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La chromatographie

La chromatographie (du grec ancien khrôma, « couleur » et / graphein, « écrire ») est une
méthode physico-chimique qui sert à séparer les différentes substances présentes dans un
mélange (échantillon en phase homogène liquide ou gazeuse)
L'appareil utilisé pour effectuer certaines chromatographies se nomme chromatographe.
L'image ou le diagramme obtenu par chromatographie est appelé chromatogramme.
Lorsqu'on utilise un chromatographe et un logiciel de chromatographie, le chromatogramme
prend généralement la forme d'un graphique qui traduit la variation d’un paramètre relié à la
concentration du soluté en sortie de colonne, en fonction du temps (ou du volume) d’élution

Le botaniste russe Mikhail Tswett fut, en 1906, le premier à utiliser le


terme« chromatographie ». Tswett utilisait depuis 1903 des colonnes d'adsorption pour
séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot « chromatographie » à
partir du grec ancien khrôma, « couleur » et donc pigment. Toutefois, Tswett ne donna jamais
cette explication, mais tswett est le mot russe pour « couleur ».

En 1906 un chimiste russe, Tswett, a séparé des pigments végétaux colorés sur une colonne
remplie de carbonate de calcium pulvérulent, les pigments étaient entraînés avec de l'éther de
pétrole (mélange pentanes et d’hexanes). Il a observé sur la colonne la formation de bandes
de couleur différente (vert, orange, jaune..). Il a donné à cette technique le nom de
chromatographie (écriture des couleurs). Il a défini également les termes : chromatogramme,
élution, rétention.
Cette technique fut quasi-abandonnée jusqu'en 1930, où Edgar Lederer a purifié par la
méthode de Tswett la lutéine du jaune d’œuf.
Vers 1940, Martin et Synge développent la pratique et la théorie de la chromatographie, ils
obtiennent le prix Nobel en 1952
En 1952, mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).
En 1968, mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC
en anglais.

La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile
(ou éluant) à travers une phase stationnaire (ou phase fixe).

La phase stationnaire, fixée soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface
plane, retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon
l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals,
les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase
stationnaire.

Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par
la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase
stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

Les différents types de chromatographie


• chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ;
• chromatographie enphase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV
(chromatographie en phase vapeur) ;
• chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ;
• chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ;

La chromatographie en phase gazeuse

Technique de séparation applicable aux composés gazeux ou susceptibles d’être volatilisés


par élévation de T°. Elle est limitée aux composés thermostables et suffisamment volatils
(MM<300)

➢ Les gels de silice :


C’est la phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie et notamment en C.L.H.P
Le gel de silice est constitué de micro sphères de diamètre sensiblement constant pouvant
varier de 2 à 5 µm.

Les gels de silice sont stables dans une grande gamme de pH mais ils ne supportent pas des
pH trop extrêmes. Il y a des risques de dissolution pour des pH trop acides ou trop basiques,
on se limite donc a la gamme 2 < pH < 12. Des gels spéciaux existent pour une utilisation à
pH extrêmes. La qualité d’un gel dépend de plusieurs paramètres : taille des grains, porosité
ouverte (dimensions et répartition des pores), résistance à l’écrasement, surface spécifique…
Les gels courants pour C.L.H.P ont les caractéristiques suivantes :
2
diamètre de 2 à 5 µm, résistance à l’écrasement sous 1000 bars, surface spécifique 350 m /g,
porosité 0,7 mL / g , taille des pores 10 nm.

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE


PERFORMANCE: H.P.L.C
La chromatographie liquide haute performance est très utilisée dans tous les domaines de la
chimie analytique. Son succès est du au fait qu’il est possible de modifier la résolution en
jouant sur la composition de la phase mobile. Elle utilise des colonnes remplies d’une phase
stationnaire constituée de particules sphériques de très petites dimensions de diamètre
couramment compris entre 2 et 5 µm ce qui conduit à de grandes efficacité et résolution.
L’inconvénient est que plus les particules sont petites et plus il est difficile de faire s’écouler
le solvant, on doit donc utiliser des pompes spéciales qui poussent le solvant sous des
pressions très élevées. A l’origine le P de H.P.L.C correspondait donc au mot Pression. La
grande efficacité de la technique fait que le P désigne actuellement le mot Performance.
Comparaison CPG – HPLC

CPG HPLC

- Séparation en phase gazeuse - Séparation en phase liquide


- Composés volatils et non - Indifférent
thermolabiles - Séparation à température ambiante
- Séparation à température élevée - Grande latitude d’ajustement des
- Sélectivité limitée sélectivités

Ces deux Techniques analytiques sont de routine, Travail sur des quantités infimes de
produits. Domaines d’applications variés. Possibilité de coupler la technique avec d’autres
méthodes analytiques (AA, SM, IRTF…)
Les pompes doivent répondre aux exigences suivantes : fournir des pressions élevées jusqu'à
400 bars. Débit stable, et réglable de 0,1 à 10 mL/min. résistance à la corrosion quelque soit le
solvant utilisé
La pression à imposer dépend des facteurs suivants :
- débit de la phase mobile

- viscosité de l’éluant

- taille des grains de la phase stationnaire

- géométrie de la colonne

La phase normale:
La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc
utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont
retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête.
L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de
silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations.
La phase inverse :
La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8
ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant
polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement
à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la
qualité de la séparation est donc maintenue constante.

Si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ;
Si la phase stationnaire est très peu polaire, on choisira une phase mobile polaire ( le plus
souvent des mélanges de méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en
phase inverse. En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention
des composés.

Chromatographie sur couche mince (CCM)


➢ Définition et appareillage:
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption
: la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase
stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou
d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à
une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.
Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont:
• la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un
couvercle étanche.
• la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée
sur une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté plâtre, l'amidon ou un
polymère organique.
l'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en
un point repère situé au-dessus de la surface de l'éluant. l'éluant : un solvant pur ou un mélange : il
migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l'échantillon.
➢ Principe de la technique.
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve fermée, l'éluant monte
à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de
l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part,
des forces électrostatiques retenant le composant sur la phase stationnaire et, d'autre part, de sa
solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase
stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la phase stationnaire étant principalement
contrôlée par des phénomènes d'adsorption.

Les paramètres de rétention en CPG (voir tirage)