LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE

La chromatographie liquide à haute performance n’est pas une variété une variété
particulière de chromatographie, c’est une méthodologie spéciale applicable à tous les types
de chromatographie liquide. Elle utilise comme support des particules de faible diamètre et
des pressions allant jusqu’à 600 bars.

1. LES PHASES STATIONNAIRES EN HPLC :

Trois types de phases stationnaires sont représentées : Les supports microporeux, les
supports pelliculaires qui sont superficiellement poreux et les phases greffées qui
correspondent à une phase stationnaire liée à un matériau inerte comme la silice.
Les deux premiers types sont utilisés pour la chromatographie d’adsorption.
La chromatographie de partage est réalisée sur une phase greffée. Dans la chromatographie en
phase normale, la phase stationnaire est polaire grâce à des dérivés tels que les alkylnitriles et
les alkylamines.
En phase inversée, la phase stationnaire non polaire est un hydrocarbure à C8 ou à C18.
Les échangeurs d’ions sont constitués des dérivés de polystyrène soit sous forme
microporeuse soit sous forme pelliculaire.
2. LA PHASE MOBILE EN HPLC :
La nature et la composition de la phase mobile varient en fonction du type de la phase
stationnaire.

2.1. IMPERATIFS DE LA PHASE MOBILE :

En chromatographie liquide, la phase mobile doit répondre à certains impératifs :

-Tous les solvants utilisés comme phase mobile doivent être de « qualité HPLC » (HPLC
grade)

-Cette qualité permet de garantir leur degré de pureté ( éviter les pics fantômes) ainsi que

leur filtration préalable sur filtre de 0,2µm (pollution du système colonne, colmatage de la

tubulure)

-Le solvant de qualité HPLC peut être soit acheté ou préparé au laboratoire par filtration à

l’aide d’un montage approprié (utiliser des filtres pour solvants organiques ou aqueux).
 -La filtration préalable du solvant permet d’éviter de nombreux problèmes de
fonctionnement de la pompe et de prolonger sa durée de vie, ainsi que le colmatage des filtres
et des colonnes.

-Certaines modifications (filtration, dégazage…..), sont primordiales pour garantir une

efficacité optimale.

Les réservoirs de la phase mobile doivent êtres étanches pour éviter que le solvant ne dissolve
les gaz de l’atmosphère qui se libéreraient dans le reste de l’appareil.

2.2. LES MODES D’ELUTION

- En HPLC, les principaux modes d’élution sont :
• mode isocratique:
L’élution isocratique utilise une composition constante de la phase mobile pour éluer les
solutés.
On peut obtenir une force éluante ou une polarité optimale en mélangeant deux solvants
différents en proportion bien définie.
• mode gradient:
Modification de la composition de la phase mobile avec le temps: programmation du
solvant. C’est le principe même de la CL avec « gradient d’élution ».
Passant d'un solvant faible à un solvant plus fort.
Si le mélange à séparer est trop complexe pour parvenir à une résolution suffisante en élution
isocratique, on opérera par élution graduée en augmentant la force éluante par addition
progressive de solvant de plus forte polarité (modificateur tel que le méthanol).
• Avantages du mode gradient d’élution:

✓ réduction du temps d’analyse

✓ amélioration de la résolution des constituants du mélange

✓ optimisation de la forme des pics

✓ sensibilité accrue

• Inconvénients

✓ reproductibilité plus délicate qu’en mode isocratique

✓ possibilité de dérive de la ligne de base

✓ programmation délicate dans certains cas

3. APPAREILLAGE :
Constitué de modules reliés entre eux grâce à des canalisations résistantes (aux solvants
usuels même sous pressions élevées), de très faible diamètre interne (0,1 mm) pour assurer la
circulation de la phase mobile.
3.1. RESERVOIRS DE LA PHASE MOBILE :

Les réservoirs de la phase mobile doivent êtres étanches pour éviter que le solvant ne
dissolve les gaz de l’atmosphère qui se libéreraient dans le reste de l’appareil.

► Les réservoirs de la phase mobile sont généralement en verres

► Etanches pour éviter l’évaporation des solvants, la contamination par l’eau atmosphérique

et la dissolution de l’oxygène de l’aire.

► Equipés d’un dispositif qui chasse les gaz dissous.

► D’une contenance de 1à 2 L pour la chromatographie analytique et jusqu’à 10 L pour la

Préparative.

3.2. POMPES :

La pompe sert à faire passer rapidement la phase mobile dans la colonne en luttant contre la

perte de charge due à la viscosité du solvant.

• Les pompes idéales doivent réunir les qualités suivantes :

-Obtention de pression allant jusqu’à 600 bars

-Débit constant, reproductible et sans pulsations (compris entre 0,1 et 10 mL/min).

-Résistance à la corrosion

-Faible volume de la chambre de la pompe (pour éviter le volume mort)

-Délivrance non limitée du solvant

a- Pompe à pression constante ( pompe pneumatique) :

Se sont des pompes qui, par l’intermédiaire d’un gaz inerte, exerce une pression constante sur
la phase mobile.

AVANTAGE :

1. Obtention d’un débit non pulsé

2. Moins couteuse

INCONVENIENTS :

1. Impossibilité d’obtenir des débits élevés.

2. Le volume de solvant délivré est limité.

3. Ne convient pas aux systèmes de gradients d’élution

b- La seringue commandée par vis (pompe à seringue commandée) :

Le piston de la seringue se déplace à l'aide d'une vis sans fin commandé par un moteur pas à
pas, refoulant ainsi la phase mobile.

AVANTAGE :

1. Ecoulement sans pulsations (pas de fluctuation de pression)

2. Débit élevé et contrôlé
INCONVENIENTS :
1. Elle possède une faible capacité (250 mL)
2. Mal adaptée aux changements de solvant

c- Pompe alternative ( pompe à piston) :

C’est le système de pompage le plus utilisé, il est constituée d'une petite chambre qui se
remplit et se vide en fonction d'un mouvement de va-et-vient d'un piston.

AVANTAGE:

1. Obtention de débits élevés.

2. Délivrance de solvant non limité.

3. Adaptable au régime de gradient d'élution.

INCONVENIENT :

1. Écoulement pulsé

* OBTENTION DU GRADIENT D’ELUTION :

Le contrôleur de gradient est le dispositif qui permet de créer et appliquer un programme de

gradient pendant l’analyse.

Les gradients sont réalisés de deux manières:

➢ En amont des pompes: dans les chromatographes à 1 seule pompe, qui est couplée avec

des vannes.

Chaque vanne détermine la proportion de chaque solvant introduit dans la pompe

➢ En aval des pompes: dans les chromatographes à 2 ou 3 pompes couplées à une seule

sortie où les 2 ou 3 débits sont mélangés

Le gradient est obtenu en modifiant, à débit total constant, le rapport des débits des

pompes, càd qu’une pompe fonctionnera plus ou moins vite d’où une variation du

mélange.

a: réservoir a b: réservoir b

3.3 LES INJECTEURS :

• Le système d’injection permet d’apporter l’échantillon.

• Il est plus complexe que l’injecteur en chromatographie gazeuse en raison de la pression
très élevée
• Si on essaie de faire une injection manuelle, le piston de la seringue ne pourrait pas être
introduit.
• Deux catégories de procédés d’injections:
a. Procédés par injection directe
b. Procédés par boucle d’injection
a. INJECTEUR A SERINGUE:

• Se rapprochent des injecteurs utilisés en CPG.

• On apporte l’échantillon par une seringue dont l’aiguille traverse un septum en caoutchouc.
• L’échantillon est alors déposé au sommet de la colonne se trouvant sous le septum.
Problème : en HPLC l’éluant est propulsé par une pompe, il arrive donc sous pression
empêchant alors le piston d’être introduit l’aiguille remonte.
Solution: une approche simple consisterait à stopper l’arrivée du solvant (débit) par un
système ‘stop flow’ pendant l’injection puis rouvrir pour que la prise d’essai soit entrainée
par la phase mobile dans la colonne.
Il faut savoir que ce n’est pas une technique facile à mettre en œuvre pratiquement.
AVANTAGE:
L’échantillon est apporté au sommet de la colonne.
INCONVENIENT
1. Le volume de la prise d’essai est difficile à maitriser.
2. Faux pics sur le chromatogramme.

b. INJECTEUR A BOUCLE D’ECHANTILLONAGE:

• La méthode la plus simple et la plus pratique utilise le principe de la vanne d’injection avec
boucle de volume fixe.
• Elle fonctionne en deux étapes: chargement et injection et permet une injection aisée et
reproductible.
• La boucle est remplie avec une seringue, puis on fait passer la phase mobile dans la boucle.
1 temps Mode boucle remplie : on remplie la boucle avec la prise d’essai qui est apportée
par une seringue à grand volume, le trop plein sort par un évent.
2éme temps Mode boucle partielle : on tourne la vanne, la pompe est alors connectée à la
boucle.
Elle propulse le solvant qui balaye toute la boucle entraînant ainsi l’échantillon vers la
colonne.
AVANTAGE:
1. La prise d’essai est précise.
2. injection aisée et reproductible
INCONVENIENT
Le volume mort entre l’arrivé de l’échantillon et la colonne.
3.4. LES COLONNES POUR HPLC
Les colonnes pour HPLC sont usuellement en acier inoxydable. La plupart des colonnes ont
une longueur de 10 à 30 cm et un diamètre intérieur de 4 à10 mm, avec des tailles
particulaires de 5 à 10 µm. Il existe à présent des microcolonnes à haute performance qui ont
un diamètre intérieur de 1 à 4.6 mm et une longueur de 3 à 7.5 cm. Ce type de colonne
consomme moins de solvant et présente aussi l’avantage de la rapidité.
Une pré-colonne plus courte et contenant le même type de phase stationnaire que la colonne
peut être placée en amont de celle-ci pour la protéger et augmenter sa durée de vie.
3.5. LES DÉTECTEURS :

Un détecteur est un instrument placé immédiatement à la sortie de la colonne, il permet de

suivre en continu la séparation et de mesurer la concentration des solutés.

Les modes de détection les plus courants reposent sur les propriétés optiques des composés :

absorption, fluorescence et indice de réfraction.

Le détecteur en chromatographie liquide doit satisfaire certains critères:

✓ Caractère universel ou spécifique

– Universel: intéressant dans le cas de mélanges inconnus car basé sur la mesure d’une

propriété « globale » de l’effluent chromatographique (indice de réfraction, constante

diélectrique…)

– Spécifique: avantageux pour doser des traces de produits « visibles » parmi d’autres

produits non détectés, il utilise les propriétés physico-chimiques particulières des solutés
(absorption lumineuse, fluorescence, électrochimie…)

✓ Domaine de linéarité: la plupart des détecteurs sont sensibles à la concentration, la relation

réponse/concentration est linéaire dans un domaine de concentration.

✓ Sensibilité: définie comme étant la concentration de soluté donnant une réponse égale au

double du bruit de fond. Elle est appelée aussi détectabilité ou seuil de détection.

✓ Temps de réponse: doit être faible par rapport à la largeur du pic pour éviter d’élargir ou

déformer le pic

✓ Bruit: il limite la sensibilité du détecteur et peut avoir plusieurs causes: électronique….

Classification des détecteurs

➢ Détection directe: mis en œuvre d’une propriété spécifique du soluté.

➢ Détection indirecte : mis en œuvre d’une propriété spécifique d’un des constituants de

l’éluant.

➢ Détection différentielle : mesure une différence de propriété entre le soluté et l’éluant.

A. Le réfractomètre différentiel:

Principe:
Mesure en continu la différence des indices de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de
la colonne.

Pour cela un faisceau lumineux passe à travers une cellule comportant deux compartiments

triangulaires dont l’un est rempli avec la phase mobile seule et l’autre avec l’effluent en sortie
de colonne.

Universel

Détecteur universel utilisé surtout pour les composés n’absorbant pas dans l’UV et le visible.

INCONVENIENT

• Une limite de détection beaucoup plus élevée qu’un détecteur UV-visible.

• Une grande sensibilité à la température et à la pression.

• Ne peut être utilisé en mode gradient.

B. Détecteur à diffusion de la lumière(DDL) :

Principe:

Le principe est fondé sur l’évaporation partielle de l’effluent de la colonne

chromatographique de façon à obtenir un brouillard de particules solides ou liquides du

soluté qui traverse un faisceau lumineux.

La lumière diffusée sous un angle déterminé est détectée par un photomultiplicateur.

 Universel

1. Un nébuliseur pneumatique dans lequel se forme un brouillard de gouttelettes de diamètre

homogène.

2. Un tube chauffé où se produit l’évaporation de la phase éluante.

3. Une cellule de détection traversée par le faisceau lumineux.

AVANTAGE:

Il est parfaitement compatible avec un gradient d’élution, ce qui le rend très complémentaire
du réfractomètre différentiel.

INCONVENIENT :

La mise en œuvre de ce détecteur est limitée à l’emploi de phases éluantes volatiles et de

solutés non volatils.

C. Spectrophotomètre UV-Visible:

Principe:

L’absorbance A de l’effluent est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde λ.La

détection est basée sur la loi de Bee Lambert.

L’intensité de l’absorption dépend du coefficient d’absorption

molaire
La phase mobile ne doit pas, ou très peu, absorber par elle-même.
► Sélectif

► Non destructif.

► La détectabilité de ce détecteur dépend essentiellement de l'absorptivité ξ du soluté et, par

conséquent, de sa nature.

► Pour une valeur moyenne de ξ, les quantités minimales détectables sont de l'ordre de ng.

► Peu sensible à la température et au débit.

► Peut être utilisé en mode gradient

D. Spectrofluorimètre:

Principe:

• Certains composés organiques absorbent des radiations dans l’UV et réémettent sous forme

de radiations lumineuses fluorescentes une fraction plus ou moins grande du rayonnement

absorbé à une longueur d’onde supérieure.

• L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la concentration de la substance.

• Les détecteurs de fluorescence à la fois sensibles et sélectifs sont utilisables pour les
composés naturellement fluorescents et pour tous ceux qui peuvent le devenir par

traitement préalable à la détection

E . Détecteurs électrochimiques:

Principe:
Il existe des détecteurs permettant de suivre certaines réactions de transfert d’électrons

ampérométriques , voltampérométriques , potentiométriques et coulométriques, à partir d’une

substance électroactive contenue dans un liquide en mouvement au contact d’une électrode.

La charge Q échangée avec l’électrode est donnée par la loi de Faraday Q = ne F N

► Sélectif (substances électroactives)

► Destructif.

► La sensibilité dépend essentiellement du choix du potentiel d’électrode.

► Les phases mobiles utilisées doivent être suffisamment conductrices pour permettre le

passage du courant.

F. Spectromètre de masse :

C’est un mode de détection performant.

INCONVENIENT

Il ne permet pas la collection de l’échantillon après détection puisque celui-ci est détruit dans
le spectromètre de masse.