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Cours n°06:
2
DÉFINITION
chimique, qui sépare des constituants présents dans des mélanges variés par
Types
Ascendante : La phase mobile disposée à la base ; Monte par capillarité.
Descendante :La phase mobile disposée près du sommet dans une augette ;
S’écoule progressivement du haut en bas.
Terminologie :
La ligne supérieure d’imbibition du papier : front
Le passage du solvant à travers le papier : développement du chromatogramme
(dure de 15 à 25 heures selon la nature du solvant et la taille des feuilles) ;
Conditions :
Température thermostatée aux alentours de 20°C ;
Diamètre de la tâche de l’échantillon déposée doit être un cercle aussi régulier que
possible (ou une ligne horizontale linéaire lorsqu’on dépose un volume important) ;
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
b. Bi-dimensionnelle :
o L’échantillon est déposé dans un angle de la feuille ;
o La feuille est mise en contact d’un premier solvant qui fait migrer les
composants de l’échantillon dans le sens vertical ;
o Le chromatogramme obtenu est séché ; Il est tourné de 90° ;
o Et il est soumis à un deuxième solvant : les tâches obtenues dans le premier
chromatogramme vont être mise en contact avec ce 2e solvant (comme une
ligne de dépôt) ;
o Le développement permet une séparation sur une 2e dimension.
Avantages de la ch. Bidimensionnelle :
Permet d’obtenir beaucoup plus de tâches que la monodimensionnelle : elle est beaucoup plus sélective.
Inconvénients de la ch. Bidimensionnelle :
Difficile à interpréter (absence de témoins) ;
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
Chromatographie
bidimentionnelle
Chromatographie
unidimentionnelle
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
Révélation :
Pulvériser un réactif convenable qui fait apparaitre les substances cherchées sous
forme de tâches colorées ou fluorescentes.
Si les tâches sont colorées, on examine le papier par Trans-illumination pour les
voir.
a. Réactifs révélateurs :
Ninhydrine pour les acides aminés ; Aniline pour les oses ;
Le vert de bromocrésol (indicateur de pH) pour les acides organiques (apparaissent
comme des tâches jaunes).
b. Interpréter le chromatogramme :
Comparer les caractéristiques du déplacement des substances séparées
(correspondant aux tâches révélées) par rapport à celles d’un témoin de même
nature.
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
solvant).
Identification de la substance a :
Comparer Rfa (qui est le rapport frontale de cette substance a) au Rf d’un témoin
connu dans 3 chromatogrammes obtenus avec 3 systèmes de solvants différents.
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
Applications :
La chromatographie sur papier permet de séparer efficacement avec un
équipement rudimentaire, des petites molécules (exemples : acides aminés,
oligopeptides, nucléotides, les oligonucléotides…) en fonction de leurs solubilités
.
Vérifier la pureté des produits ..
Papier Whatman
Composants :
Elle diffère de la
chromatographie sur papier par le fait
que le papier est substitué par une
plaque sur laquelle se fixe la couche de
phase stationnaire.
La phase stationnaire est
appelée : adsorbant ou couche
adsorbante (peut être un gel, un
échangeur d’ion, de la cellulose…)
Elle se fixe sur une plaque de
verre, de plastique…(le support)
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
Principe :
La séparation des différents composés repose sur la différence d’affinité de ces
composés l’égard des deux phase (stationnaire et mobile)
Composés analysés
Migration
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
Procédés de révélation :
On peut révéler les tâches directement, sans élution, par fluorimétrie
On peut localiser les tâches par leur couleur ou leur fluorescence, sous la lampe
de Wood ;
On peut les gratter avec une spatule, obtenir une poudre, l’agiter dans un
solvant convenable et les analyser par fluorimétrie, spectrophotométrie
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
3/CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE EN PHASE LIQUIDE(Ch.Liquide-liquide)
Support :
Cylindre (colonne) en verre, en
plastique, ou en métal placé
Conseil! Avant de procéder a la chromatographie sur colonne, il faut faire les chromatographies
préparatoires sur couche mince afin de choisir un éluant adapté.
Aussi après recupération des fractions issues de chromatographie sur colonne on doit leurs subir une CCM
pour séparer les composés
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
Détection des substances séparées :
Séparer les molécules constitue la 1e étape de la chromatographie ;
Une fois que l’éluant (le liquide qui sort au bas de la colonne) est récupéré, on
passe à la 2e étape : la détection des substances séparées ;
Ce sont des ions énormes, insolubles. Des ions plus petits, de signe
opposé, viennent se fixer sur eux et qui peuvent être échangé avec l’éluant.
o Naturels (zéolithes),
Les grosses molécules ne peuvent pas entrer dans les billes par les pores. Elles sont
exclues du volume du solvant qui se trouve à l’intérieur des billes.
Elles traversent la colonne rapidement avec un volume d’éluant plus réduit par
rapport aux molécules de petites tailles. Limite d’exclusion du gel : la masse
moléculaire des plus petites molécules incapables de pénétrer dans les pores des
billes d’un gel
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
La forme des molécules :
Les molécules allongées ont moins de chance de pénétrer par rapport aux
molécules de formes sphériques de même masse moléculaire.
Les molécules ayant des masses moléculaires au-dessous de la limite d’exclusion
seront éluées du gel dans l’ordre de leur masse moléculaires : les plus grandes
éluées en premier.
Estimation des masses moléculaires :
Notion de volume d’élution relatif : rapport(Ve/ V0 )
Ve : volume d’élution d’un soluté donné
V0 : Volume mort d’une colonne. Le volume d’élution d’un soluté dont la masse
moléculaire est supérieure à la limite d’exclusion.
On peut déterminer la masse moléculaire (MM) d’une substance inconnue sur une
courbe : logMM = f(Ve/ V0 ) à partir de sa position par rapport à d’autres
substances de MM connues ayant subi une chromatographie dans les mêmes
conditions (même gel, même colonne…)
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
Exemple: Le ligand peut être un anticorps ayant une affinité pour un antigène = molécule d’intérêt
substrat-enzyme; métal-métalloprotéine; sucre-lectine; hormone-recepteur
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
La molécule d’intérêt va être adsorbée par le ligand présent/fixé sur la
résine. Lorsqu’on met en présence un mélange contenant la molécule d’intérêt
et la résine munie du ligand, dans des conditions favorables à la liaison «
ligand – molécule d’intérêt », les autres molécules du mélange (n’ayant pas une
affinité pour le ligand) ne se fixeront pas et vont être éluées par un éluant et
seront éliminées .Les molécules d’intérêt restent fixées après cette élution.
On procède, ensuite, à la désorption de ces molécules d’intérêt en exposant le
complexe « ligand – molécule d’intérêt » à des conditions qui rendent cette
liaison moins stable :
Par modification de la composition de l’éluant (solvant de désorption);
Par ajout d’un ligand compétiteur
Les molécules se détacheront de la résine par élution dans le solvant de désorption et, après leur
récupération, elles peuvent être dosées.
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
o Applications :
Isolement d’enzymes :
Isolement de glycoprotéines :
Isolement de lectines :
Isolement de protéines kinases :
Isolement de protéines déshydrogénases :
Isolement d’acides nucéiques :ARNm
TYPES DE CHROMATOGRAPHIES
La résine à laquelle le ligand est couplé ne doit pas avoir d’affinité à la molécule
d’intérêt.
Le couplage ne doit pas dénaturer le ligand (ce dernier doit garder son affinité)
Le couplage se fait sur un gel (coupling gel)
En batch
• Réunir le gel (résine + ligand) et l’échantillon contenant la molécule d’intérêt
dans un bécher ;
• Les brasser ensemble avec un agitateur magnétique durant un certain temps
jusqu’à adsorption complète de la molécule d’intérêt ;