Cours de Chromato Master 1

Chimie Analytique II
PARTIE B: METHODES DE SEPARATION CHROMATOGRAPHIE
CHAPITRE I: Techniques d'analyse chromatographiques
La chromatographie est une technique de séparation des constituants d’un mélange le

long d’un dispositif de séparation, elle présente plusieurs variantes classées dans deux grandes
familles.
- Dans l’une, le mélange à analyser est traité en phase gazeuse (donc après vaporisation
éventuelle), véhiculé par un gaz.
- Dans l’autre, le mélange à analyser est traité en phase liquide, véhiculé par un liquide.
I. chromatographie en phase liquide:
I.1. La chromatographie sur colonne (C P L) :

Le substrat actif est tassé dans un tube. Il s’agit ou bien d’un adsorbant (chromatographie
liquide solide: CLS) ou bien d’un substrat agissant par partage (chromatographie CLL).
Dans les deux cas, le véhicule porteur ; un liquide, peut être soit à la pression ordinaire,
soit soumis à une pression pouvant atteindre plusieurs centaines de bars. Dans ce cas, la
chromatographie est appelée chromatographie en phase liquide à haute pression où à haute
performance (CLHP).
 Si le substrat introduit dans la colonne est un échangeur d’ions, on opère par
chromatographie par échange d’ions :
 Si le substrat est un gel, on peut obtenir des séparations de constituants de degrés de

polymérisation différents dans un polymère : c’est la chromatographie sur gel perméable ou
chromatographie d’exclusion stérique sur gel.
I.2. Chromatographie mono dimensionnelle sur papier
Pour ce type de chromatographie, le support est simplement une bande ou feuille de

papier filtre. L’échantillon à analyser y est déposé à l‘aide d’un capillaire. Les échantillons sont
déposés sous forme de taches sur une ligne tracée au crayon à environ 5 cm du bord du papier. Le
Laila IDRISSI Page 58

papier est alors placé verticalement dans une cuve hermétique contenant le solvant. Il faut veiller à
ce que la tache reste en dehors de la zone d’immersion dans le solvant. Celui-ci se déplace par
capillarité entraînant à sa suite les différents constituants du mélange à analyser. Ceux-ci migrant
plus ou moins vite, selon leur coefficient de partage.
Quand le front du solvant a presque atteint l’extrémité opposée du papier, on arrête

l’opération. On repère le front de solvant à l’aide d’un trait de crayon, ainsi que l’emplacement des
taches ou zones correspondantes aux différents constituants. On peut éventuellement découper les
taches et recueillir les produits séparés.
Le RF : représente le rapport entre la distance parcourue par un constituant du mélange,

et la distance parcourue par le front du solvant.
RF = di / do
di = distance parcourue par la substance i
do = distance parcourue par le solvant
Le RF est une constante physique pour chaque constituant, mais elle n’a de valeur que si toutes les
conditions d’essais et surtout la nature du solvant sont mentionnées.
I.3. Chromatographie bidimensionnelle sur papier.
On travaille dans ce cas sur une feuille de papier, ne disposant qu’une seule tache dans un
coin du papier. On a repère alors une première chromatographie comme décrit ci- dessus On laisse
sécher le papier, et après l’avoir tourné de 90°, on opère une deuxième chromatographie avec
d’autres solvants. On peut obtenir ainsi une séparation plus poussée des différents constituants.
I.4. La chromatographie en couche mince ou chromatophore :
C’est une chromatographie récente ; on recouvre une plaque de verre, de matière

plastique ou d’aluminium d’un absorbant (Chromatographie d’adsorption) ou d’une phase inerte
imbibée d’une phase liquide stationnaire (chromatographie de partage).
Cette phase solide est généralement mélangée à un plâtre qui le fait adhérer au verre. Pour
le reste, la chromatographie se fait comme sur une bande de papier.

II. chromatographie en phase gazeuse :
Le substrat est toujours contenu dans un tube ou colonne (colonnes classiques et colonnes
capillaires). Là encore, c’est un adsorbant (chromatographie gaz-solide : CGS) ou un support
inerte imprégné d’un liquide lourd stationnaire (chromatographie gaz–liquide: CGL). Quand le
mélange à analyser est liquide, il est généralement introduit sous cette forme dans l’appareil,
conçu pour le vaporiser instantanément. Le véhicule est toujours un gaz, dont la pression d’entrée
peut être choisie, éventuellement programmée, de même que la température à laquelle est portée la
colonne, elle peut être maintenue constante ou au contraire programmée.

CHAPITRE I: Chromatographie en phase gazeuse
I-Généralités :
L’échantillon à analyser (gaz ou liquide aisément vaporisable) est introduit, en un temps
aussi court que possible, dans une chambre d’injection chauffée à une température de 200-300°C.
Il est ensuite entraîné par un gaz inerte (éluant, appelé gaz vecteur ou gaz porteur) qui parcourt
une colonne à un débit parfaitement réglé. Le gaz porteur est choisi de telle manière qu’il n’ait
aucune interaction avec la phase stationnaire : azote, hélium ou hydrogène.
La phase stationnaire peut être constituée, soit par un solide adsorbant (silice, alumine,
tamis moléculaire, charbon, cellulose…), soit par un support rigide (chromosorb,…) recouvert par
une fine couche de liquide (silicone, carbowax, ….). Dans le premier cas, la séparation est basée
sur la valeur des coefficients d’adsorption (chromatographie solide–gaz) et dans le second cas sur
la valeur des coefficients de partage chromatographie liquide–gaz : GLC).
Les différents constituants du mélange, ainsi entraînés par le gaz porteur le long de la
colonne, sont retenus de manière différentielle par la phase stationnaire. En fin de colonne, les
composants séparés pénètrent tour à tour dans un détecteur relié à un enregistreur. Les signaux
transmis par le détecteur sont représentés par une série de pics sur le papier de l’enregistreur : c’est
le chromatogramme.
Les éléments essentiels d’un chromatographe en phase gazeuse sont repris dans les (figues
1).

Figure 1: Éléments essentiels d'un chromatographe gazeux
Il existe plusieurs détecteurs pour la chromatographie en phase gazeuse, les plus répandus sont : le
détecteur à ionisation de flamme, le catharométre et le détecteur à capture électronique.
II. Les détecteurs en chromatographie gazeuse

II.1. Cellule de conductivité thermique ou catharométre :
Le gaz de comparaison et le gaz à étudier passent dans deux cellules comportant des
résistances chauffées, ou mieux des thermistors (on sait que leur résistance varie énormément avec
la température) faisant partie d’un circuit en pont de wheathstone, et fonctionnant comme
thermomètre à résistance (figure 2). La conductivité thermique du mélange gazeux varie
brusquement au moment où une vapeur apparaît dans le gaz vecteur. C’est pour avoir une
différence aussi grande que possible qu’il y ait intérêt à choisir un gaz vecteur de conductivité très
élevée, soit l’hélium ou l’hydrogène. La conductivité thermique de la plupart des vapeurs
organiques est la même et la réponse du détecteur est une fonction linéaire de la concentration de
chaque substance.

Figure 2: Schéma du principe de montage d'un catharomètre
Un dispositif électronique enregistre le passage d’une substance sous forme de pic sur le
graphique d’un millivoltmètre enregistreur où l’on porte les temps en abscisse. On peut avoir avec
des appareils convenables une réponse linéaire. Par son principe même, ce détecteur est peu
sensible aux variations de pression qui ne modifient pas beaucoup la conductibilité thermique du
gaz (mais il le serait aux très basses pressions), mais des précautions spéciales doivent être prises
pour éviter les variations de débit : On met les résistances à l’écart du flux gazeux direct, ce qui
entraîne malheureusement une certaine inertie du système. La mesure des conductivités
thermiques est la méthode la plus courante en chromatographie des gaz, et la plupart des appareils
commerciaux sont équipés de catharomètres. La sensibilité est malheureusement limitée.

Tableau 1: caractéristiques analytiques d'in catharomètre
II.2. Détecteur à ionisation de flamme :

Un détecteur beaucoup plus sensible a été introduit par Mc William et Dewar, basé sur la
production d’ions dans une flamme d’hydrogène (ou d’un mélange azote–hydrogène) quand une
trace de substance organique y apparaît. Le montage expérimental est donné (fig. 3,). A la base de
la flamme, aux températures comprises entre 500 et 1000 °C, la substance organique se
décompose et des ions positifs probablement hydrocarbonés se forment. Le courant d’ionisation
apparaissant entre la grille et la base, après amplification, est enregistré. Il n’y a pratiquement pas
formation d’ion dans la flamme du gaz vecteur pur et l’enregistreur a donc une ligne de base très
stable. Le nombre d’ions, et donc la déviation, sont grossièrement proportionnels au nombre
d’atomes de carbone de la substance. Ça peut être un avantage, par exemple dans l’analyse de
mélanges d’hydrocarbures. La sensibilité est beaucoup plus grande que celle des catharomètres.
On peut injecter des quantités de produits plus faibles et les colonnes n’étant pas
surchargées, la séparation est meilleure.

Figure 3: Schéma d'un détecteur à ionisation de flamme
Tableau 2: Caractéristiques analytiques d'un FID
II.3. Détecteur à capture électronique :

Ce détecteur, spécialement utilisé pour la mise en évidence de substances halogénées, est
pratiquement insensible aux hydrocarbures saturés. Sa sensibilité élevée vis–à–vis des substances
halogénées en fait un détecteur de choix pour la recherche des traces d’insecticides dans les
produits alimentaires (figure 4).
Principe
Lorsqu’une molécule XY réagit avec un électron libre, on obtient la série de réactions
suivantes, toutes les trois avec un échange d’énergie :

XY + e- XY- ± énergie
XY + e- X + Y- ± énergie
XY + e- X-+ Y ± énergie
Lorsque cette série de réactions a lieu dans la chambre d’ionisation dans laquelle la source
d’ionisation est par exemple une source radioactive dans laquelle circule un gaz tel que l’azote (ou
tritium = isotrope radioactif de l’hydrogène : nombre de masse 3). Si on place dans cette chambre
deux électrodes auxquelles on applique une faible différence de potentiel, on obtient un courant dû
à la collecte de presque tous les électrons (du fait que l’azote n’a pas d’affinité pour les électrons
libres et que la probabilité de recombinaison des ions positifs et des élections libres est faible en
raison de la grande mobilité des électrons libres).
Figure 4: Schéma du détecteur par capture d'électrons
En revanche, dès que dans cette chambre pénètrent des substances organiques possédant
une affinité pour les élections libres, il y a formation d’ions négatifs qui peuvent se recombiner
avec des ions positifs présents et l’on constate une diminution du courant traversant la cellule.

Tableau 3: Caractéristiques analytiques d'un ECD

III. Grandeurs de rétention

Le temps de rétention (tr ) est le temps d’élution au sommet du pic, c’est-à-dire le temps
que mette le composé envisagé pour parcourir la colonne.
Le temps d’élution d’un gaz inerte (air, par exemple) correspond au temps d’élution du
volume de la phase mobile contenu dans la colonne (volume mort) : to ou tm.
Le chromatogramme de la figure 5 représente les pics caractéristiques de deux produits A
et B et de l’air (volume mort). Les grandeurs to, (tr)A et ( tr)B sont les temps de rétention. Si l’on
connaît le débit du gaz vecteur, on peut en déduire les volumes de rétention : VO, (VR)A et (VR)B.
Ces grandeurs de rétention sont généralement exprimées en unités de longueur d’abscisse
sur le papier enregistreur (si la vitesse de déroulement du papier est constante) : dO, (dr)A et (dr)B.
En pratique, les grandeurs de rétention sont souvent mesurées par rapport au pic de l’air :
on peut ainsi minimiser les différences d’appareillage et permettre de meilleures comparaisons
entre les résultats expérimentaux.

Figure 5: principaux paramètres d'un chromatographe
III.1. Efficacité d’une colonne

L’efficacité d’une colonne vis-à-vis d’un soluté A est exprimée par le nombre nA de
plateaux théoriques :
nA = 16 ((dR)A/ ωA )2 = 5.54 ((dR)A / (δ1/2)A )2 (1)

ωA ≈ 1.7 δ1/2
où (dr)A est la distance de rétention (mesurée en unités de longueur de papier à

l’enregistreur) qui est proportionnelle au temps de rétention et au volume de rétention.
ωA : est la largeur du pic à la base déterminée conventionnellement par le segment de droite
délimité par les tangentes aux points d’inflexion du pic.
(δ1/2)A : est la largeur du pic à mi-hauteur.
La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) est donnée par l’expression :
(HEPT)A = L / nA (2)
Dans laquelle L est la longueur de la colonne.

III.2. Le facteur de capacité correspondant à 1 pic
K΄ = (tR – tO) / tO = (VR – VO) / VO (3)
III.3. Résolution (entre deux pics voisins)

La résolution d’une colonne vis-à vis à des solutés A et B s’exprime par un nombre sans
dimension :
R = 2 ((dR)B - (dR)A) / (ωA + ωB ) (4)

R ≈ 1, 18 ((tR)B – (tR)A) / (δ1/2 A + δ1/2 B)
Si R≥1 : les pics sont séparés.
R<1 : les pics se chevauchent et la résolution est mauvaise.
IV. Influence des paramètres expérimentaux sur les grandeurs de rétention :
Les grandeurs de séparation sont fonction des paramètres suivants :
IV.1. Nature de la phase stationnaire et des constituants du mélange :

Ainsi des composés non polaires sont séparés par des phases stationnaires non polaires
(ex : séparation des alcanes sur une colonne de squalane), tandis que les composés polaires le sont
sur des phases stationnaires polaires (ex : séparation des alcools sur colonne carbowax) voir
tableau.
IV.2. Débit du gaz vecteur :

Une augmentation du débit du gaz vecteur entraîne une diminution des temps de rétention.
Inversement, un débit trop faible entraîne des temps de rétention élevés. Il faut donc rechercher
une valeur optimale du débit.
Le débit du gaz vecteur influence également la hauteur équivalente à un plateau théorique

(HEPT) et donc l’efficacité de la colonne. C’est ce qui exprime l’équation de Van Deemter.
V = D t ; si D augmente alors t diminue ; D= V/t = Sū
Avec V : le volume ; t : le temps ; S : la section ; ū : la vitesse moyenne

C’est M. Van Deemter, qui a étudié la relation qui existe entre l’efficacité et le débit du gaz
vecteur, pour une colonne de caractéristiques données.
Pour une colonne de longueur donnée L et une efficacité n.

H = HEPT = L / nA (nA est l’efficacité liée au pic A)
Il a été montré que la hauteur équivalente à un plateau théorique était reliée aux différents
paramètres de la colonne par :
H=A+B/ū +Cū
A : coefficient de diffusion turbulente: f (irrégularité et diamètre des grains)

B : coefficient de diffusion longitudinale.
C : coefficient de diffusion (résistance) au transfert de masse.
ū : vitesse linéaire moyenne du gaz vecteur (cm/s).
Représentation graphique de l’équation de Van Deemter.
 Pour ū donnée, h est d’autant plus petite que A, B et C le sont également ; on peut donc
agir sur h en agissant sur A, B et C.
 Facteur B : ce facteur exprime le fait que lorsqu’un produit séjourne dans la colonne, on
constate un élargissement du plateau, du fait de la diffusion moléculaire en phase gazeuse dans
l’axe de la colonne. Pour les grandes valeurs de ū, la diffusion moléculaire est négligeable.

 Facteur C : Exprime que, du fait des difficultés de transfert d’un plateau à l’autre
lorsqu’on utilise des débits trop élevés, on constante un élargissement de h.
IV.3. Température de travail :

La température de la colonne influence nettement le temps de rétention. En pratique,
toute élévation de température se traduit par une diminution du temps de rétention. Il faut, par
conséquent, veiller à ce que la température de la colonne demeure aussi constante que possible si
l’on veut obtenir des résultats reproductibles (chromatographie isotherme). Deux substances sont
d’autant mieux séparées que la température est moins élevée mais il y a une limitation due à
l’élargissement correspondant des pics.
Tout comme pour le débit de gaz vecteur, il y a donc lieu de rechercher la température de
travail optimale.
La chromatographie isotherme peut néanmoins présenter de sérieux inconvénients quand

on doit séparer des constituants dont les temps de rétention sont très différents. Dans ce cas, on
réalise une chromatographie à température programmée : on augmente progressivement selon une
loi, linéaire ou non, la température de la colonne au cours de l’analyse, ce qui a pour effet
d’accélérer la sortie des pics lointains.
La figure 6 permet de comparer un chromatogramme obtenu en isotherme avec un

chromatogramme obtenu par programmation de température d’un même mélange
d’hydrocarbures.

Figure 6: Effet du gradient de température sur la séparation
IV.4. Caractéristiques géométriques de la colonne :

Les diamètres intérieurs des colonnes analytiques ordinaires sont de l’ordre de 3 à 6 mm et
les longueurs de quelques mètres. L’efficacité d’une colonne est proportionnelle à la longueur de
la colonne et est en relation inverse de sa section. Une meilleure séparation est obtenue en utilisant
des colonnes capillaires. (Diamètre de l’ordre de 0,1 à 0,5 mm).
IV.5. D’autres paramètres interviennent également :

La dimension des particules et la surface spécifique du solide constituant la phase
stationnaire, la capacité de la colonne, la concentration en liquide dans la phase stationnaire,
….etc.

Figure 7:
V. ANALYSE QUALITATIVE :
L’identification de composants d’un mélange est basée sur la comparaison des temps de
rétention, sur la même colonne et dans les mêmes conditions d’analyse, des composants du
mélange avec ceux des produits purs soupçonnés d’être présents dans le mélange. Ce premier
travail effectué, l’identification certaine d’un pic est obtenu de la manière suivante :
 Injection du mélange inconnu.
 Enrichissement (dopage) du mélange inconnu par l’un des composants présumés.
 Injection du mélange ainsi enrichi.
 Comparaison des intensités relatives des pics dans les deux chromatogrammes et
identification des pics dont l’intensité a augmenté.
 L’identification est certaine seulement si elle est corroborée par des chromatographies réalisées
dans d’autres conditions expérimentales (température différente, changement de phase
stationnaire, etc.) du mélange avant et après dopage.
 Dans le cas de composés totalement inconnus, l’identification n’est possible que par une
analyse structurale couplée à la chromatographie (spectrométrie de masse, spectrométrie infra-
rouge, spectrométrie de résonance magnétique nucléaire).
VI. ANALYSE QUANTITATIVE :
Dans un chromatogramme, la surface de chaque pic est proportionnelle à la quantité de

substance injectée mais la constante de proportionnalité n’est pas la même pour toutes les
substances.
Les surfaces des pics sont généralement déterminées par intégration automatique. Les
procédés moins récents font appel à la planimétrie manuelle ou à l’application de la méthode du
triangle.
Deux méthodes sont utilisées pour effectuer une analyse quantitative ; la méthode de
l’étalon externe et la méthode de l’étalon interne.
VI.1. Méthode de l’étalon externe :

Supposons que l’on ait à déterminer la concentration d’une substance A en solution dans
un solvant inerte B.
On prépare 5 solutions étalons de cette substance A pure dans le solvant B (les

concentrations en A doivent être connues avec précision). Les concentrations standard sont
choisies de telle sorte qu’elles avoisinent la concentration en A dans la solution inconnue.
Des quantités rigoureusement identiques (ex : 1ml) de ces 5 solutions étalons sont injectées
successivement dans le chromatographe. Les 5 chromatogrammes obtenus permettent d’établir
une courbe d’étalonnage (généralement une droite) exprimant la concentration de la substance A
en fonction de l’aire des pics .
Il suffit alors de reporter l’aire du pic de la substance A pour la solution inconnue (que
l’on aura injecté rigoureusement dans les mêmes conditions que les 5 solutions standards) sur le
graphe et d’en déterminer la concentration en A.
VI.2. Méthode de l’étalon interne :

Elle consiste à introduire dans le mélange à analyser une quantité connue d’une substance
étalon choisie de telle manière qu’elle possède un temps de rétention différent de celui des autres
constituants.
Supposons que l’on ait à déterminer la concentration en A en solution dans un solvant

B.

On prépare 5 mélanges de A pur avec un étalon interne E. Les quantités exactes de A et de

E sont connues avec précision. Le mélange est mis en solution dans le solvant inerte B. Il faut
essayer d’obtenir les conditions de concentration les plus voisines de celles qui existent dans le
mélange inconnu.
On enregistre les 5 chromatogrammes correspondants, en maintenant constantes toutes les

conditions expérimentales.
On porte en graphique le rapport (conc.A/conc.E) en fonction du rapport (AireA/AireE).

On obtient généralement une droite qui peut être légèrement incurvée.
Disposant d’une quantité connue de mélange du départ, on y ajoute l’étalon E en quantité

connue et on injecte la solution dans le chromatographe, aux mêmes conditions expérimentales
que celles qui ont permis d’établir la courbe d’étalonnage.
On reporte sur le graphe le rapport des surfaces mesurées et on en détermine le rapport

des concentrations. Connaissant la quantité d’étalon ajoutée, on calcule la concentration en A dans
le mélange de départ.
En résumé:
Etalonnage direct : S=f(C) si le volume injecté est constant
Méthode de l’étalon interne: S/Si =f(C) si le volume n’est pas constant
Méthode des ajouts dosés: s'il y a des interférences.

CHAPITRE II: CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE
I. Chromatographie liquide haute performance (H.P.L.C) :

I.1. Généralités :
On distingue la chromatographie liquide sur colonne conventionnelle (avant 1970)
caractérisée par :
 Lenteur de séparation (colonnes peu efficaces).
 Absence de détecteurs.
Et la chromatographie liquide haute performance caractérisée par :

 Nouveaux types de support (granulométrie très fine).
 Pompes à haute pression.
 Détecteurs munis de micro cuvettes à circulation.
Comparaison entre C. L. conventionnelle H.P.L.C

Matériaux pour colonne Verre Acier inox
Diamètre intérieur (mm) Supérieur à 10 2- 5
Vitesse linéaire (µm/s) 0.01-0.1 1- 10
Pression (bars) 0.05 - 0.1 70-400
Taille de l'échantillon (g) 0.1-5 10-9-10-5
Analyse de l'effluent Manuelle Détecteur
Durée 4 à 12h 5 à 10min
Domaine d'application Préparatif Analytique
Diamètre des particules (µm) 100-150 3 à 10
I.2. Classification des méthodes utilisées en chromatographie liquide :

 Phase mobile : toujours un liquide
 Selon la nature de la phase stationnaire :
 Chromatographie liquide-solide (C.L.S).
 Chromatographie liquide-liquide (C.L.L).
 Selon la technique utilisée :

 Chromophotographie sur colonne.

 Chromophotographie de surface (papier et couche mince).

 Selon la nature des phénomènes intervenant dans la séparation chromatographique entre le soluté
et la phase stationnaire, on distingue : La chromatographie d’adsorption (C.L.S), de partage
(C.L.L), d’échange d’ions (C.E.I), d’exclusion, d’affinité, de paire d’ions (C.P.I).
II. Les différentes méthodes chromatographiques :

II.1 Chromatographie d’adsorption : liquide-solide :
Cette méthode a été la plus anciennement utilisée, actuellement elle n’est plus utilisée
que pour des cas bien spécifiques (10% des cas). Elle est presque toujours utilisée en polarité de
phase classique (la silice représentant 90% des applications, chromatographie polaire).
Phases stationnaires utilisées :
 Silice (Si O2)x

 Alumine (Al2O3)x
Phases mobiles utilisées :
 Mélange de solvants organiques.
A polarité de phase classique A polarité de phase inversée

Phase stationnaire La plus polaire La moins polaire
Phase mobile La moins polaire La plus polaire
Ordre d’élution Les substances les moins Les substances les plus
Hydrophiles sont les moins hydrophiles sont les moins
retenues (les moins polaires) retenues (les plus polaires).
La silice est l’adsorbant quasi universel de ce type de chromatographie (adsorbant à

caractère toujours plus ou moins acide suite à la présence de groupements silanols).
Plus un adsorbant a des pores larges, plus la surface spécifique est faible.
La silice est un adsorbant de type polaire, le charbon actif est un adsorbant de type
non polaire mais il est peu utilisé en polarité de phase classique (mauvaise homogénéité).
Cette technique est appliquée pour la séparation de classe, mais pas pour la séparation des
homologues d’une même classe.

Exemple : Ordre d’élution : Hydrocarbures saturés (les moins polaires) donc (les moins retenus),
les hydrocarbures non saturés, aromatiques, halogènes, éthers, composés nitrés, esters, cétones,
alcools, amines, amides, acides carboxyliques (les plus polaires).
Série éluotropique pour la silice

Isoctane -n hexane
Ether isopropylique
Chloroforme
Dichlorométhane
Tetrahydrofurane
Acétate d’éthyle Force éluante croissante
Dioxane
Acétonitrile
Méthanol
Eau

II.2. Chromatographie sur phase greffée :
Dans la littérature on parle en général de chromatographie de partage (c'est-à-dire

liquide- liquide) sur phase greffée ; ce terme est inadéquat dans le sens où la phase étant greffée
chimiquement sur le support. On doit donc considérer l’ensemble adsorbant – phase c'est-à-dire un
solide. Le greffage consiste en la fixation sur l’adsorbant (en général la silice) de chaînes
aliphatiques ou aromatiques, simple ou avec des groupements fonctionnels ayant pour but de
modifier la polarité de cet adsorbant (le rendre peu ou pas polaire ou le rendre plus polaire ex.
NH2).
La réaction la plus courante de greffage est une réaction de silanisation.

R R
a) ― Si ― OH + X ― Si ― R ― Si ― O ― Si ― R
R R
b)- Silane bifonctionnel :
A compléter
X = Cl
Schéma réactionnel des chloroalkoxysilane sur la silice.
En pratique les phases greffées les plus utilisées en chromatographie liquide sont :
Amine ; (CH2)n - NH2, nitrile, – (CH2) – CN ; phényle , – (CH2)n–C6H5 ; Octyl ; – (CH2)7 – CH3 ;
octadécyl ; -(CH2)17 – CH3.
Les phases greffées dépendant de la nature du radical R; ils peuvent être polaires (–NH2
le seul qui peut être considéré comme plus polaire que la silice) ou intermédiaire (– CN ; NO2 ; –
diol, N(CH3)2 ou apolaire (C18, C8, phényle, diméthyle).


a/ Chromatographies de partage (greffés) à polarité de phase normale :

b/ Chromatographies de partage (greffés) à polarité de phase inversée :
Ce sont ces dernières qui soient responsables du développement exponentiel de L’HPLC
L’intérêt c’est :
1°) l’utilisation de phases mobiles, aqueuses qui correspondent en général aux

milieux biologiques d’où possibilité d’injection directe.
2°) Plus grande souplesse : on peut aussi faire intervenir le facteur pH lorsqu’on
doit doser des substances ionisables.

Beaucoup de facteurs exercent une influence sur la rétention des solutés comme la
porosité de la silice, la configuration des fonctions greffées à la surface de la silice, mais aussi les
résidus silanol et siloxane et le taux de greffage.
Les phases mobiles utilisées sont généralement soit de solutions tampons (acétate,
phosphate) soit des mélanges tampons – méthanol et tampons - acétonitrile. L’eau est l’éluant le
plus faible en chromatographie à polarité de phase inversée.
Le méthanol et l’acétonitrile permettent l’utilisation des détecteurs UV et sont
suffisamment fort pour permettre l’entraînement de la quasi-totalité de solutés.
Le temps de rétention varie avec le pH de la solution (si les espèces étudiées possèdent
des groupements acides au basiques) d’où il est nécessaire de contrôler le pH de l’éluant en
tamponnant le milieu (ex : tampon acétate, citrate, etc.). De même il faut éviter de travailler à
des pH basiques (pH>8), car, dans ce domaine les phases greffées sont instables et la durée de
vie des colonnes considérablement réduite.

II.3. Chromatographie de partage (liquide-liquide) :
Ce type de chromatographie (de partage) n’est presque plus utilisé vu le manque de

stabilité de la phase stationnaire.
La phase stationnaire est véritablement un liquide imprégnant simplement le support sans
aucune liaison chimique avec celui-ci (gel de silice, résine organique, etc.).

II.4. Chromatographie d’échange - d’ions :
Cette technique consiste à un échange d’ions (cations où anions) contenu dans

l’échantillon et ceux greffés à la phase stationnaire.
Cette technique comporte néanmoins des problèmes liés à la nature même des résines
(polymères) qui n’était pas favorable à un bon transfert de masse : et les phases de silices greffées
contenant des groupements échangeurs d’ions posaient un problème de capacité d’échange.
Actuellement on essaye de réduire les effets de transfert de masse pour les résines
(sulfonation superficielle  seule la surface comporte des sites échangeurs) et d’augmenter la
capacité d’échange des silices, on arrive à 2 méq/gr de résine).
Actuellement : aucune matrice échangeuse d’ions n’est parfaite.

Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le
groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :
- dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pKa du groupement
ionisable (exemple : le pKa du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5) ;
- dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pKa du groupement
ionisable (exemple : le pKa du groupement carboxyméthyl est 4).
Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de
leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge nette :
o négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée
négativement à pH 7 ;
o nulle ;
o positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à
pH 7 ;
Exemple: "Voir un exemple de la variation de la charge nette d'une protéine en fonction du pH".
Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :

o En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont
chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que
l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les
molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.

o En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion

de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre -
ion.
L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le
suivant :
- cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+
- cations divalents : Cd2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ca2+
- de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca2+ < Al3+
Rappels: Structure de l’échangeur

1- Anionique: R+ X-St + Y-Mob R+ Y-St + X-Mob
2- Cationique: R- B+St + C+Mob R- C+St + B+Mob
1°) Groupements fonctionnels.
a : SO3- (sulfonâtes : échangeur de cations forts) pH= 2-13.
b : NR3+(échangeur d’anions forts)
c : COO-(carboxylate) : acide faible Influencé par le pH.
d : NR2H+ base modérément faible
2°) matrices sont soit des

a) Résines poreuses.
b) Résines pelliculaires.
c) Silices échangeuses.
II.5. Chromatographie de paires d’ions :
Le passage de la chromatographie en phase inverse vers la chromatographie de paires

d’ions s’est réalisé suite à deux remarques.
1°) limitation de l’analyse des substances à caractère basique suite à la limitation de la stabilité de la
silice au pH (2-8)

2°) Les substances amphotères ont toujours une charge sur la molécule : à pH acide :
forme cationique; à pH basique : forme anionique.
Le principe de la technique consiste à la formation d’une paire d’ions soit directement sur
la phase stationnaire, soit dans la phase mobile ensuite adsorption sur la phase stationnaire ;
Ex : la paire d’ions ne se forme pas en phase aqueuse, les ions s’associent dans la phase organique.
Q+aq + X -
aq QX org

Nature du contre ion
1°) Les anions.

a) Inorganique : perchlorate (ClO4-), bromure, phosphates.
b) Organique : sulfonâtes aliphatique (CH3-SO3-) toujours ionisés quelques soit le pH car sel d’acide
fort).
2°) Les cations : Ce sont toujours des ammoniums quaternaires aliphatiques de type
symétrique : T.M.A ; T.E. A (tetraméthylammonium; tetraéthylammonium; etc).
Avantages de la chromatographie de paires d’ions vis-vis de la chromatographie d’échange

d’ions.
 Les phases classiques en échange d’ions sont des phases polymériques d’où une faible vitesse de
transfert de masse et de ce fait une diminution de l’efficacité (même en diminuant le diamètre des
particules on obtient pas la même l’efficacité que sur la silice).
 Coût très élevé (jusqu’à 7 fois plus cher).
 La chromatographie de paire d’ions à un caractère universel : On peut analyser sur la même
colonne les anions et les cations, de même que les substances amphotères et les substances non
chargées.
II.6 Chromatographie sur gel perméable (filtration sur gel) :
Cette méthode est fondée sur la capture sélective des molécules de soluté suivant leur
taille lors de leur pénétration dans les pores de la phase stationnaire (agarose, gels de dextrose, de
polystyrène, de polyacrylamine, ..etc. ) liquide.
Les grosses molécules, exclues d’une partie des pores de la phase stationnaire migrent
plus rapidement que les petites molécules qui elles, peuvent pénétrer dans un plus grand nombre
de pores.
La séparation est donc principalement basée sur la taille des molécules en solution. Elle
est très utilisée en chimie macromoléculaire et en biochimie où elle sert à la séparation des
macromolécules suivant leur masse moléculaire. Le gel doit évidemment avoir des pores de
dimensions correspondant à la taille, des molécules à séparer.

II.7. Chromatographie d’affinité :
Elle met à profit l’affinité spécifique qu’ont certaines molécules pour une substance fixée
par une réaction de coordination sur un support.
Ce coordinat spécifique de la molécule à isoler est greffé sur une matrice (agarose,
polyacrylamide, etc.), il se forme alors un complexe entre ce ligand et la molécule lors de son
passage dans la colonne, complexe qu’il suffit de dissocier ultérieurement par élution au moyen
d’un composé chimique qui a une affinité plus grande avec le coordinat greffé.
III. Comparaison avec la chromatographie gazeuse (GC) :
 Limitation de CG :
 Substances : - ionisées.
- peu sensible à la température.
Avantage de CL :
 Pratiquement pas de limitations à propos de la nature et du volume de l’échantillon.
 Possibilité d’optimisation supérieure dans les cas de séparation difficiles pour les raisons
suivantes :
1- interactions avec la phase stationnaire et avec la phase mobile.
2- phases stationnaires sont beaucoup plus variées en C.L.
3- intensité des interactions moléculaires élevées à basse température
 Difficultés en CL: d’ordre technologique

 Causes :
1- diffusion 10.000 à 100.000 fois plus lente en LC qu’en CG
2- viscosité d’un liquide : environ 100 fois plus grande que celle d’un gaz.
 Remèdes : raccourcir le chemin à parcourir par diffusion.
1- en utilisant des phases stationnaires poreuses de granulométrie très fine et très homogène :
micro particules. mais difficultés : pour le remplissage des colonnes et pour le passage de la
phase mobile.

2- en utilisant des phases stationnaires « pelliculaires »

mais: faible capacité et coût élevé.
3- disposer de pompes capables de débiter la phase mobile sous haute pression (1 PSI=: 0,07 Bars :
7.10-3 := MPa : 7.103 Pa, 1 inch :=25,4 mm Hg)
(Viscosité : 1cP (centi-poise) = 10-3. Pa s)

IV. Appareillage :
Le schéma de principe d’une chromatographie en phase liquide ; le système le plus
simple, fonctionnant à composition de solvant constante (régime isocratique), (fig. 1) où avec un
gradient d’élution (fig.2)
Les éléments principaux de l’appareillage sont :
 Les systèmes de pompage

 Dispositifs de gradient d’élution
 Injecteurs
 Détecteurs
 Traitement du signal
 Systèmes de régulation de la température.

IV.1. Système de pompage :
La majorité des systèmes de pompage ont des pressions de refoulement élevées (≥ 300
bars) et des débits volumiques voisins de 10 ml mn-1
On distingue deux types de pompes : les pompes électriques et les pompes pneumatiques.
Les qualités requises pour telles pompes sont d’avoir un débit constant et sans pulsations.
IV.2. Dispositifs de gradient d’élution :
La mise en œuvre d’un gradient d’élution lors de la séparation de mélanges complexes

permet d’optimiser les valeurs des facteurs de capacité et de réduire ainsi le temps d’analyse. La

programmation de solvant en CPL joue le même rôle que la programmation de température en

CPG.
Deux dispositifs de gradients sont utilisés : l’un faisait appel à une seule pompe, l’autre à
deux pompes. Le deuxième système est plus fiable et reproductible mais présente l’inconvénient
d’immobiliser deux pompes.
IV.3 Injecteurs :
Il existe deux méthodes d’introduction de l’échantillon au sommet de la colonne : Les

injecteurs à seringue et les vannes à boucles d’échantillonnage. Ce dernier système est le plus
utilisé. Il consiste à remplir, soit partiellement soit totalement une boucle par la solution à injecter.
Cette dernière est entraînée en tête de colonne, après rotation de la vanne, par la phase mobile (fig.
3). Ce type d’injecteur se prête bien aux injections sous haute pression (jusqu’à 400 bars), aux
analyses répétitives et à leurs automatisations.
Figure 3: schéma d'un injecteur à boucle
IV.4. Détecteurs :
Le détecteur est l’un des organes essentiels d’un chromatographe en phase liquide
puisqu’il permet de suivre en continu la séparation et de mesurer la concentration des solutés.
Il existe plusieurs types de détecteurs : les détecteurs spectrophotométrique (UV, visible),

détecteur à fluorescence, détecteur par photométrie de flamme, détecteur ampérométrique ou
détecteurs électrochimiques en général refractométrie.
Le choix d’un détecteur dépend à la fois des caractéristiques physiques des espèces à
séparer et des conditions opératoires.

Les principales caractéristiques d’un détecteur sont :
 La sensibilité (rapport de la réponse du détecteur à la quantité d’échantillon) ; elle varie

généralement avec la nature du soluté et de la phase éluante ;
 La détectabilité (quantité minimale détectable)
 La linéarité qui exprime le domaine de concentration dans lequel la réponse du détecteur varie
linéairement avec la concentration ;
 Le volume mort de la cellule du détecteur (8 µl en général) et son temps de réponse ;
 Le caractère non destructif, ce qui permet de recueillir les solutés séparés en vue d’une utilisation
ultérieure. (Identification par exemple).
IV.4.1 Détecteur à absorptiométrie (détecteur spécifique)
Ce sont des détecteurs spécifiques dont la réponse dépend essentiellement de l’absorptivité

du soluté.
Le volume mort des cellules est généralement < 8 µl pour un chemin optique < 1cm est le
temps de réponse est < 0,5 s. Cela permet d’atteindre des quantités minimales détectables de
l’ordre de ng (et moins) de substance dans les cas favorables.
La plupart des solvants utilisés en CPL sont transparents dans le visible et l’ultraviolet, ce
type de détecteur est très bien adapté pour la mise en œuvre de l’élution graduée.

On peut élargir le domaine de détectabilité des substances en réalisant des réactions de

dérivatisation (dérivation) conduisant à des substances détectables (les données
chromatographiques sur couche mince permettent d’envisager des détections par UV- visible).
IV.4.2. Détecteurs à indice de réfraction (détecteur universel).
La réfractométrie différentielle mesure en continu la différence d’indice de réfraction

entre les composés de l’échantillon et l’effluent de la colonne. La sensibilité de ce type de
détecteur sera d’autant plus grande que la différence d’indice de réfraction entre les solutés à
séparer et la phase éluante sera grande. Sa qualité principale et son caractère universel. Son défaut
principal est le manque de sensibilité. Ce type de détecteur varie en fonction de la température de
la phase mobile, et ne permet pas l’utilisation de gradient d’élution.
IV.4.3. Détecteur à fluorimétrie (détecteur spécifique)
Cette méthode de détection peut être particulièrement sensible. Elle étend la détection par
absorptiométrie dans l’ultraviolet aux dérivés fluorescents.
IV.4.4. Détecteur électrochimique (détecteur spécifique)
On peut classer les détecteurs électrochimiques en trois catégories dont les principes sont
basés sur des techniques électroanalytiques différentes :

 Le détecteur conductimétrique, ce qui mesure en continu la conductivité électrique de la phase

mobile en fonction de sa composition.
 Le détecteur potentiométrique : qui à quelques exceptions prés, emploie en flux continu des
électrodes spécifiques aux ions. Grâce à la simplicité de l’instrumentation et de la mesure, ce type
de détecteur devient de plus utilisé en flux continu, malgré la faible sensibilité, notamment pour
certaines applications spécifiques (acides organiques et anions).
 Les détecteurs ampérométriques (potentiostat) : Ces types de détecteurs utilisent les propriétés
réductrices ou oxydantes des solutés, ce qui supposent que l’effluent chromatographique est
suffisamment conducteur pour permettre la mesure du courant. Les détecteurs ampérométriques
sont en général très sensibles (des sensibilités voisines de 10-8 g de substance injectée sont
généralement atteintes pour de nombreux composés organiques : (Amines aromatiques, dérivés
phényliques, etc.), la limite atteint 10-12 g de substance). Le volume mort de la cellule est très
faible (1 où 2 µl).

Tableau : Quelques caractéristiques de détecteurs couplés à la HPLC
IV.5 Traitement du signal :
La grande majorité des intégrateurs calculateurs couramment utilisés en CPG peuvent

être en CPL.
V. Principales grandeurs intervenant en LC

Conditions pour obtenir une bonne séparation en LC :
 Les différents constituants doivent être retenus sur la colonne.

 Les sommets des différents pics doivent être assez écartés : (sélectivité).
 Les pics ne doivent pas être trop larges  efficacité.
 L’analyse doit être aussi rapide que possible.
V.1. Rétention :
tr : temps de rétention
Vr : volume de rétention

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Chimie Analytique II

PARTIE B: METHODES DE SEPARATION CHROMATOGRAPHIE

CHAPITRE I: Techniques d'analyse chromatographiques

La chromatographie est une technique de séparation des constituants d’un mélange le

I. chromatographie en phase liquide:

I.1. La chromatographie sur colonne (C P L) :

 Si le substrat est un gel, on peut obtenir des séparations de constituants de degrés de

I.2. Chromatographie mono dimensionnelle sur papier

Pour ce type de chromatographie, le support est simplement une bande ou feuille de

Laila IDRISSI Page 58

Quand le front du solvant a presque atteint l’extrémité opposée du papier, on arrête

Le RF : représente le rapport entre la distance parcourue par un constituant du mélange,

di = distance parcourue par la substance i

do = distance parcourue par le solvant

I.3. Chromatographie bidimensionnelle sur papier.

I.4. La chromatographie en couche mince ou chromatophore :

C’est une chromatographie récente ; on recouvre une plaque de verre, de matière

Laila IDRISSI Page 59

II. chromatographie en phase gazeuse :

Laila IDRISSI Page 60

CHAPITRE I: Chromatographie en phase gazeuse

aucune interaction avec la phase stationnaire : azote, hélium ou hydrogène.

Laila IDRISSI Page 61

Figure 1: Éléments essentiels d'un chromatographe gazeux

II. Les détecteurs en chromatographie gazeuse

Laila IDRISSI Page 62

Figure 2: Schéma du principe de montage d'un catharomètre

Laila IDRISSI Page 63

Tableau 1: caractéristiques analytiques d'in catharomètre

II.2. Détecteur à ionisation de flamme :

Laila IDRISSI Page 64

Figure 3: Schéma d'un détecteur à ionisation de flamme

Tableau 2: Caractéristiques analytiques d'un FID

II.3. Détecteur à capture électronique :

suivantes, toutes les trois avec un échange d’énergie :

Laila IDRISSI Page 65

raison de la grande mobilité des électrons libres).

Figure 4: Schéma du détecteur par capture d'électrons

Laila IDRISSI Page 66

Tableau 3: Caractéristiques analytiques d'un ECD

Laila IDRISSI Page 67

III. Grandeurs de rétention

Laila IDRISSI Page 68

Figure 5: principaux paramètres d'un chromatographe

III.1. Efficacité d’une colonne

nA = 16 ((dR)A/ ωA )2 = 5.54 ((dR)A / (δ1/2)A )2 (1)

où (dr)A est la distance de rétention (mesurée en unités de longueur de papier à

La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) est donnée par l’expression :

Laila IDRISSI Page 69

III.2. Le facteur de capacité correspondant à 1 pic

K΄ = (tR – tO) / tO = (VR – VO) / VO (3)

III.3. Résolution (entre deux pics voisins)

R = 2 ((dR)B - (dR)A) / (ωA + ωB ) (4)

IV. Influence des paramètres expérimentaux sur les grandeurs de rétention :

Les grandeurs de séparation sont fonction des paramètres suivants :

IV.1. Nature de la phase stationnaire et des constituants du mélange :

IV.2. Débit du gaz vecteur :

une valeur optimale du débit.

Le débit du gaz vecteur influence également la hauteur équivalente à un plateau théorique

V = D t ; si D augmente alors t diminue ; D= V/t = Sū

Avec V : le volume ; t : le temps ; S : la section ; ū : la vitesse moyenne

Laila IDRISSI Page 70

vecteur, pour une colonne de caractéristiques données.

Pour une colonne de longueur donnée L et une efficacité n.