Chromatographie Liquide à Haute Performance- HPLC-

Introductio Les méthodes HPLC représentent l’outil de séparation chromatographique le plus courant (à l’échelle analytique ou
n: préparative). La transition entre la chromatographique sur colonne et l’HPLC s’est faite grâ ce à la possibilité de
fabriquer des particules de très faible taille (3-10µm) et de granulométrie homogène, qui permettait de réaliser des
colonnes très efficaces impliquant la nécessité d'employer des pompes à haute pression pour pousser les solvants dans
des tubes résistants contenant les phases stationnaires.

But L’HPLC permet de séparer, d’identifier et de quantifier un ou plusieurs composés qui peuvent être dissous dans un
liquide à des concentrations aussi faibles que l'état de traces. -Son champ d’application recouvre une grande partie du
domaine de la CPG auquel s’ajoute des composés thermosensibles ou de masses moléculaires à la fois très grandes et
même polaires.
Appareillag
e

Réservoirs Réservoirs en verre ou en acier inoxydable (200 à 2000 ml).

de la phase  Il renferme la phase mobile
mobile:  Il doit être étanche pour éviter:
- L’évaporation préférentielle ;
- La dissolution des gaz de l’atmosphère.
 On filtre la phase mobile pour éliminer toutes particules en suspension: Car tous les tubes de l’appareil ont un
diamètre extrêmement fin et risquent de se boucher.
Dégazeur Son rô le c’est enlever les gaz dissous qui peuvent former les bulles et interférer dans la séparation et la détection
Différents techniques pour éliminer les bulles d’aire
o Barbotage d’un gaz inerte He
o Pompage sous vide
o Distillation
o Chauffage
o Agitation
o Bain Ultrason
Pompe: La pompe d’un chromatographe a pour rô le d’assurer l’écoulement de la phase mobile dans la colonne
• Débit : 0,01 à 10 mL/min *
• Stabilité < 0,5%
• Pression maximale > 400 bars
• Chambre de mélange efficace et de faible volume
• Résistance à la corrosion
Mode a-Isocratique: la composition de la phase mobile est b-Gradient: la composition de la phase mobile change au
d’élution constante au cours de l’analyse (analyse possible avec une cours de l’acquisition (nécessite plusieur s voies)
ou de seule voie)
séparation:

Les d1) Injecteur à seringue d2) Vannes à boucle d’injection

systèmes - Il se rapproche des injecteurs utilisés en CPG.
d’injections - On apporte l’échantillon par une seringue dont l’aiguille
: traverse un septum en caoutchouc ou en matière
plastique, pour déposer
l’échantillon au sommet de la colonne qui est placée sous
le septum
Avantage : On apporte l’échantillon dans la colonne.
Inconvénient :
Ce type d’injecteur et le plus couramment utilisé
comporte une vanne à boucle d’échantillonnage d’une
capacité fixe (5, 10, 20, 25, 50, 100µL…) cette boucle
permet d’introduire l’échantillon sans modifier la
pression dans la colonne. La vanne possède 2 position:
1-Chargement: Permet le remplissage de la boucle
d’injection
2-Injection: Mise en circulation de l’échantillon dans le
système chromatographique
 ❖ Il est très difficile de maîtriser le volume de - Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la
la prise d’essai. taille de la colonne et de la concentration supposée des
❖ Difficile à garder la pression constante produits à analyser.
Au cours de l’acquisition - Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un
❖ Formation des faux pics par l’arrêt volume injecté constant
du débit pour diminuer la pression,
Colonnes La colonne se présente comme un tube, le plus souvent en
en HPLC acier, dont la Colonne de garde: Petite colonne placé entre l’injecteur et
longueur et le diamètre présentent des différences selon la colonne de séparation contient le même remplissage
les modèles. que la colonne analytique,
La phase stationnaire est disposée à l’intérieur de la Permet de prévenir l’adsorption irréversible de
colonne où elle est contaminant sur la colonne provenant de l’échantillon ou
retenue par une pastille en acier inoxydable fritté. Puis un du solvant
tube de:
- Longueur de 10 à 30 cm
- Diamètre interne de 3,9 à 20 mm
- Granulométrie : 3 à 10 µm
Four pour Les écarts de température modifiant les temps de rétention, les appareils actuels permettent de thermostater la
colonne colonne et l’éluant, à la fois, pour assurer la répétabilité des analyses et pour faire intervenir éventuellement la
température comme paramètre de séparation
En effet l'augmentation de la température diminuera la valeur de K, K ‘ et le temps de rétention
Les Rô le: suit en continu l’apparition des solutés. Pour détecter, on utilise différents phénomènes physico-chimiques, Le
détecteurs signal obtenu est enregistré en fonction de temps, Ils doivent répondre à certaines exigences:
 Signal proportionnel à la concentration (linéarité)
 Sensibilité (rapport signal/bruit faible)
 Réponse stable dans le temps (la dérive par rapport au temps)
 Faible temps de réponse
 Faible volume mort (volume de la cellule)
 Bruit de fond faible
Il n’existe pas de détecteur universel, mais il faut le choisir en fonction des substances analysées.
Les modes de détection les plus courants reposent sur les propriétés optiques des composés: absorption, fluorescence
et indice de réfraction

L’intégrat Il s’agit en fait d’un petit ordinateur qui récupère toutes les données issues des détecteurs, trace les chromatogrammes
eur- et intègre la surface des pics. Il imprime un rapport d’analyse donnant les temps
enregistr de rétentions et les surfaces de chaque pic. On peut le programmer pour qu’il fasse seul les divers calculs
eur conduisant aux concentrations à partir de chromatogrammes étalon et des chromatogrammes des mélanges analysés.
Les modalités chromatographiques en HPLC
chromatographie L’adsorption est un phénomène physico-chimique qui consiste en la fixation d’une substance à l’état liquide (ou
d’adsorption : gaz) sur une surface solide par des forces complexes : Forces électrostatiques, liaison d’hydrogène et autre, Cette
fixation doit être réversible à l’aide d’un éluant approprié = Désorption,
- Les adsorbants:
Ce sont des solides de fines granulométrie 3 à 20µm on trouve: Alimune (Al2O3 ),Silice SiO2 , ce dernier vu son
caractère acide et la possibilité de former des liaisons hydrogéne le rendent l’adsorbant le plus utilisé,
- Phase mobile :
La plupart des séparations chromatographiques s’effectuent en adaptant la polarité de la phase stationnaire à
celle de soluté, on utilise par contre une phase mobile dont la polarité est extrêmement diffèrente, plus de 90%
de la séparation chromatographique d’adsorption utilise un mélange de l’hexane ou isooctane avec l’éther
isopropylique
- Application:
Elle s’applique pour la séparation des composés apolaires de masse moléculaire inferieure à 3000Da
- L'inconvénient :
détérioration rapide au cours du temps de la phase stationnaire, → manque de reproductibilité des
chromatographie La chromatographie de partage fonctionne par partage de solutés entre deux phases non miscibles; l’une mobile
de partage: CLL et l’autre stationnaire. La phase stationnaire est un liquide qui imprègne un support en principe inerte ou greffé
par liaison chimique covalente sur ce support
 -Phase mobile apolaires pour séparer des composés polaires et moyennement polaires.
le tr. ⇓ lorsque le % en solvant polaire ⇑ .
l’ordre d’élution dépend de la polarité des solutés: le tr. ⇑ avec une ⇑ de la polarité du produit étudié.
-Phase mobile polaire.
- Les composés polaires seront élués en premier avant les composés peu polaire
* solutés apolaires, surtout, en interaction avec φS.
*solutés polaires, plutô t, en interaction avec la φM.
*K’ augmente avec le nombre de chaînes greffées .
Application: Séparations d’un mélange de 16 hydrocarbures polyaromatiques (polluants)
chromatographie Définition: La chromatographie ionique (CI) est une technique analytique qui permet l’analyse qualitative et
par échange quantitative des espèces
d’ions ioniques présentes dans un échantillon liquide dépourvu de matières en
suspension.
 c- chromatographie par échange d’ions
En chromatographie ionique, le mécanisme de séparation se produit par échange d'ions entre une phase
stationnaire, qui porte des groupements fonctionnels chargés et une phase mobile (généralement
un tampon)
La phase stationnaire est une macromolécule (résine) portant un groupement ionisable acide ou basique.
Positive: Résine échangeuses d’anions qui fixe des anions ---R+ ---M+
Négative: Résine échangeuses de cations qui fixe des cations ---R—M-

Chromatographi Définition :
e d’exclusion: La chromatographie d'exclusion est aussi appelée tamisage moléculaire permet la séparation des molécules en
fonction de leur taille et de leur forme.
Principe:
Dans cette technique de chromatographie on utilise des granules de gels poreux, dont les pores ont une taille
voisine de celle des molécules des composés. La séparation résulte de la différence de taille et est fondée sur la
possibilité du soluté à pénétrer ou de ne pas pénétrer à l’intérieur des pores de la phase stationnaire.
 Les grosses molécules sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort (Vm ou
V0 ).
 Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration
est freinée
Chromatographi La chromatographie chirale est une technique chromatographique qui consiste à séparer un mélange
e chirale: énantiomérique

Applications de la HPLC
Le domaine d’application de la technique (CLHP) est très vaste:
♣ Industries chimiques et para chimiques ; ♣ Agro-alimentaires ; ♣ Environnement ; ♣ Pharmacie
♣ Biochimie.