Université Hassiba Benbouali de Chlef | SNV | Département de Biologie

Module : Techniques d’analyses Biochimiques et Moléculaire M2

Chapitre 1: LA CHROMATOGRAPHIE
Présenté par : Dr. MEDJAOUI. I 2020/2021
Plan du cours

I. La chromatographie
1. Définition
2. Historique
3. Principe

II. Les différents types de chromatographies

▪ Chromatographies de surface

▪ Chromatographies sur colonne

III. Les paramètres d’une chromatographie sur colonne

IV. Le choix de la méthode chromatographique

 I. La chromatographie

1. Définition

La chromatographie est une méthode physico-chimique qui permet de séparer les composants d’un mélange à analyser

grâce à leur migration différentielle le long d'un dispositif séparateur.

Ce dispositif est composé d’une phase mobile et d’une phase stationnaire.

Domaines d’application : (Biochimie; pharmacie; industries chimiques, agro-alimentaires…)

Avantage:

Séparation, identification et quantification de très faibles quantités de produits (≈ ng)

 I. La chromatographie

2. Historique Il utilisa la chromatographie sur colonne avec du

carbonate de calcium pulvérulent comme

adsorbant et un mélange d‘éther de pétrole (un

mélange d’alcane) comme éluant pour séparer

Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872- la chlorophylle et les caroténoïdes.

1919) fut, en 1906, le premier à employer

*carbonate de calcium : phase stationnaire
le terme chromatographie. *L’éthanol : phase liquide
I. La chromatographie

Illustration détaillée de l’expérience réalisé par Mikhail

Tswett pour séparer les pigments d’épinard
 I. La chromatographie

3. Principe

Le principe repose sur l’équilibre de concentrations des composés présents (solutés) entre deux phases en contact : la

phase stationnaire et la phase mobile qui se déplace. La séparation est basée sur l’entrainement différentiel des

constituants du mélange. Ces derniers parcourent la phase stationnaire avec des temps proportionnels à leurs propriétés

intrinsèques (taille, structure,…) ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité,…).

K est égal au rapport des concentrations du soluté A dans les deux phases
 II. Les différents types de chromatographie

Les méthodes chromatographiques sont classées selon le dispositif séparateur utilisé (phase

stationnaire/mobile) et les paramètres physico-chimiques intervenants :

Phase mobile: chromatographies (liquide ou gazeuse)

Phase stationnaire : - chromatographies de surface ( sur papier, sur couche mince (CCM))
- chromatographies sur colonne

paramètres physico-chimiques : chromatographies (d’adsorption; de partage; d’exclusion, échangeuse d’ion; d’affinité).

 II. Les différents types de chromatographie

CHROMATOGRAPHIE

En phase gazeuse En phase liquide

sur colonne de surface

sur papier sur couche mince

(CCM)

d’adsorption de partage échangeuse d’exclusion d’affinité

d’ion
 chromatographies de surface

➢ La chromatographie sur papier ➢ La chromatographie sur couche mince (CCM)

Repose sur les phénomènes de partage (solubilité des molécules). Repose principalement sur des phénomènes d'adsorption (polarité
Phase mobile : solvant + eau des molécules).
La phase stationnaire (liquide) : papier filtre Whatman ou papier La phase stationnaire (solide) : une couche mince de matériel
cellulosique imprégné l’eau de la phase mobile adsorbant (gel de silice, oxyde d'aluminium ou de
Inconvénients : la cellulose) fixée sur une plaque en verre ou aluminium; et une
- La séparation demande beaucoup de temps (++heures) et moins phase mobile (solvants).
bonne que la CCM.
 Les chromatographies de surface

Révélation de l’endroit où se trouvent les produits séparés :

1. les produits sont visible car il sont de nature colorés

2. les produits qui sont fluorescents, on peut les identifier sous une

lampe ultraviolette.

3. l’utilisation d’un révélateur qui réagira chimiquement avec les produits (en les

détruisant) et dont le résultat sera coloré (ex: la ninhydrine pour les acides

aminées).
Image d’un chromatogramme
(révélation des acides amines par pulvérisation de
la ninhydrine)
 Les chromatographies de surface

Identification des molécules séparées :

Les substances peuvent être identifiées en calculant la valeur du rapport frontal

(Rf) qui peut être comparée à celles des substances déjà connues se trouvant

dans les tables.

Rf = h/H
h : distance parcourue par l’échantillon
H : distance entre la ligne de dépôt et le front de l’éluant
Les chromatographies sur colonne

Principe générale de la chromatographie sur colonne

 Les chromatographies sur colonne

Les chromatographies d’adsorption

➢C’est une chromatographie liquide-solide.

➢Basée sur le principe de polarité (Séparation grâce à des liaisons faibles entre les molécules et les 2 phases)

➢la vitesse de déplacement des solutés dépend de la force de rétention par adsorption (phase fixe) et une force

d’entraînement par la phase mobile.

➢Adsorbants possibles (du moins polaire au plus polaire): Papier, cellulose, amidon, carbonate de sodium, gel de silice,

alumine, charbon activé.

Application
Séparation des molécules organiques de MM inférieure à 1000 g/mol
 Les chromatographies sur colonne

La chromatographie de partage:

➢C’est une chromatographie liquide-liquide.

➢La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte (ex. : de l’eau sur la cellulose d’un papier).

Séparation selon la solubilité des molécules entre les 2 phases (Les espèces les plus solubles dans la phase mobile se

déplacent plus que les autres ; les plus solubles dans la phase stationnaire y sont davantage retenues et migrent moins).

Application

Séparation des molécules organiques de MM inférieure à 1000 g/mol

 Les chromatographies sur colonne

La chromatographie sur échangeurs d’ions:

Le mécanisme de séparation se base sur les liaison ioniques entres la phase stationnaire qui porte des groupements

fonctionnels chargés et solutés.

• Résine échangeuse de cations : est une résine chargée négativement (R-), accroche les molécules de charge (+)

•Résine échangeuse d’anions : est une résine chargée positivement (R+), accroche les molécules de charge (-)

Application
Séparation des molécules chargées (ex: acides aminés, protéines)
 Les chromatographies sur colonne

Tout dépend du pH du tampon et du pI des molécules à séparer!

Le point isoélectrique (pI) d'une protéine est le pH auquel la protéine a une charge globale nette égale à zéro.

A un pH supérieur au pI, une protéine aura une charge nette négative.

Un pH inférieur au pI rend la protéines chargée positivent (assez de H+).

Ainsi, le pH du solvant peut être ajusté afin de faciliter la liaison des protéines aux résines échangeuses d'ions ou de

promouvoir leur élution une fois liées.

La connaissance préalable du point isoélectrique d'une protéine peut aider à déterminer le type de chromatographie

échangeuse d'ions le plus approprié.

 (Ph << Phi)

aa chrgé +
aa non chargé
aa fortement chargé -

Chromatographie sur échangeurs d’ions

Cliquez ici https://www.youtube.com/watch?v=eZz-TrtqdCA

 Les chromatographies sur colonne

La chromatographie d’exclusion:

➢La phase stationnaire est un solide (granule de gel poreux )

➢Séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme :

• Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont

exclues et sont donc éluées les premières,

• Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses

dans le gel, leur migration est freinée.

➢Les solutés sont donc élués dans l’ordre inverse des masses moléculaires.

Application

Séparation de molécules de même forme et de taille variable (protéines globulaires).

 Les chromatographies sur colonne

La chromatographie d’affinité:

La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente

une affinité biologie (bio-affinité) pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur,

antigène-anticorps).

Application

Séparation de protéines ou ligands

 III. Les paramètres d’une chromatographie sur colonne

1. Le chromatogramme
Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps d’un paramètre relié à la concentration
instantanée du soluté en sortie de colonne:
➢ Le temps (ou le volume d’élution) est porté en abscisse et l’intensité du signal de détection en ordonnée.
➢ La ligne de base correspond au tracé obtenu en l’absence de composé élué.
➢ La séparation est complète quand le chromatogramme présente autant de pics chromatographiques revenant à la ligne
de base qu’il y a de composés dans le mélange à analyser.
 III. Les paramètres d’une chromatographie sur colonne

2. Notion de temps

- Temps mort tm (t0)

Le temps que met la phase mobile pour traverser la colonne
- Temps de rétention tr
Temps mis par les molécules d'un composé à analyser (soluté) pour parcourir le trajet entre l'entrée et la sortie de la colonne
Le temps de rétention, est caractéristique du constituant, pour des conditions d'analyse données.
La surface d'un pic est fonction de la quantité de constituant dont il est la trace.
Aucun soluté ne peut sortir avant le temps t0, temps qui correspond au transport dans la phase mobile.
-Temps de rétention réduit t‘
La différence entre le temps de rétention et le temps mort est désignée par le temps de rétention réduit
représente le temps passé dans la phase stationnaire
t’r = tr - t0
 IV. Le choix de la méthode chromatographique

Les différentes techniques sont complémentaires plutôt que concurrentes.

Le choix de l’une ou l’autre dépend :

- de la nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide, macromolécule, espèce organique,

polaire, ionique,…

- du but de l’analyse : identification de composants d’un mélange, nécessité ou non de “coupler” la

chromatographie avec une méthode spectroscopique ou avec la spectrométrie de masse (CPG/SM ou

GC/MS), contrôle de pureté, purification de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction en continu pour

optimiser des paramètres, dosages (quantification)…