des contacts entre les cellules et la MEC.
Et d’autre part on doit aussi permettre aux cellules de recevoir les infos des cellules voisines (facteurs de
croissance qui ont une influence sur les cellules voisines). Si on a une concentration trop faible de cellules, une
cellule ne pourra pas renvoyer aux autres cellules un facteur de croissance qu’elle a produit car il sera dilué par le
milieu. Donc on a besoin de contact et besoin d’une concentration de facteurs de croissance de type autocrine
suffisante : pour ça on doit mettre un nombre de cellules suffisant au fond de la boîte. Il ne faut pas que la boite
soit complètement recouverte mais il faut qu’il puisse y avoir un contact cellulaire.

In vivo, les cellules sont en contact les unes avec les autres : on a un tissu dense, bien qu’on soit dans le tissu
conjonctif, on a beaucoup d’espaces qui sont remplis par la MEC. Mais tout se touche, et on doit reproduire ça in
vitro. Le tissu conjonctif est plus lâche mais toutes les cellules doivent se contacter ou être en contact avec la
MEC. Et même si on regarde un autre type de tissu qui n’est pas du tissu conjonctif, on voit que les cellules sont
juxtaposées les unes aux autres.

Donc on a besoin d’avoir une densité cellulaire importante et on a besoin d’un support d’adhérence.

Ce support d’adhérence est dû à des interactions intégrines-fibronectines avec le support. Ce sont ces
interactions qui déterminent la morphologie de la cellule. Si les cellules n’ont pas la même forme, c’est parce
qu’elles interagissent différemment les unes avec les autres, ça signifie qu’elles n’ont pas la même fonction. Mais
si on prend tout le tissu et qu’on fait agir une protéase qui permet de disperser toutes les cellules, elles auront
toutes une forme ronde car une cellule qui n’adhère pas à un support a toujours une forme ronde. C’est
seulement quand la cellule adhère à un support qu’elle acquiert sa forme. C’est vrai à l’exception du système
hématopoïétique.

In vivo, ces interactions ont lieu grâce aux jonctions cellules-cellules et cellules-matrice extracellulaire.

La MEC varie en fonction du tissu, et elle contient un certain nombre de macromolécules en fonction des tissus et
des degrés de différenciation de ces tissus.

Cette MEC est indispensable pour le maintien d’un environnement physiologique favorable. Elle a un rôle dans
l’état hydrique des cellules et dans la diffusion et le stockage des métabolites. Elle joue un rôle actif dans les
phénomènes de différenciation cellulaire car elle stocke des molécules d’information puis les libère à un moment
donné pour que les cellules puissent les capter. Donc elle joue un rôle essentiel dans le transfert d’info
notamment lors de phénomènes de différenciation cellulaire ou de réponse cellulaire (à une attaque par un virus
ou un traumatisme d’un organe).

Quelques exemples : Il y a certains endroits in vivo où la MEC est majoritaire, par exemple dans les tissus
conjonctifs, on a essentiellement de la MEC et quelques cellules, donc au niveau des nerfs et vaisseaux on
retrouve cette MEC.

Comment mettre de la MEC dans un milieu in vitro ?

On fait des modifications sur le plastique de la boite (sert de support) pour mimer la MEC en augmentant les
surfaces d’adhérences, et en plus on ajoute des molécules biochimiques de la MEC qui jouent le rôle d’un élément
de la MEC ou des équivalents (on met des molécules chimiques qui miment certaines molécules biochimiques).

Majoritairement, ce sont les fibroblastes qui fabriquent la MEC in vivo. Ils sont très dispersés dans le tissu. In
vitro, on met les fibroblastes seuls dans une boite de culture, les uns à côté des autres, on ne retrouve jamais ça
in vivo.

L’influence de différents facteurs sur une même culture de cellules :

Ex des mélanocytes : cultivés dans 2 types de milieux différents :

- Contient TPA (Tumor Promotor Agent) + Sérum

- Contient seulement TPA

On remarque 2 types cellulaires différents et 2 comportements différents.

- La cellule forme comme des filaments qui se touchent par les extrémités
- La cellule est beaucoup plus aplatie, des noyaux beaucoup plus larges, qui ressemble aux fibroblastes

Un milieu permet la différenciation cellulaire et l’autre non.

Pareil pour les kératinocytes, un en présence d’une certaine concentration en calcium, et l’autre en présence
d’une plus forte concentration en calcium qui permet une différenciation cellulaire. On voit qu’on a un aspect
cellulaire totalement distinct.
Donc le support est très important, et les facteurs qu’on rajoute, qui vont modifier les interactions cellule-cellule
et leur état de différenciation jouent aussi un rôle très important.

La morphologie nous permet de qualifier certains types cellulaires : elles se ressemblent énormément mais on les
distingue :

- Cellules endothéliales : cellules bien délimitées, elles occupent un espace défini et constant.
- Fibroblastes : les cellules ont besoin d’une interaction avec quelque chose, donc elles allongent leurs
extrémités pour avoir un contact cellule-cellule. Mais c’est bizarre car in vivo elles ne se touchent jamais,
elles sont libres dans la MEC. Ça veut dire que dans les milieux de culture il leur manque un élément
(sûrement de MEC) pour avoir un comportement identique à ce qu’il se passe in vivo, c’est-à-dire libre au
milieu de la MEC. Elles sont incapables de synthétiser de la fibronectine.

Pour améliorer les interactions avec la MEC, on est capable de rajouter des éléments définis : par exemple on
rajoute du collagène, élément essentiel de la MEC. On fait de la culture 3D : au lieu d’avoir un support sur lequel
les fibroblastes s’ accrochent sur le support plat, elles ont du mal et n’ont pas un comportement identique à ce
qu’il se passe in vivo, on les met en présence de collagène et là on va voir une culture 3D, c’est-à-dire que les
cellules interagissent avec le collagène, ça fait une sorte de gélose, la morphologie ressemble beaucoup plus à ce
que qu’il se passe in vivo, et les fibroblastes ne cherchent pas à interagir entre eux, ils interagissent avec le
collagène. Ces cellules s’orientent, donc il y a une info qui passe via le collagène, grâce à des interactions
collagène-protéine de la membrane des fibroblastes. Ça entraine une modification du cytosquelette du
fibroblaste et orientation du fibroblaste. Du coup les fibroblastes sont maintenant capables de synthétiser de la
fibronectine (contrairement à la 2D). Donc on a une modification morphologique, une modification d’interaction
qui implique une modification de métabolisme.

Donc on retrouve une fonction qu’on avait in vivo par reconstitution d’une culture en 3D. Donc on complexifie de
plus en plus les systèmes de culture pour mimer au mieux ce qui se passe in vivo. Donc maintenant on peut
reconstituer ce qu’on appelle le derme équivalent : on est capable de reproduire la peau dans des boites de pétri.
Et on peut tester ainsi des molécules chimiques sur ces tests in vitro.

Derme normal, naturellement dans l’organisme. A droite derme reconstruit, in vitro. On a la base de collagène qui
contient des fibroblastes, et dessus on met des cellules épithéliales. Et ces cellules épithéliales vont subir une
différenciation dans la boite de culture in vitro.

On met du collagène dans lequel on a des fibroblastes. Dessus on met des cellules épithéliales.

4) Les milieux de culture

Le temps de division des cellules mammifères est environ 20h in vivo.

On ajoute des antibiotiques à ces cultures de cellules de mammifères pour éviter que des bactéries se
développent (elles ont un temps de division courts donc on ne voit plus nos cellules eucaryotes). Mais on les
ajoute seulement s’ils n’ont pas d’effets néfastes sur le test qui nous intéresse.

On met aussi des antifongiques pour les champignons, ils produisent des toxines toxiques pour les cellules
eucaryotes.

III- Les types cellulaires

1) Critères de caractérisation des cellules

Critères :
 - Caryotype : indispensable. Les cellules se multiplient sans cesse in vitro, normalement une cellule a une
durée de vie limitée, ici on les force à se multiplier, donc il y a des erreurs au cours des divisions. Ces
erreurs sont tellement importantes qu’elles peuvent se voir dans le caryotype.
- Potentiel de division : dans l’organisme la cellule sait qu’elle doit faire un certain nb de divisions. Alors
qu’in vitro, soit elles conservent leur capacité à connaitre leur âge (cellules normale), soit elles l’ont
perdu : c’est le premier caractère de malignité (cancérogenèse). Si elle passe le cas de 100 divisions, on
considère que c’est une cellule anormale. La plupart des cellules qu’on a in vitro sont anormales,
immortelles.
- Paramètres de différenciation : on doit connaitre l’identité de la cellule, on sait d’où elle vient en termes
de tissus. Ces paramètres sont caractérisables par des marqueurs retrouvés au niveau de la membrane
plasmique au cours des différenciations. On peut déterminer le paramètre de différenciation cellulaire en
suivant des marqueurs plus fins sur la membrane plasmique.
- Dépendance d’ancrage : on doit dire si nos cellules nécessitent un support pour se diviser. Si on est dans
le cas de tumeur, elles deviennent autonome, elles se moquent de l’environnement, pas de dépendance
d’ancrage, elle se moque des facteurs de différenciation.
- Inhibition par contact cellulaire : dans l’organisme, si on se coupe, le trou se rebouche, les cellules se
multiplient et s’arrêtent quand c’est rebouché, on n’a pas d’excroissance. In vitro, dans les boites de
culture : arrêt de croissance par contact cellulaire. Mais si la cellule a perdu certains paramètres de
normalité, cellule cancéreuse, elle est capable de se multiplier et d’échapper à l’inhibition de contact.
- Malignité : c’est le niveau terminal de cancérogenèse. Elle n’a pas besoin de facteurs particuliers présents
dans l’organe. On injecte dans l’abdomen de souris « nude » des cellules cancéreuses, ça développe une
tumeur. On peut suivre le développement ou la perte de tumeur au sein d’une souris.

On doit qualifier les cellules par ces paramètres-là.

Plus une cellule est cancéreuse, plus elle est autonome. Donc indépendante d’environnement, donc plus elle est
facile à cultiver. Donc beaucoup des cellules qu’on utilise pour faire des tests sont des cellules cancéreuses. Sauf si
on étudie un phénomène sur des cellules normales, dans ce cas on utilise des cellules normales.

Une cellule normale est sensible à l’environnement via tous les facteurs (paracrines et endocrines) produits par
les cellules voisines, apportées par le sérum par les organes différents. Ce sont des paramètres indispensables
pour la vie de la cellule normale aussi bien in vitro que in vivo : MEC, cellules voisines, facteurs de l’env. Les
devenirs de cette cellule sont :

- la prolifération
- la quiescence (absence de prolifération) G0 : arrête sa prolifération et attend ou rentre en différenciation
cellulaire. Existe pour de nombreuses cellules dans notre organisme. Pleins de cellules qui se régénèrent
continuellement au cours de la vie, il y a des cellules qui sont en train de se différencier : ex : les cellules de la
peau se renouvellent toutes les 3 semaines
- sénescence : vieillesse normale, elle met beaucoup de temps à se diviser, avant d’entrer en apoptose
- mort cellulaire : elles ont une durée de vie limitée, ou parce qu’elles ont une agression (par un agent
extérieur) ou parce qu’elles vont être dégradées malencontreusement par une autre cellule de l’organisme

Donc la cellule a pas mal de possibilités, des choix inhérents à elle-même.

Par contre la cellule tumorale de haute malignité devient indépendante. Le premier paramètre qui arrive, c’est la
non connaissance de son âge (insensibilité à l’apoptose), puis les autres paramètres sont indépendants. Elle n’est
plus sensible à l’environnement, elle n’établit plus de contacts avec les cellules voisines, elle modifie ses protéines
membranaires pour ne plus établir ces contacts et se détache de la MEC, et elle est capable de migration. Elle
devient complètement autonome et égoïste.
Elle n’aura pas les mêmes devenirs : elle résiste à l’apoptose, elle n’est plus capable de s’autodétruire, devient
insensible aux signaux anti-prolifératifs (car elle a éliminé les récepteurs qui lui permettraient de recevoir ces
signaux), devient indépendante vis-à-vis des facteurs de prolifération, c’est-à-dire qu’elle n’a pas besoin de
signaux pour lui dire de se diviser, elle stimule sa multiplication de façon autonome. C’est presque comme un
organisme unicellulaire au sein d’un organisme multicellulaire.

Evènements de la tumorogenèse du point de vue comportement cellulaire :

Un cancérogène altère une cellule et cette altération n’est pas corrigée.

- prolifération cellulaire : la cellule se multiplie et envahit son tissu d’origine : hyperplasie

- elle va dans les tissus voisins : carcinome in situ
- et ensuite elle provoque des métastases (dysplasie)
- et induit une perturbation de tous les organes  mort de l’individu

2) Classification cellulaire (selon l’origine)

On distingue deux grands types de cellules :

Pas d’interaction avec un support = Pas de
morphologie (forme ronde).
Sang, moelle osseuse, liquides
physiologiques
Type lymphoblaste : cellules en
suspension, arrondies, même si elles
s’agrègent, elles restent rondes, elles
n’interagissent pas
Cas des cellules extraites à partir de tissus ou d’organes
Cellules collées, planes, ont des interactions cellule-cellule fortes. Si
on décolle les cellules par une enzyme qui coupe les molécules
adhérentes, on retrouve la morphologie des cellules circulantes.
Elles peuvent être de type épithélial ou fibroblaste :
- Type épithélial : attachées au support, plates, polygonales
- Type fibroblaste : cellules attachées au support, allongées et
bipolaires, et ont des contacts par leurs extrémités uniquement, les
prolongements cellulaires se connectent

(L’ATCC est une bibliothèque où on achète des cellules : elle contient une collection de différents types cellulaires.)

3) Les cellules souches

Les cellules souches perdent leur potentiel de différenciation en fonction de l’âge de l’individu.

- Au départ on a l’œuf fécondé, et ses cellules souches qu’on trouve juste avant le trophoblaste (stade 4
cellules), elles sont totipotentes, c’est-à-dire que n’importe quelle cellule de ce stade peut donner
n’importe quel type cellulaire différencié.
- Puis elles sont pluripotentes : ce sont les cellules qu’on retrouve dans le trophoblaste, en nombre plus
important (quelques centaines). Ce sont des cellules souches embryonnaires (c’est sur ces cellules qu’on
fait de la thérapie génique), elles ont un gros potentiel de différenciation, mais elles en ont perdu un peu,
elles ont acquis certaines propriétés de différenciation par rapport à l’œuf fécondé
- Puis l’embryon se développe et on a des cellules multipotentes : ce sont des cellules mésenchymateuses
peuvent se différencier dans plusieurs types mais pas dans tout : os, cartilage, fibroblastes. Elles ont un
potentiel de différenciation multiple mais pas sur toutes les lignées possibles
- Enfin on a la cellule différenciée, elle a acquis des fonctions particulières, produit des protéines
particulières, et elle a un potentiel de division finie, elle ne se multipliera que très peu.

A l’âge adulte, au niveau de l’intestin, on continue à produire des cellules de l’intestin, pareil au niveau de la peau
donc il faut des cellules souches à l’âge adulte aussi. Ce sont des cellules souches qui sont quand même engagées
dans une voie de différenciation.

Aujourd’hui, in vitro, on sait faire une dédifférenciation : on part de la multipotente, pour arriver à la totipotente.
On distingue les cellules multipotentes des unipotentes :

- cellule multipotente : spécialisée dans un genre tissulaire

- cellule unipotente : spécialisée dans un type tissulaire

Une cellule souche est capable de s’auto-reproduire (redonner une cellule souche), elle est capable de conserver
le nombre total de cellules souches dans un tissu donné.

Et elle est aussi capable de développer une cellule spécialisée. Donc quand une cellule souche se divise, elle
donne une cellule souche et une cellule spécialisée.

Le produit d’une division de cellule souche donne au moins naissance à une autre cellule souche ayant les mm
capacités que la cellule dont elle est issue.

Alors que la cellule précurseur ou progénitrice induit une différenciation obligatoire des cellules filles. On aura
que des cellules spécialisées qui vont être produites lors de la division. Au cours de la vie de l’organisme elles vont
être utilisées, mais au bout d’un moment on en a plus, ce qui participe au vieillissement.

Ce qu’on a in vitro, ce sont des cellules souches soit d’adulte, soit fœtales :

- Cellules souches fœtales : quand on les laisse dans la boite de pétri, elles peuvent rester à l’état indifférencié
avec un potentiel de division infini. Mais elles ne sont pas forcément identiques à ce qu’on a in vivo
puisqu’elles sont passées par la boite de pétri, donc elles ont subi des modifications sans qu’on sache
lesquelles
- Cellules souches tissulaires d’adultes : elles sont en quantité très faible dans notre organisme, donc il est
difficile de les prélever. Et elles ont une culture difficile car elles requièrent un certain nombre de facteurs de
différenciation et de prolifération pour rester telles quelles, pour pas être engagée dans une voie de
différenciation. Quand on est in vitro, on perd ces paramètres car il manque des infos dans la boite de pétri,
donc elles se différencient.
- Et on a les cellules souches pluripotentes qu’on retrouve dans les trophoblastes (embryons d’animaux)

Grace à ces études, on peut faire des greffes de peau sans problème, on récupère les cellules souches de la peau
par des astuces de culture, et on peut cultiver in vitro, ré-induire une différenciation de ces cellules souches de
peau, et reconstituer la peau en boite de pétri. Et après on remet la peau sur le patient. Etapes :

- Prélèvement de peau dans une zone saine

- Isolement et production des cellules souches de la peau
- Réimplantation d’une couche de peau

De nombreuses études sont faites sur des cellules souches pluripotentes pour les ramener vers les états
totipotents pour faire du clonage thérapeutique ou reproductif. Chez l’homme, le thérapeutique est autorisé mais
pas le reproductif.

La voie actuelle privilégiée c’est de prendre des cellules qui sont engagées dans une voie de différenciation, pas
complètement différenciées, on les dédifférencie in vitro et on les réengage dans une autre voie de
différenciation in vitro, et on les réimplante dans l’individu.

IV- Types de culture de cellules

1) Culture finie : culture primaire / secondaire
a. La culture primaire

Se fait à partir d’un explant. C’est très proche de ce qui se passe in vivo. Très intéressante pour de nombreuses
études mais très difficile à conserver car quand on ensemence, elles se multiplient, et rapidement on arrive à
confluence : donc on doit diluer : prendre des cellules et les mettre dans une autre boite : et là ce n’est plus de la
culture primaire mais de la culture secondaire.

La culture primaire est très courte et difficile à obtenir.

b. La culture secondaire

C’est sur des cellules en culture secondaire qu’on travaille en général. Dès qu’elles arrivent à confluence, on fait
un nouveau passage. Et après on donne un âge à la culture : passage 1, passage 2, passage 3. Ce nombre de
passages reflète le nb de divisions : le nb de divisions à chaque passage dépend du taux d’ensemencement qu’on
fait.

Comme on est chez des eucaryotes, de l’organisme pluricellulaire, une cellule toute seule ne peut pas se
multiplier, elle a besoin de contacts cellulaires, de facteurs de croissance produits par les cellules voisines. Donc il
faut une densité cellulaire assez importante, donc on fait des dilutions de 1/3 : donc un passage = 3 divisions. (par
ex : si on a une cellule de passage 7 : une vingtaine de divisions). Durée de vie moyenne d’une cellule est de 30
passages (= une centaine de divisions).

On est obligé de noter le nb de passages sur la boite de culture, ça nous donne une indication parce que la
culture in vitro se rapproche de ce qui se passe in vivo mais c’est différent. Et plus on avance dans les passages,
plus on a des différences par rapport aux cellules de départ : pas les mêmes caractéristiques biochimiques qu’au
départ, elles n’expriment pas les mêmes protéines.

Ces cultures sont dites des cultures finies dans le sens où elles ont un nb de passages limité (30 divisions : mort
cellulaire par apoptose). Ces cultures proviennent de tissus normaux.

2) Cultures continues

On a dans nos étuves qui datent des années 60 : elles sont devenues anormales, immortelles : elles sont à durée
de vie infinie.

Ces cellules qui ont des propriétés d’immortalité sont soit :

- Immortalité innée : Cellules souches que l’on a dans l’organisme. Dans la moelle, on a des cellules souches qui
peuvent se différencier en toute sorte de cellules. Elles ont une aptitude à se diviser à l’infini car elles n’ont pas
acquis cette horloge biologique. Au cours des différenciations ce paramètre d’horloge biologique est retrouvé
dans les cellules différenciées.
- Immortalité acquise : Cellules transformées ; c’était des cellules qui étaient mortelles et sont redevenues à
l’état de cellules souches : ce sont des cellules tumorales. Comment on a fait pour en avoir dans les boites de
pétri ? 2 possibilités : soit :
o Cultures primaires puis secondaires à partir d’explants de tissu cancéreux. Donc forcément émergent des
cellules cancéreuses qui in vivo, chez l’individu, avaient acquis cette perte de contrôle d’horloge
biologique.
o Ou alors on a pris des cellules normales (à durée de vie limitée) et on les a transformées par un agent :
soit agent chimique ou physique pour muter l’ADN (mutations de type oncogène = qui induisent un
phénomène tumoral) ou alors on les infecte par un rétrovirus oncogène qui induit une transformation
cellulaire.

On sait transformer des cellules, on peut s’en servir comme outil. De nombreuses études sont faites sur des
cellules transformées bien qu’elles soient un peu différentes des cellules normales (perdu certaines propriétés
biologiques de la cellule normale), parce que c’est beaucoup plus facile à cultiver.

En général, on travaille sur des cultures continues, qu’on appelle aussi « lignées ». Et ensuite quand on a bien
débroussaillé, on va valider certaines hypothèses sur des cultures primaires.
Si on prend un explant et on le met en culture, on a un phénomène de latence qui dépend du type cellulaire, des
conditions de culture et de la densité cellulaire. Plus on met de cellules plus on a de chances que ce temps de
latence soit court et inversement. Ensuite on a une division cellulaire optimale, donc là on peut avoir de la mort
cellulaire, certaines cellules ne vont pas se diviser. Ensuite les cellules qui peuvent se diviser dans ces conditions in
vitro vont se multiplier : multiplication maximale. Puis on arrive à une phase stationnaire de division (plateau) :
qui peut résulter de différents paramètres : épuisement du milieu ou encombrement de la boîte : quiescence
(arrêt de division) par contact cellulaire. Parmi cette population, si on la réensemence, on peut renouveler cette
phase de croissance, et à un moment donné, si ce sont des cellules à durée de vie limitée (culture définie), on va
avoir le phénomène de mort cellulaire.

NB : le phénomène de mort cellulaire existe aussi chez les procaryotes (un peu).

La culture cellulaire est :

- Coûteuse
- Complexe
- Facilement contaminable donc nécessite des conditions strictes d’asepsie
- Faible rendement en produit
- Produit à haute valeur ajoutée puisque ça nécessite une manipulation couteuse et astreignante.

Donc la culture cellulaire est utilisée que dans des cas particuliers, quand on ne peut pas faire autrement. Et on
essaie d’optimiser les conditions de culture pour avoir des densités cellulaires importantes et avoir une
production efficace. Pour optimiser, on utilise des microporteurs : on utilise des boites ou flacons, dans lesquelles
on met des microbilles sur lesquelles s’accrochent les cellules (on agite). Des études sont faites pour
l’optimisation de ces cultures.

V- Culture cellulaire et pharmaceutique

De nombreux médicaments sont produits sur des cellules de mammifères en culture parce qu’on a besoin de
modifications post-traductionnelles.

Ex de protéines produites en culture cellulaire : EPO, hormones de croissance (TGF par exemple), produits qui
stimulent l’ovulation, cytokines, agents coagulants ou anticoagulants, vaccins.

On peut utiliser des virus comme vecteur : la thérapie génique consiste à traiter une maladie par transfert de
matériel génétique, via un virus.

VI- Problèmes (contaminations)

Contaminants biologiques : bactéries, levures et moisissures, virus, mycoplasmes

Contaminants chimiques : endotoxines, qualité du plastique, reste de détergent sur le verre, trace d’aluminium,
résidus désinfectants.

Contamination croisée : contamination par les autres cellules. On ne met jamais deux cultures d’origine différente
sous une hotte.