Introduction

La chromatographie liquide est une technique permettant de séparer les composants d’un
mélange grâce à leur migration différentielle entre deux phases, l’une étant stationnaire (solide
ou liquide), l’autre est mobile (liquide, gaz ou supercritique fluide).
 Chaque molécule d’un mélange à une affinité sélective pour la phase stationnaire. Le rôle
de la phase mobile est le transport des molécules à travers la phase stationnaire. Plus le
trajet est long et plus la séparation de ces substances est grande.
 Chaque substance a un temps de rétention (t R) ou temps de séjour différent.

 
 I. Définition de la chromatographie liquide a haute performance
• La chromatographie liquide haute performance, constitue une technique analytique très
générale d’emploi. Elle correspond à une évolution de la chromatographie préparative sur
colonne dont les performances se sont trouvées améliorées par l’utilisation de phases
stationnaires très élaborées.

• La migration forcée d’une phase liquide au contact d’une phase stationnaire se retrouve dans
plusieurs techniques chromatographiques. La particularité de la HPLC est de faire intervenir des
mécanismes d’échange soluté/ phase mobile/phase stationnaire basés sur les coefficients
d’adsorption ou de partage.

II. Principe de fonctionnement de la HPLC

• En chromatographie liquide à haute performance, une faible quantité de l’échantillon à analyser
est introduite au sommet de la colonne.

• Sous l’action de la phase mobile, les divers constituants migrent dans la colonne d’autant plus
longtemps qu’ils ont plus d’affinité pour la phase stationnaire. A la sortie du détecteur on
observe des pics symétriques plus au moins séparés sur le chromatogramme.

• Une bonne séparation en HPLC implique que :

– Les divers constituants du mélange soient plus ou moins retenus dans la colonne donc
présentent une affinité pour la phase stationnaire suffisante.

– Les différents pics soient bien séparés, ce qui, pour deux pics consécutifs dépend de deux
facteurs : la distance séparant les sommets des deux pics et leurs longueurs

– L’analyse soit aussi rapide que possible.

III. Classification des techniques chromatographiques

Il existe plusieurs types de chromatographie. Ils diffèrent par leurs phases mobiles et
stationnaires et leurs méthodes, mais tous suivent les principes décrits ci-dessus. Les
types comprennent:

1. Chromatographie sur couche mince

Dans le processus de chromatographie en couche mince (CCM), le mélange de substances est
séparé en ses composants à l'aide d'une plaque de verre recouverte d'une très fine couche
d'adsorbant, comme le gel de silice et l'alumine.
La plaque utilisée pour ce procédé est connue sous le nom de plaque de chrome. La solution du
mélange à séparer est appliquée sous forme d'un petit point à une distance de 2 cm au-dessus
d'une extrémité de la plaque. La plaque est ensuite placée dans un bocal fermé contenant un
 fluide appelé éluant, qui remonte le long de la plaque en transportant les différents composants
du mélange à différentes hauteurs.

2. Chromatographie sur colonne

La chromatographie sur colonne est la technique utilisée pour séparer les composants d'un
mélange à l'aide d'une colonne d'adsorbant approprié emballée dans un tube de verre. Le mélange
est placé au sommet de la colonne, et un éluant approprié s'écoule lentement le long de la
colonne.

La séparation des composants dépend du degré d'adsorption des composants sur la colonne
d'adsorbant mural. Le composant ayant la plus grande capacité d'absorption est retenu en haut de
la colonne, tandis que les autres s'écoulent vers le bas à des hauteurs différentes1 .

3.Chromatographie d'affinité
La chromatographie d'affinité permet une séparation plus spécifique des biomolécules en
utilisant une colonne composée d'une phase stationnaire, qui contient des ligands spécifiques à
la cible.

4.La chromatographie en phase normale :

La chromatographie en phase normale (NPLC) consiste à séparer différents analytes selon leur
polarité. Cette technique de séparation découle de l’expérience de Tswett et de son montage de
chromatographie réalisé avec des pigments végétaux.

5.La chromatographie d’adsorption:

La phase stationnaire est un adsorbant et la séparation est basée sur des étapes d’adsorption
et de désorption successives.

6.La chromatographie par échange d’ions:

Le lit de matériaux stationnaire présente une surface comportant des ions de signe opposé à
ceux des composants de l’échantillon. Son utilisation est limité à la séparation d’échantillons
contenant des composée ionique ou ionisable. Plus la charge d’un ion de l’échantillon est
grande, plus cet ion est attiré par ceux de la phase stationnaire et plus son temps d’élution est
long.
 7• La chromatographie d’exclusion:
La colonne est remplie d’un matériau présentant des pores de dimensions bien définies agissant
comme écran ou comme filtre suivant les dimensions des molécules de l’échantillon, éluées au
travers de la colonne. Cette technique est également connue sous le nom de chromatographie sur
gel.

8 • La chromatographie de partage:
La séparation est basée sur le partage des constituants d’un composé entre deux phases liquides,
l’une mobile et l’autre stationnaire.

9. Chromatographie de paire d’ions

C’est un sous type de la chromatographie en phase inverse. La phase mobile : tampon + solvant
+ contre ion, elle s’adresse à des molécules chargées; la charge est neutralisée grâce à un contre
ion de charge contraire et possédant des chaînes alkyles.
Cette technique peut remplacer l’échange d’ions pour la séparation des molécules chargées. Elle
offre la possibilité de travailler en phase inverse (technique optimale).
 Phase stationnaire apolaire
 Phase mobile: tampons + contre ions ± méthanol ou acétonitrile
IV. Appareillage (HPLC)

Dans tout appareil de chromatographie liquide haute performance on

retrouvera toujours les éléments de base suivants :
– Un ou plusieurs réservoirs de phase mobile
– Une pompe permettant la propulsion de la phase mobile avec flux constant
à travers la colonne.
– Un système d’injection comportant une boucle d’échantillonnage calibrée
(généralement une vanne RHEODYNE).
 Évidence la sortie des solutés de la colonne et de donner un signal
proportionnel à la quantité de chacun de ces solutés dans un mélange.
– Un intégrateur qui fournit des donnés permettant l’évaluation qualitative
et quantitative des résultats. Cette évaluation peut être effectuée en
enregistrant la réponse du détecteur en fonction du temps.

Réservoirs de la phase mobile

 Réservoir renferme la phase mobile
 Il est en verre ou en acier inoxydable (200 à 1000 ml).
 Le réservoir doit être étanche pour éviter:
o l’évaporation préférentielle
o la dissolution des gaz de l’atmosphère qui se
libéreraient dans le reste de l’appareil et également les
opérations
 On prive la phase mobile des gaz dissous dans une cuve à ultrasons.
 On filtre la phase mobile pour éliminer toutes particules en suspension : Car
tous les tubes de l’appareil ont un diamètre extrêmement fin et risquent de
se boucher.
Pompes
Sert à faire passer la phase mobile rapidement dans la colonne.
  débit : 0,01 à 10 mL/min
 stabilité < 1%
 pression maximale > 350 bars

Schéma simplifié des composantes de l’HPLC

Il existe deux types:

 Les pompes à pression constante

 Les pompes à débit constant qui sont les plus utilisées.

Schéma simplifié du principe d’une pompe

On distingue:
 Pompes à simple déplacement : fonctionne comme une seringue : elle est munie d’un
piston qui se déplace grâce à une vis sans fin. Il n’ y a pas de pulsations mais le volume de
solvant est limité (quelques ml).
 Pompe à piston: (la plus utilisée) le piston est entraîné par une excentrique, le ressort
pousse le piston en permanence dans le sens du remplissage du corps de la pompe.
Avantage: grand volume, mais il y a des pulsassions
Lorsque on délivrent un solvant unique, on travaille en mode d’elution isocratique.
Si on a plusieurs solvants et que l’on veut faire un gradient du pouvoir éluant ou mode en
gradient de polarité , il faut :
 Soit plusieurs pompes aspirent chacune un solvant précis
 Soit une seule pompe à plusieurs canaux où passent chaque solvant
Les systèmes d’injections
Injecteur à seringue
 Il se rapproche des injecteurs utilisés en CPG.
 On apporte l’échantillon par une seringue dont l’aiguille traverse un septum en caoutchouc ou
en matière plastique, pour déposer l’échantillon au sommet de la colonne qui est placée sous le
septum
Schéma d’un injecteur à seringue

 Schéma d’un injecteur à seringueAvantage : On apporte l’échantillon dans la

colonne.
 Inconvénient : Il est très difficile de maîtriser le volume de la prise d’essai.
Vannes à boucle d’injection
C’est un injecteur à boucle d’échantillonnage. Il existe des boucles de différents
volume (10 à 100 \muμL), on utilise en général une boucle de 20\muμ L.
Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de
la concentration supposée des produits à analyser.
Le système de la boucle d’injection permet d’avoir un volume injecté constant, ce
qui est important pour l’analyse quantitative.
 schéma d’une vanne d’injection

Photo d’une vanne d’injection

 Boucle en
inox pour vanne d’injection

Colonnes en HPLC
En acier inoxydable rarement en verre mais toujours chimiquement inerte. La
phase stationnaire est disposée à l’intérieur de la colonne où elle est retenue par
une pastille en acier inoxydable fritté. Puis un tube capillaire conduit l’éluat vers le
détecteur.
 Longueur de 10 à 30 cm
 diamètre interne de 4 à 20 mm
 granulométrie : 5 à 10 \muμm

Colonnes pour HPLC

les détecteurs
Ils doivent répondre à certaines exigences:
 Signal proportionnel à la concentration (linéarité)
 Sensibilité (rapport signal/bruit)
 Réponse stable dans le temps (la dérive par rapport au temps)
 Faible temps de réponse
 Faible volume mort (volume de la cellule)
Il n’existe pas de détecteur universel, mais il faut le choisir en fonction des
substances analysées.
Détecteurs d’absorption en UV-Visible
Ce sont les plus utilisés. On distingue les appareils:

 à longueur d’onde fixe \lambdaλ = 254 nm par exemple

 à longueurs d’ondes variable de 200 à 700 nm
 à barrette de diodes: analyse simultanée sur tout le spectre.
A=log(I0I)=ϵ⋅l⋅C

Schéma simplifié d’un détecteur

UV

Réfractomètre différentiel
Il mesure en continu la différence de l’indice de réfraction entre la phase mobile et
l’effluent de la colonne. Il est peu sensible et nécessite une température
parfaitement réglée à 0,01 °C près, et de travailler à débit constant.
 Schéma d’un
réfractomètre

Détecteurs de fluorescence

Schéma du principe du détecteur de

fluorescence

Détecteurs très sensibles et très sélectifs, mais il sont destinés uniquement aux
solutés fluorescents ou après formation post colonne de composés fluorescents
(dérivatisation).
Détection électrochimique
Ils sont réservés aux solutés dits électroactifs (ampérometrie, coulometrie,
conductimétrie…) électrode indicatrice : platine, carbone vitreux. La phase mobile
contient des électrolytes pour assurer le passage du courant.
 Schéma simplifié d’un détecteur
électrochimique

Couplage à la spectrométrie de masse

 Nécessité de travailler sous vide
 Le volume de solvant doit être faible
 Usage des interfaces
 LD : 100pg-1ng

Exemple du couplage HPLC – MS

Enregistrement des chromatogrammes

 Enregistreur simple: Impose la mesure manuelle des pics pour l’analyse
quantitative.
 Enregistreur – intégrateur: Obtention du chromatogramme suivi de
l’inscription des aires des pics, automatiquement mesurées.