Chromatographie sur couche mince

Bien que découverte en 1938, ce n’est qu’en 1958 que fut popularisée la chromatographie sur couche mince,
telle que nous la connaissons actuellement. Cette technique a rapidement supplanté la chromatographie sur
papier, car elle est plus rapide et est utilisée autant pour les composés polaires que non polaires. ƒ

Principe de la chromatographie sur couche mince

Dépendant du choix des phases stationnaire et mobile, il est possible de réaliser sur couche mince des
chromatographies en exploitant les phénomènes d’adsorption, de partition ou d’échange d’ions. ƒ

Appareillage

L’appareillage utilisé pour la chromatographie sur couche mince est relativement simple, étant composé
d’une plaque et d’une cuve rectangulaire pour l’élution. On peut également utiliser un simple bocal de verre
pour les couches minces plus petites.

Les plaques peuvent être préparées en répandant à l’aide d’un étaleur une mince couche uniforme de la
phase stationnaire sur une plaque de verre, dont les dimensions varient de 2,5 × 7 cm à 20 × 20 cm. On
retrouve cependant dans le commerce des plaques prêtes à l’usage avec la phase stationnaire fixée sur une
feuille en plastique ou en aluminium. Ces dernières ont l’avantage d’être faciles à entreposer et découpables
en bandes selon les besoins de l’expérimentateur. Les phases stationnaires les plus utilisées en
chromatographie sur couche mince sont le gel de silice, l’alumine et la cellulose en poudre. La plupart des
plaques commerciales contiennent un indicateur de fluorescence qui permet la visualisation des taches à la
lumière ultraviolette. ƒ

Technique expérimentale

Les principales étapes d’une chromatographie sur couche mince sont :

a) Préparation de la plaque (activation par chauffage à l’étuve)

b) Déposition des échantillons inconnus et des standards

c) Préparation de l’éluant et de la cuve

d) Élution de la plaque

e) Séchage de la plaque

f) Révélation des taches (lampe U.V., iode ou réactifs chimiques spécifiques)

g) Calcul des Rf et interprétation des résultats. ƒ

Résultats et interprétation

Dans une chromatographie sur couche mince, les composés apparaissent sous forme de taches rondes ou
ovales. On peut obtenir parfois des traînées si l’échantillon déposé était trop concentré. Pour une phase
stationnaire et une phase mobile données, chaque composé est caractérisé par son Rf :

Distance parcourue par le

Rf =
Distance parcourue par l’éluant

La distance parcourue par le composé est calculée à partir du niveau de déposition jusqu’au centre de la
tache, tandis que la distance parcourue par l’éluant est calculée à partir du niveau de déposition de
l’échantillon jusqu’au front de l’éluant, marqué à la fin de l’élution. Le Rf est un nombre sans unités qui
varie entre 0 et 1; il est rapporté à deux décimales près (Ex. : Rf = 0,62).
Chromatographie
Définition
La chromatographie est une technique analytique de séparation qui permet de séparer les
constituants d'un mélange homogène liquide ou gazeux.

Le principe
Le principe de la séparation repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases
en contact :

La phase stationnaire qui peut être solide ou liquide

La phase mobile peut être un liquide ou un gaz.

La phase mobile qui se déplace le long de la phase stationnaire. La séparation est basée sur l'entraînement
différentiel des constituants du mélange. Ces derniers parcourent la phase stationnaire avec des temps
proportionnels à leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la phase stationnaire
(polarité).

On distingue deux types de chromatographie: sur colonne et planaire.

Sur colonne

La phase stationnaire est mis dans une colonne au travers de laquelle progresse la phase mobile par gravité
ou sous l’action d’une différence de pression

Sur couche mince (CCM)

Sur une surface plane La phase mobile qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant avec
elle l’analyte. Le processus d’entraînement de cet analyte est appelé élution. La phase mobile est un liquide.

Classification des méthodes chromatographiques :

La Classification des différentes méthodes chromatographiques se fait selon la nature des phases et le
procédé utilisé on distingue

Selon la nature de la phase mobile

On distingue deux types de chromatographie

Chromatographie en phase liquide la phase stationnaire qui peut être solide ou liquide

Chromatographie en phase gazeuse la phase stationnaire qui peut être solide ou liquide

Selon le procédé utilisé on distingue

On distingue:

Chromatographie d’adsorption :

La chromatographie liquide-solide (CLS) ou chromatographie d’adsorption : la phase stationnaire est un

adsorbant solide polaire (silice ou alumine), ce type de chromatographie peut s’effectué sur colonne ou
CCM. L’analyte adhère à la phase stationnaire par adsorption selon un coefficient d’adsorption. La phase
mobile peut être un liquide ou un gaz.
Chromatographie de partage :

La phase stationnaire est un liquide immobilisé sur un support solide inerte : soit imprégnée dans un solide
poreux (risques de lessivage), soit greffée sur le solide (phase greffée). La séparation repose sur le
coefficient de partage du soluté dans les deux phases. La phase mobile peut être un liquide ou un gaz.

La chromatographie d’exclusion,

Aussi désignée chromatographie de perméation de gel, ou tamisage moléculaire : la phase stationnaire est un
solide poreux c’est un tamis moléculaire, les grosses particules sont exclues de la phase fixe, les petites
particules sont incluses diffusent dans les pores du gel et leur migration est retardée et sont éluées les
dernières. La phase mobile est un liquide.

Chromatographie d’échange d’ions

Aussi définie chromatographie ionique : la phase stationnaire est une résine échangeuse d’ions (polymère
porteur de groupements ionisés, négativement pour séparer des cations, positivement pour séparer des
anions) : interactions électrostatiques.

La chromatographie d’affinité

La phase stationnaire est ici un substrat inerte sur lequel est greffé un “effecteur” qui présente une affinité
pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps).
Chromatographie instrumentale
Chromatographies en phase gazeuse (CPG)

La phase mobile est un gaz vecteur.

La nature du soluté : gaz, liquide volatil, liquide peu volatil, solide, macromolécule, espèce organique,
polaire, ionique,…

- but de l’analyse : identification de composants d’un mélange, nécessité ou non de “coupler” la

chromatographie avec une méthode spectroscopique ou avec la spectrométrie de masse (CPG/SM ou
GC/MS), contrôle de pureté, purification de produits (colonnes préparatives), suivi de réaction en continu
pour optimiser des paramètres, dosages (quantification)…

On distingue :

- chromatographie de partage : - La chromatographie gaz-liquide : la phase stationnaire est un liquide

immobilisé sur un support solide par imprégnation ou par greffage.

- chromatographie d’adsorption : - La chromatographie gaz-solide : la phase stationnaire est un solide

poreux, réservé à l’analyse de mélanges de gaz ou de liquides à bas points d’ébullition. Eventuellement, la
phase mobile peut être un fluide à l’état supercritique (ex CO2 à 50°C et 150 bars)

Chromatographie en phase liquide HPLC

La phase mobile est un liquide

La phase stationnaire est celle utilisée pour toutes les techniques de chromatographie, chromatographies de
partage, d’adsorption, d’exclusion, d’échange d’ions, d’affinité.
 Introduction

La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la différence
d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la phase stationnaire.
En effet, selon la plus ou moins grande affinité entre les solutés et la phase stationnaire ou mobile, les
constituants du mélange migrent à des vitesses différentes et sont ainsi séparés.

La technique présentée ici est la chromatographie sur colonne, elle utilise une phase stationnaire
introduite dans une colonne de verre. C'est une technique très largement utilisée notamment lors de réaction
en chimie organique, pour séparer et purifier les différents constituants d'un mélange. Elle fut découverte en
1906 par le botaniste russe Tswett, qui montra que l'on pouvait séparer des colorants végétaux en faisant
passer leur solution dans l'éther de pétrole à travers une colonne remplie de carbonate de calcium.

Au cours de cette séquence nous verrons sur l'exemple d'un mélange de colorants, extraits du sirop de
menthe, le principe de cette technique en utilisant comme phase stationnaire la silice (SiO2).

Présentation du matériel

Nous avons ici besoin de ces différents éléments :

• Pot silice,
• les deux éluants : eau salée à 40g/L, puis éthanol,
• entonnoir,
• sable et coton,
• colonne en verre,
• béchers,
• pipettes pasteur, propipettes, verre à pied,
• solution contenant le mélange sirop menthe,
• support et tubes à essai,
• laine verte (contenant les colorants).

Revenons sur quelques uns de ces éléments :

• Le pot de silice : il contient la phase stationnaire finement divisée à introduire dans la colonne, car
toute séparation chromatographique implique l'écoulement d'une phase mobile au contact d'une phase
stationnaire de grande surface.

• La colonne en verre : selon la quantité de produits à séparer et la qualité de la séparation, on choisira

des colonnes de diamètre et de longueur plus ou moins importants.
• Les colorants du sirop de menthe ont été extraits à l'aide d'un morceau de laine préalablement lavé en
milieu basique dans une solution d'ammoniac à 1% d'ammoniaque, puis rincé à l'eau. L'extraction se fait en
milieu acide à l'aide d'acide acétique dilué, et le relargage s'effectue en milieu basique dans la solution
ammoniacale à 1%.

Mise en place du matériel

La réalisation d'une colonne impose de respecter certaines règles qui permettront une séparation
efficace.

On place tout d'abord un morceau de coton au fond de la colonne que l'on recouvre d'éluant, afin
d'éliminer l'air emprisonné dans le coton. On rajoute un demi centimètre du sable environ au dessus du
coton, afin que la phase stationnaire ne puisse pas s'échapper de la colonne. On considérera ici que le sable
n'a pas de propriétés adsorbantes.

Enfin, on remplit la colonne avec la phase stationnaire en réalisant une suspension de silice dans le
premier éluant qui est l'eau salée. Le gel ainsi formé est introduit dans la colonne grâce à l'entonnoir. On
rince avec l'éluant et on le laisse s'écouler.

Une fois la colonne remplie, on rajoute un demi centimètre de sable en tête de colonne au dessus de
la surface de silice, après s'être assuré que cette dernière était plane. Cette couche permet de réaliser des
dépôts et d'ajouter de l'éluant sans perturber la surface de silice, ce qui empêcherait une bonne séparation.
On s'assure régulièrement de ne pas assécher la phase stationnaire, en vérifiant qu'il reste toujours de l'éluant
au niveau du sable.

Réalisation de l'expérience

On amène le niveau d'éluant au niveau de la surface du sable. On peut alors déposer délicatement la
solution de colorants en haut de colonne à la pipette Pasteur afin de ne pas perturber la surface de silice.

On ouvre le robinet pour que les colorants arrivent au niveau de la silice. On rajoute quelques
millilitres d'éluant et on ouvre de nouveau le robinet afin de s'assurer que toute la solution soit en tête de la
colonne de silice.

On peut alors ajouter l'éluant. Les premiers millilitres doivent toujours être ajoutés avec précaution à
la pipette pasteur afin de ne pas perturber la surface de silice. Ensuite, on peut ajouter l'éluant plus
rapidement en le versant directement dans la colonne.
 L'éluant utilisé ici dans un premier temps est l'eau salée, il permet l'élution de la tartrazine , alors que
le bleu patenté V reste fortement retenu par la silice. Après avoir récupéré la tartrazine, on change d'éluant
pour récupérer le bleu patenté.

On utilise ici de l'éthanol. En effet, la tartrazine a peu d'affinité pour la silice par rapport à l'éluant,
qu'on utilise l'eau salée ou l'éthanol. C'est pourquoi elle est entraînée facilement. Par contre, le bleu patenté
V développe plus d'interaction avec la silice que la tartrazine, et l'eau salée n'est alors pas un éluant capable
de l'entraîner, contrairement à l'éthanol.

Le bleu patenté est entraîné par la phase mobile, et il est récupéré dans un autre tube. Il est souvent
utile de réaliser des chromatographies sur couche mince sur chaque tube pour vérifier où sont les composés à
séparer, dans le cas où ceux-ci ne sont pas colorés.

Préparation de la colonne

Attention à ne pas sécher la silice! Régler le débit d’air: 1-2 gouttes/sec.

Procédée de séparation

Soit deux produits de polarités différentes (rouge et vert) qui migrent à travers une colonne de silice polaire.
Le plus polaire sera retenu et le mois polaire sera facilement élué.

Le composé rouge est moins polaire donc moins retenu, il sera élué en premier tandis que le
composé vert est plus polaire donc plus retenu, il sera élué en dernier en deuxième position
Spectroscopie d'absorption

La spectroscopie d'absorption est une technique d’analyse spectrale qui étudie les absorptions ou les émissions
de la radiation par l'atome libre. Les éléments inorganiques (métaux et non métaux) contenus dans un
échantillon sont identifiés et quantifiés grâce à leur spectre atomique.

Les principales techniques de spectroscopie d'absorption

- L’absorption/ émission atomique de flamme SAAF/SEAF

- L’absorption atomique électrothermique SAAE
- L'émission atomique en plasma couplé induit haute fréquence ICP-ES
- L'émission d'arc ou d'étincelle

Le choix de la méthode se fera selon le type d’information que l’on désire obtenir mais aussi selon le type
d’échantillon à analyser. Du fait du processus d’atomisation, toutes ces méthodes sont destructives. Elles
permettent l’analyse de plus de 70 éléments en phase liquide, solide ou gazeuse et la limite de détection peut
varier entre ppm et ppb. Bien qu’il soit possible en théorie de traiter tous les éléments du tableau périodique, les
limitations technologiques ne permettent pas, d’obtenir des résultats satisfaisants pour l’hydrogène, l’azote,
l’oxygène, les hallogènes et les gaz rares.
Spectroscopie d'absorption atomique

Principes de fonctionnement

Les techniques de spectroscopie d'absorption atomique (AAS) reposent sur le fait qu'un élément atomisé
absorbera la lumière d'une longueur d'onde caractéristique, le faisant quitter l'état fondamental vers un état
excité. La quantité d'énergie lumineuse absorbée est proportionnelle au nombre d'atomes analytes dans le trajet
optique. La technique est étalonnée en introduisant des concentrations connues d'atomes analytes dans le trajet
optique et en faisant un graphique d'absorption par rapport à la concentration

Spectrophotomètre d'absorption atomique

• La lampe émet de la lumière pour l'élément d'intérêt

• L'atomiseur convertit l'échantillon liquide en atomes libres qui absorbent l'énergie de la lampe
• Le monochromateur sélectionne la longueur d'onde utilisée pour la mesure
• Le détecteur mesure la lumière absorbée par les atomes libres

Lampe

La source de lumière premièrement utilisée avec la technique d'absorption atomique est la lampe à cathode
creuse (HCL).
Généralement, chaque lampe est dédiée à l'analyse d'un seul élément, bien que dans certains cas, certains
éléments peuvent être combinés dans une seule lampe.

À cause de cette limitation, l'absorption atomique est généralement utilisée pour l'analyse soit d'un seul élément
soit d'un faible nombre d'éléments.

Composition générale d’une lampe à cathode creuse Cathode

Atomiseur

L'atomisation est le processus qui convertit un échantillon liquide en atomes libres. Le schéma montre les
différentes étapes qui ont lieu durant l'atomisation, en commençant par la préparation en solution de l'élément.
L'élément M subit différentes étapes :

• Solution : MAliquide (composé)

• Nébulisation : MAliquide (composé)
• Désolvatation : MAsolide (A = solution anionique)
• Vaporisation : MAgaz
• Atomisation : M0
• Excitation : M*
• Ionisation M+
Atomiseur

- Les atomes peuvent absorber de faibles quantités d'énergie :

• Chaleur
• Lumière à certaines longueurs d'onde
Un électron peut changer de niveau d'énergie
• Un atome peut absorber (absorption) ou émettre (émission) de l'énergie.
• L'atome devient « excité »
• L’excitation est expliquée par la transition d’un électron d’une orbite interne (faible énergie) vers une orbite
externe (haute énergie).

Atomiseur flamme AAS

Dans l'AAS flamme (SAAF), l'échantillon est préparé sous forme de liquide et nébulisé dans la flamme.

La caractéristique fondamentale de cette technique est l'atomisation qui survient dans la flamme.

Spectroscopie d'absorption atomique flamme

Avantages

•Temps d'analyse plus court possible

• Bonne précision
• Facile d’utilisation
• Bon marché

Limitations

• Sensibilité
• Gamme dynamique
• Nécessite des gaz inflammables
• L'opération sans surveillance n'est pas possible à cause des gaz inflammables
• Ne doit pas contenir de quantités excessives de sels dissous
Spectroscopie d'émission atomique

Généralités

À cause des limitations de la SAA, les techniques ne nécessitant pas de lampes dédiées pour chaque élément
ont été utilisées. Ces techniques, appelées spectroscopie d'émission atomique (AES), se basent sur le fait qu'une
fois qu'un atome d'un élément spécifié est excité (comme dans l'absorption atomique), il émet de la lumière
dans un schéma caractéristique de longueurs d'onde (un spectre d'émission) lorsqu'il retourne à l'état
fondamental.

La flamme n'est pas une source d'excitation idéale pour l'émission atomique. Des sources plus chaudes sont
donc utilisées.

Nous allons parler des techniques suivantes :

• Spectroscopie d'émission atomique à plasma micro-ondes (MP-AES)

• Spectroscopie d'émission optique à plasma induit (ICP-OES )

Spectroscopie d’émission optique à plasma induit

Principes de fonctionnement

Un plasma d’argon induit (plus chaud que le plasma d’azote du MP, jusqu'à 10 000 oK) est utilisé pour
désolvater, atomiser et exciter les atomes dans l'échantillon liquide qui a été nébulisé dedans.

L'intensité de la lumière émise est mesurée en utilisant la détection optique aux longueurs d'onde
caractéristiques des éléments d'intérêt.

ICP-OES est capable de mesurer l'émission atomique et ionique afin que plus de longueurs d'onde soient
contrôlées

Ces mesures peuvent être comparées à un étalon pour quantifier la concentration des éléments dans
l'échantillon.

ICP- OES

Avantages

• Cadence d'analyse la plus rapide

• Analyse multi-élémentaire simultanée (jusqu'à 73 éléments)
• Large gamme dynamique (de niveau sous-ppb à %)
• Tolère des matrices complexes
• Faible consommation de gaz argon
• Sûr (aucun gaz inflammable)

Limitations

• Coûts initiaux supérieurs à la spectroscopie d'absorption atomique ou au MP-AES

• Plus d'interférences spectrales par rapport au MP-AES
• Pas aussi sensible que la spectrométrie d’absorption atomique four graphite ou l'ICP-MS
• Pas de détermination d'isotope

Spectroscopie d’émission optique à plasma induit Installation générale

La torche à plasma peut être visualisée axialement ou radialement. Certains instruments « double visée »
permettent de visualiser les deux orientations, selon l'analyse réalisée. (La visée axiale donne un trajet optique
plus long et donc une meilleure sensibilité.)
Introduction à la spectroscopie UV-Visible

La spectroscopie UV-Visible permet d’accéder qualitativement à des renseignements quant à la nature des
liaisons présentes au sein de l’échantillon mais également de déterminer quantitativement la concentration
d’espèces absorbant dans ce domaine spectral. Non destructive et rapide, cette spectroscopie est largement
répandue en travaux pratiques de chimie ainsi qu'en analyse chimique ou biochimique.

1. Présentation

La nature de l’atome fait l’objet depuis des siècles de nombreuses tentatives de modélisation. A partir du
XXème siècle, cette quête de l’infiniment petit a été marquée par la course effrénée entre les équipes de
théoriciens qui, cherchant à unifier les différentes interactions fondamentales, prédisent l’existence de
nombreuses particules élémentaires, et celles des expérimentateurs qui construisent des dispositifs complexes
afin de prouver leur présence. La dernière particule élémentaire, le boson de Higgs, a ainsi été observée très
récemment par le CERN, mettant un terme à des mois de suspense et validant la théorie unifiée des interactions
fondamentales.

2. Principe de la spectroscopie UV - Visible

L’interaction électromagnétique est l’une des interactions concernées par ce modèle unifié. Elle rend compte de
l’interaction entre une onde électromagnétique et une particule chargée. L’interaction matière-rayonnement en
est une illustration parfaite. A l’échelle atomique, la matière n’étant pas continue mais constituée d’assemblage
de particules élémentaires, l’énergie ne l’est pas non plus et ne peut prendre que des valeurs discrètes. L’énergie
totale d’un édifice atomique peut se mettre sous la forme de la somme suivante :

E = Eél + Evib + Erot

Eél représente l’énergie électronique, Evib l’énergie vibrationnelle, et Erot l’énergie rotationnelle.

Les trois premières sont de nature quantique, et par conséquent quantifiées.

L’interaction électromagnétique caractérise l’aptitude d’un édifice atomique à voir son énergie modifiée par
l’action d’un rayonnement électromagnétique. Soit un système atomique pouvant être caractérisé par deux
niveaux énergétiques quantifiés E1 et E2 (avec arbitrairement E1 < E2). Si le rayonnement électromagnétique
permet de passer du niveau E1 au niveau E2, le système doit acquérir de l’énergie. On parle alors d’absorption.
A contrario, le passage du niveau E2 au niveau E1 conduit à une libération d’énergie, il s’agit d’émission.
L’absorption ou l’émission d’énergie se fait alors sous forme d’onde électromagnétique, dont l’énergie dépend
fortement de l’ordre de grandeur de la différence d’énergie entre les deux états, notée ΔE, et donc
intrinsèquement de la nature des niveaux concernés.
Les ordres de grandeurs des transitions énergétiques présentées dans le tableau précédent illustrent le fait que
les niveaux rotationnels sont des sous-structures des niveaux vibrationnels, eux-mêmes sous-divisions des
niveaux électroniques. Cette structuration complexe des niveaux énergétiques permet donc un très grand
nombre de transitions sous l’effet d’un rayonnement électromagnétique.

La fréquence ν du rayonnement émis ou absorbé et l’écart énergétique ΔE entre les niveaux initiaux et finaux
sont reliés par la relation de Planck-Einstein : Δ = ℎν , avec h la constante de Planck (h = 6,63.10-34 J.s).

Or, dans le vide, fréquence ν et longueur d’onde λ sont liées par la célérité de la lumière c : ν = c/λ. On en
déduit alors la relation entre ΔE et λ :

Δ E = ℎc/λ.

On ne s’intéressera ici qu’aux transitions énergétiques absorbant ou émettant dans l’UV - Visible, c'est-à-dire
mettant en jeu des transitions entre niveaux électroniques (mais modifiant évidemment les sous-structures
vibrationnelles et rotationnelles). Ces niveaux électroniques correspondant à différentes configurations
électroniques, le mécanisme d’absorption sera ainsi dû à l’excitation d’électrons de valence et l’émission à leur
désexcitation.

D’un point de vue expérimental, la longueur d’onde (ou la fréquence) d’un rayonnement électromagnétique
absorbé est donc caractéristique de la différence d’énergie entre deux niveaux électroniques. La spectroscopie
d’absorption, conduisant expérimentalement à la détermination des longueurs d’ondes absorbées, permet ainsi
d’obtenir les écarts ΔE entre niveau électroniques et par conséquent des renseignements sur la structure
électronique de l’édifice. On ne s’intéressera par la suite qu’à la spectroscopie d’absorption.

3. Appareillage et Fonctionnement

La détermination des longueurs d’onde des rayonnements électromagnétiques absorbés se fait grâce à
l’utilisation d’un spectrophotomètre. L’appareil le plus utilisé en lycée est le spectrophotomètre mono-faisceau,
dont le schéma de principe est présenté ci-dessous :
Une source polychromatique (émettant dans l’UV ou le visible) est placée devant un prisme. Ce système
dispersif va décomposer le rayonnement polychromatique émis par la source. En orientant correctement le
système diaphragme-échantillon-photodétecteur, la solution contenue dans la cuve sera irradiée avec un
rayonnement quasi monochromatique. Le diaphragme, une simple fente fine, permet d’éclairer l’échantillon
avec un faisceau de faible largeur, donc de bonne qualité monochromatique, le photodétecteur mesurant quant à
lui l’intensité du rayonnement transmis après traversée de la solution échantillon, notée It,λ.

D’un point de vue pratique, l’échantillon est constitué de l’édifice à étudié, dissous dans un solvant et contenu
dans une cuve. Il faut donc que solvant et cuve n’interfèrent pas dans les données mesurées. Ainsi on les
choisira transparents dans le domaine choisi. Dans le commerce, il existe différentes cuves adaptées aux
différents domaines spectraux rencontrés (plastique pour le visible, quartz de plus ou moins bonne qualité pour
l’UV). Pour ce qui est du solvant, son influence est neutralisée en réalisant un blanc, c'est-à-dire en mesurant
l’intensité du rayonnement transmis après traversée de la cuve ne contenant que du solvant. Les échantillons
doivent être transparents afin d’éviter tout phénomène de diffusion : ne pourront être analysées que les solutions
limpides dans des cuves propres.

Expérimentalement, l’appareil extrait comme donnée brute l’intensité It,λ, obtenue après traversée de la solution.
Celle-ci étant dépendante de la source, on préfère calculer deux grandeurs dérivées : l’absorbance A et la
transmittance T.
La transmittance T est définie par : T = It,λ / I0,λ. On l’exprime en pourcentage.

L’absorbance A se calcule par : A = log(I0,λ /It,λ) = - logT. C’est une grandeur positive.

4. Étude Qualitative en UV-Visible

Dans une étude spectrophotométrique UV-Visible, il est d’usage de tracer le graphe de l’absorbance A en
fonction de la longueur d’onde λ.

Par exemple, le spectre de la (1E,4E)-1,5-di-2-thienylpenta-1,4-dien-3-one (D2TDO) est représenté ci-

dessous (25°C, acétonitrile) :

On remarque le spectre est constitué de bandes larges, et non de pics. De nombreuses transitions
énergétiquement proches sont donc réalisées. Or si les transitions électroniques sont bien responsables de ces
absorptions, les sous-structures vibrationnelles et rotationnelles, au sein d’un même niveau électronique,
peuvent conduire à des transitions énergétiquement du même ordre de grandeur, partant et aboutissant aux
même niveaux électroniques mais mettant en jeu des niveaux vibrationnels et rotationnels différents. Différents
rayonnements électromagnétiques de longueurs d’ondes légèrement différentes conduisent alors à différentes
transitions énergétiquement très proches et ainsi à des bandes d’absorption.

L’analyse d’un tel spectre mène à la détermination de la longueur d’onde du maximum d’absorption λ max. Dans
l’exemple précédent, celle-ci est de 360 nm. Cependant, la donnée d’une telle longueur d’onde ne renseigne pas
sur l’intensité de l’absorbance. Une donnée intensive et quantitative est nécessaire. Celle-ci est fournie par la loi
de Beer-Lambert : pour une solution contenant une unique solution absorbante, A=ε.l.c, avec l la largeur de la
cuve contenant l’échantillon (donc la longueur du chemin optique), c la concentration molaire de l’échantillon
et ε le coefficient d’extinction molaire (exprimé usuellement en mol-1.L.cm-1 si l est exprimée en cm). Cette loi
est valable pour les solutions transparentes, peu concentrées et dans ces conditions elle est également additive.
Ainsi, la relation de linéarité est valide tant que l’absorbance garde des valeurs faibles (typiquement A
inférieure à 1,5-2).

La relation de Beer-Lambert donne donc accès au coefficient d’extinction molaire ε qui caractérise l’absorption
de l’édifice dans les conditions de l’expérience. Ainsi, il dépend de la température, de l’édifice et du solvant
dans lequel est enregistré le spectre. En se plaçant à la longueur d’onde du maximum d’absorption, les
coefficient εmax peut être calculé. La donnée de ces deux grandeurs (λmax ; εmax) est caractéristique de
l’absorption d’un édifice dans des conditions expérimentales données, mais ne dépend pas de l’appareil utilisé.

5. Analyse de l'absorption

L’absorption provient d’une transition énergétique entre deux niveaux électroniques dont la nature joue
fortement sur les deux grandeurs λmax et εmax. Dans le cas de molécules organiques les niveaux électroniques
concernés par des transitions dans l’UV-Visible correspondent grossièrement aux orbitales de valence de
l’édifice et leur énergie est dépendante de leur nature (σ, π) et de leur caractère (liante, antiliante, non liante).
Schématiquement, l’ordre relatif des niveaux électroniques est le suivant :
De nombreuses transitions sont donc possibles mais seules celles de plus faibles énergies conduisent à une
absorption dans l’UV-Visible. La nature σ ou π des niveaux impliqués reflètent la nature du groupe fonctionnel
présent dans l’édifice. Certaines fonctions organiques provoqueront donc une absorption, ce sont des
chromophores. L’enregistrement d’un spectre UV-Visible peut donc, à l’instar de la spectroscopie Infrarouge,
conduire à l’identification des fonctions présentes dans une molécule organique. Les ordres de grandeurs de
nombreux chromophores caractéristiques sont tabulés :

Chromophore Transition λmax

Alcène π-π* 175
Alcool n- σ* 180
π-π* 180
Aldéhyde - Cétone
n-π* 280
Acide carboxylique n-π* 205
Nitro n-π* 271

La présence de liaisons multiples et de doublets non liants permet en général une bonne absorption dans l’UV-
Visible. De plus, la conjugaison du système π conduit à un resserrement des niveaux π et π* et par conséquent
une augmentation du λmax. Il s’agit de l’effet bathochrome. Si les alcènes absorbent de façon caractéristique
dans l’UV, les polyènes voient leur λmax augmenter avec le nombre de liaisons π conjuguées pour finir par
atteindre le domaine du visible pour les grandes molécules conjuguées. Ainsi, le β-carotène, contenant 11
liaisons C=C conjuguées, a son maximum d’absorption vers 450 nm.

Une solution de β-carotène absorbant dans le bleu, elle ne laisse passer que les radiations peu absorbées et
apparait alors de sa couleur complémentaire, l’orange.

Dans le cas des complexes des métaux de transitions, les transitions électroniques sont réalisées entre orbitales
d, dont la dégénérescence a été levée par les ligands. Il s’agit alors de transitions d-d, en général peu intenses et
qui conduisent souvent à des absorptions dans le visible. C’est le cas par exemple des complexes hexaaqua des
métaux : [Cu(H2O)6]2+ (bleu), [Ni(H2O)6]2+ (vert)…

6. Conclusion

La spectroscopie UV-Visible permet ainsi d’accéder qualitativement à des renseignements quant à la nature des
liaisons présentes au sein de l’échantillon (via l’ordre de grandeur de λmax et εmax) mais également de déterminer
quantitativement la concentration d’espèces absorbant dans ce domaine spectral (via la loi de Beer-Lambert).
Non destructive et rapide, cette spectroscopie est largement répandue en travaux pratiques de chimie (après
construction d’une droite d’étalonnage et report d’une mesure expérimentale) ainsi qu'en analyse chimique ou
biochimique. On peut citer par exemple le dosage des ions nitrates dans les eaux de piscine (après adjonction
d’un additif formant un complexe coloré) ou la détermination de la pureté de l’ADN et de certaines protéines
après leur extraction.
Introduction à la spectroscopie UV-Visible

La spectroscopie UV-Visible permet d’accéder qualitativement à des renseignements quant à la nature des
liaisons présentes au sein de l’échantillon mais également de déterminer quantitativement la concentration
d’espèces absorbant dans ce domaine spectral. Non destructive et rapide, cette spectroscopie est largement
répandue en travaux pratiques de chimie ainsi qu'en analyse chimique ou biochimique.

1. Présentation

La nature de l’atome fait l’objet depuis des siècles de nombreuses tentatives de modélisation. A partir du
XXème siècle, cette quête de l’infiniment petit a été marquée par la course effrénée entre les équipes de
théoriciens qui, cherchant à unifier les différentes interactions fondamentales, prédisent l’existence de
nombreuses particules élémentaires, et celles des expérimentateurs qui construisent des dispositifs complexes
afin de prouver leur présence. La dernière particule élémentaire, le boson de Higgs, a ainsi été observée très
récemment par le CERN, mettant un terme à des mois de suspense et validant la théorie unifiée des interactions
fondamentales.

2. Principe de la spectroscopie UV - Visible

L’interaction électromagnétique est l’une des interactions concernées par ce modèle unifié. Elle rend compte de
l’interaction entre une onde électromagnétique et une particule chargée. L’interaction matière-rayonnement en
est une illustration parfaite. A l’échelle atomique, la matière n’étant pas continue mais constituée d’assemblage
de particules élémentaires, l’énergie ne l’est pas non plus et ne peut prendre que des valeurs discrètes. L’énergie
totale d’un édifice atomique peut se mettre sous la forme de la somme suivante :

E = Eél + Evib + Erot

Eél représente l’énergie électronique, Evib l’énergie vibrationnelle, et Erot l’énergie rotationnelle.

Les trois premières sont de nature quantique, et par conséquent quantifiées.

L’interaction électromagnétique caractérise l’aptitude d’un édifice atomique à voir son énergie modifiée par
l’action d’un rayonnement électromagnétique. Soit un système atomique pouvant être caractérisé par deux
niveaux énergétiques quantifiés E1 et E2 (avec arbitrairement E1 < E2). Si le rayonnement électromagnétique
permet de passer du niveau E1 au niveau E2, le système doit acquérir de l’énergie. On parle alors d’absorption.
A contrario, le passage du niveau E2 au niveau E1 conduit à une libération d’énergie, il s’agit d’émission.
L’absorption ou l’émission d’énergie se fait alors sous forme d’onde électromagnétique, dont l’énergie dépend
fortement de l’ordre de grandeur de la différence d’énergie entre les deux états, notée ΔE, et donc
intrinsèquement de la nature des niveaux concernés.
Les ordres de grandeurs des transitions énergétiques présentées dans le tableau précédent illustrent le fait que
les niveaux rotationnels sont des sous-structures des niveaux vibrationnels, eux-mêmes sous-divisions des
niveaux électroniques. Cette structuration complexe des niveaux énergétiques permet donc un très grand
nombre de transitions sous l’effet d’un rayonnement électromagnétique.

La fréquence ν du rayonnement émis ou absorbé et l’écart énergétique ΔE entre les niveaux initiaux et finaux
sont reliés par la relation de Planck-Einstein : Δ = ℎν , avec h la constante de Planck (h = 6,63.10-34 J.s).

Or, dans le vide, fréquence ν et longueur d’onde λ sont liées par la célérité de la lumière c : ν = c/λ. On en
déduit alors la relation entre ΔE et λ :

Δ E = ℎc/λ.

On ne s’intéressera ici qu’aux transitions énergétiques absorbant ou émettant dans l’UV - Visible, c'est-à-dire
mettant en jeu des transitions entre niveaux électroniques (mais modifiant évidemment les sous-structures
vibrationnelles et rotationnelles). Ces niveaux électroniques correspondant à différentes configurations
électroniques, le mécanisme d’absorption sera ainsi dû à l’excitation d’électrons de valence et l’émission à leur
désexcitation.

D’un point de vue expérimental, la longueur d’onde (ou la fréquence) d’un rayonnement électromagnétique
absorbé est donc caractéristique de la différence d’énergie entre deux niveaux électroniques. La spectroscopie
d’absorption, conduisant expérimentalement à la détermination des longueurs d’ondes absorbées, permet ainsi
d’obtenir les écarts ΔE entre niveau électroniques et par conséquent des renseignements sur la structure
électronique de l’édifice. On ne s’intéressera par la suite qu’à la spectroscopie d’absorption.

3. Appareillage et Fonctionnement

La détermination des longueurs d’onde des rayonnements électromagnétiques absorbés se fait grâce à
l’utilisation d’un spectrophotomètre. L’appareil le plus utilisé en lycée est le spectrophotomètre mono-faisceau,
dont le schéma de principe est présenté ci-dessous :
Une source polychromatique (émettant dans l’UV ou le visible) est placée devant un prisme. Ce système
dispersif va décomposer le rayonnement polychromatique émis par la source. En orientant correctement le
système diaphragme-échantillon-photodétecteur, la solution contenue dans la cuve sera irradiée avec un
rayonnement quasi monochromatique. Le diaphragme, une simple fente fine, permet d’éclairer l’échantillon
avec un faisceau de faible largeur, donc de bonne qualité monochromatique, le photodétecteur mesurant quant à
lui l’intensité du rayonnement transmis après traversée de la solution échantillon, notée It,λ.

D’un point de vue pratique, l’échantillon est constitué de l’édifice à étudié, dissous dans un solvant et contenu
dans une cuve. Il faut donc que solvant et cuve n’interfèrent pas dans les données mesurées. Ainsi on les
choisira transparents dans le domaine choisi. Dans le commerce, il existe différentes cuves adaptées aux
différents domaines spectraux rencontrés (plastique pour le visible, quartz de plus ou moins bonne qualité pour
l’UV). Pour ce qui est du solvant, son influence est neutralisée en réalisant un blanc, c'est-à-dire en mesurant
l’intensité du rayonnement transmis après traversée de la cuve ne contenant que du solvant. Les échantillons
doivent être transparents afin d’éviter tout phénomène de diffusion : ne pourront être analysées que les solutions
limpides dans des cuves propres.

Expérimentalement, l’appareil extrait comme donnée brute l’intensité It,λ, obtenue après traversée de la solution.
Celle-ci étant dépendante de la source, on préfère calculer deux grandeurs dérivées : l’absorbance A et la
transmittance T.
La transmittance T est définie par : T = It,λ / I0,λ. On l’exprime en pourcentage.

L’absorbance A se calcule par : A = log(I0,λ /It,λ) = - logT. C’est une grandeur positive.

4. Étude Qualitative en UV-Visible

Dans une étude spectrophotométrique UV-Visible, il est d’usage de tracer le graphe de l’absorbance A en
fonction de la longueur d’onde λ.

Par exemple, le spectre de la (1E,4E)-1,5-di-2-thienylpenta-1,4-dien-3-one (D2TDO) est représenté ci-

dessous (25°C, acétonitrile) :

On remarque le spectre est constitué de bandes larges, et non de pics. De nombreuses transitions
énergétiquement proches sont donc réalisées. Or si les transitions électroniques sont bien responsables de ces
absorptions, les sous-structures vibrationnelles et rotationnelles, au sein d’un même niveau électronique,
peuvent conduire à des transitions énergétiquement du même ordre de grandeur, partant et aboutissant aux
même niveaux électroniques mais mettant en jeu des niveaux vibrationnels et rotationnels différents. Différents
rayonnements électromagnétiques de longueurs d’ondes légèrement différentes conduisent alors à différentes
transitions énergétiquement très proches et ainsi à des bandes d’absorption.

L’analyse d’un tel spectre mène à la détermination de la longueur d’onde du maximum d’absorption λ max. Dans
l’exemple précédent, celle-ci est de 360 nm. Cependant, la donnée d’une telle longueur d’onde ne renseigne pas
sur l’intensité de l’absorbance. Une donnée intensive et quantitative est nécessaire. Celle-ci est fournie par la loi
de Beer-Lambert : pour une solution contenant une unique solution absorbante, A=ε.l.c, avec l la largeur de la
cuve contenant l’échantillon (donc la longueur du chemin optique), c la concentration molaire de l’échantillon
et ε le coefficient d’extinction molaire (exprimé usuellement en mol-1.L.cm-1 si l est exprimée en cm). Cette loi
est valable pour les solutions transparentes, peu concentrées et dans ces conditions elle est également additive.
Ainsi, la relation de linéarité est valide tant que l’absorbance garde des valeurs faibles (typiquement A
inférieure à 1,5-2).

La relation de Beer-Lambert donne donc accès au coefficient d’extinction molaire ε qui caractérise l’absorption
de l’édifice dans les conditions de l’expérience. Ainsi, il dépend de la température, de l’édifice et du solvant
dans lequel est enregistré le spectre. En se plaçant à la longueur d’onde du maximum d’absorption, les
coefficient εmax peut être calculé. La donnée de ces deux grandeurs (λmax ; εmax) est caractéristique de
l’absorption d’un édifice dans des conditions expérimentales données, mais ne dépend pas de l’appareil utilisé.

5. Analyse de l'absorption

L’absorption provient d’une transition énergétique entre deux niveaux électroniques dont la nature joue
fortement sur les deux grandeurs λmax et εmax. Dans le cas de molécules organiques les niveaux électroniques
concernés par des transitions dans l’UV-Visible correspondent grossièrement aux orbitales de valence de
l’édifice et leur énergie est dépendante de leur nature (σ, π) et de leur caractère (liante, antiliante, non liante).
Schématiquement, l’ordre relatif des niveaux électroniques est le suivant :
De nombreuses transitions sont donc possibles mais seules celles de plus faibles énergies conduisent à une
absorption dans l’UV-Visible. La nature σ ou π des niveaux impliqués reflètent la nature du groupe fonctionnel
présent dans l’édifice. Certaines fonctions organiques provoqueront donc une absorption, ce sont des
chromophores. L’enregistrement d’un spectre UV-Visible peut donc, à l’instar de la spectroscopie Infrarouge,
conduire à l’identification des fonctions présentes dans une molécule organique. Les ordres de grandeurs de
nombreux chromophores caractéristiques sont tabulés :

Chromophore Transition λmax

Alcène π-π* 175
Alcool n- σ* 180
π-π* 180
Aldéhyde - Cétone
n-π* 280
Acide carboxylique n-π* 205
Nitro n-π* 271

La présence de liaisons multiples et de doublets non liants permet en général une bonne absorption dans l’UV-
Visible. De plus, la conjugaison du système π conduit à un resserrement des niveaux π et π* et par conséquent
une augmentation du λmax. Il s’agit de l’effet bathochrome. Si les alcènes absorbent de façon caractéristique
dans l’UV, les polyènes voient leur λmax augmenter avec le nombre de liaisons π conjuguées pour finir par
atteindre le domaine du visible pour les grandes molécules conjuguées. Ainsi, le β-carotène, contenant 11
liaisons C=C conjuguées, a son maximum d’absorption vers 450 nm.

Une solution de β-carotène absorbant dans le bleu, elle ne laisse passer que les radiations peu absorbées et
apparait alors de sa couleur complémentaire, l’orange.

Dans le cas des complexes des métaux de transitions, les transitions électroniques sont réalisées entre orbitales
d, dont la dégénérescence a été levée par les ligands. Il s’agit alors de transitions d-d, en général peu intenses et
qui conduisent souvent à des absorptions dans le visible. C’est le cas par exemple des complexes hexaaqua des
métaux : [Cu(H2O)6]2+ (bleu), [Ni(H2O)6]2+ (vert)…

6. Conclusion

La spectroscopie UV-Visible permet ainsi d’accéder qualitativement à des renseignements quant à la nature des
liaisons présentes au sein de l’échantillon (via l’ordre de grandeur de λmax et εmax) mais également de déterminer
quantitativement la concentration d’espèces absorbant dans ce domaine spectral (via la loi de Beer-Lambert).
Non destructive et rapide, cette spectroscopie est largement répandue en travaux pratiques de chimie (après
construction d’une droite d’étalonnage et report d’une mesure expérimentale) ainsi qu'en analyse chimique ou
biochimique. On peut citer par exemple le dosage des ions nitrates dans les eaux de piscine (après adjonction
d’un additif formant un complexe coloré) ou la détermination de la pureté de l’ADN et de certaines protéines
après leur extraction.
I - DOMAINE UV-VISIBLE

Le domaine UV-visible s'étend environ de 10 à 800 nm : UV-lointain : 10 nm - 200nm. proche-UV : 200 nm

- 400 nm visible : 400 nm (indigo) - 800 nm (rouge)

II - PRINCIPE ET REGLES DE SELECTION

Une transition UV-visible correspond à un saut d’un électron d’une orbitale moléculaire fondamentale occupée
à une orbitale moléculaire excitée vacante. La matière absorbe alors un photon dont l'énergie correspond à la
différence d'énergie entre ces niveaux fondamental et excité.

Toutes les transitions énergétiquement possibles ne sont pas permises. Les transitions permises sont celles qui
provoquent une variation du moment dipolaire électrique.

III - SPECTRE D’ABSORPTION UV-Visible

Un spectre UV-Visible est le tracé de l’absorbance en fonction de la longueur d’onde (en nm). La bande
d'absorption est caractérisée par sa position en longueur d'onde (λmax) et par son intensité reliée au coefficient
d’extinction molaire εmax (A = ε l C) ; la valeur de ε peut indiquer si la transition est permise ou interdite.

IV - LES DIFFERENTS TYPES DE TRANSITIONS ELECTRONIQUES

Les transitions électroniques correspondent au passage des électrons des orbitales moléculaires liantes ou non
liantes remplies, vers des orbitales moléculaires antiliantes non remplies :

L’absorption d’un photon dans le domaine UV-visible correspond à des électrons appartenant à de petits
groupes d’atomes appelés chromophores (C=C, C=O, C=N, N…). La longueur d’onde d’absorption dépend de
la nature des orbitalesC, CC mises en jeu.

IV.1 - Transition σ σ*

La grande stabilité des liaisons σ des composés organiques fait que la transition d'un électron d'une OM liante σ
vers une OM antiliante σ* demande beaucoup d'énergie. La bande correspondante est intense et située dans
l’UV-lointain, vers 130 nm.
IV.2 - Transition n σ*

Le transfert d'un électron du doublet n d’un hétéroatome (O, N, S, Cl..) à un niveau σ* est observé pour les
alcools, les éthers, les amines ainsi que pour les dérivés halogénés. Cette transition donne une bande d'intensité
moyenne qui se situe à l'extrême limite du proche-UV.

IV.3 - Transition π π*

La transition électronique dans les composés possédant une double liaison isolée conduit à une forte bande
d'absorption vers 165-200 nm.

IV.4 - Transition n π*

Cette transition résulte du passage d'un électron d'une OM non-liante n à une OM antiliante π*. Ce type de
transition a lieu dans le cas des molécules comportant un hétéroatome porteur de doublets électroniques libres
appartenant à un système insaturé. La bande correspondante est faible car la transition est interdite.
V - LOI DE BEER-LAMBERT

Lorsque la lumière arrive sur un milieu homogène de longueur l (trajet optique), une partie de cette lumière
incidente notée I0 est absorbée par le milieu et le reste, noté I, est transmis. La fraction de la lumière incidente
absorbée par une substance de concentration C contenue dans une cuve de longueur l est donnée par la loi de
Beer-Lambert :

A = log (I0/I) = ε l C.

A : absorbance autrefois appelée densité optique (D.O.)

L : épaisseur de la cuve exprimée en centimètres
ε: coefficient d'extinction. C’est une grandeur caractéristique du composé. Si la concentration est en gramme
par litre, ε est appelé coefficient d'extinction spécifique. Si la concentration est en mole par litre, ε est appelé
coefficient d'extinction molaire.

On définit également la transmission T comme le rapport de l'intensité transmise à l'intensité incidente :

T = I /I0 log (1/T) = A Le pourcentage de la transmission (% T) est la transmittance.

Validité de la loi de Beer-Lambert

- Lumière monochromatique
- Faibles concentrations
- La solution ne doit être ni fluorescente, ni hétérogène (bulles, précipité…)
- La solution n’est pas le siège d’une réaction photochimique.

VI - SPECTRE D’ABSORPTION

L'enregistrement graphique - réalisé par un appareil appelé spectrophotomètre - de la quantité de lumière

absorbée ou transmise par une substance en fonction de la longueur d'onde, de la fréquence ou du nombre
d’onde donne le spectre d'absorption de la substance. Selon une représentation en absorbance ou en
transmittance, on a les allures suivantes :
La position du maximum d'absorption d’une bande correspond à la longueur d'onde de la radiation qui a
provoqué la transition. Quant à l'intensité, elle est liée au moment dipolaire.