Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Méthodes de séparation par chromatographie en phase gazeuse

* Description de l'appareillage:
- Les phases stationnaires - Les phases mobiles
- Les colonnes : - Les colonnes remplies - les colonnes capillaires
- Calcul du rapport de phase dans le cas d'une colonne capillaire
- L'injecteur
- Détecteur par ionisation à flamme - Autres types de détecteurs
- Le four
- Le détecteur
 Pourquoi la chromatographie CPG?

 Identification des constituants d’un mélange.

 Séparation des constituants d’un mélange.

 Détermination du nombre des constituants d’un mélange.

 Cinétique d’une réaction.

 Contrôle de la pureté et de la qualité de produits.

 Contrôle de la pureté et de la qualité des réactifs.

 Analyse des résidus et des traces.

 Préambule

Comment arrive t-on à séparer des molécules si on ne les voit pas à

l’œil nu ?

 On arrive à séparer des molécules en se basant sur des phénomènes

de rétention « Adsorption ou partage » entre un support dit la
phase stationnaire, qui tend à retarder l’échantillon et une phase
dite mobile qui tend à emporter l’échantillon avec elle.

 Deux composés d’un même mélange seront donc séparés selon leur
"affinité" pour l’une ou l’autre de ces deux phases.
Chromatographie : Définition / Principe

Composant / Soluté

Forces de Rétention Forces d’élution

 Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

Principe
➢ Méthode de séparation de composés
gazeux ou susceptibles d’être

Phase stationnaire
vaporisés sans décomposition

Phase mobile
A
➢ ÉCHANGE de molécule GAZEUSE entre phase
stationnaire et phase mobile

B ➢ Phase stationnaire liquide ou solide

➢ Phase mobile GAZEUSE

 Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

Appareillage
 Choix de la colonne

Choix du système

Colonnes remplies

➢ Injecteur classique à septum

➢ Injection directe

➢ Injecteur automatique

➢ Vanne à gaz

➢ Injecteur à solides
 Choix de la colonne

Choix du système

Colonnes capillaires

➢ Injection directe

➢ Injection avec division (split injection)

➢ Injection sans division (splitless injection)

➢ Injection dans la colonne (on column)

➢ Injection à température programmée

➢ Injection à évaporation de solvant

 Le four

➢ Elément essentiel aux chromatographes modernes car doit posséder une

excellente stabilité thermique (jusqu’à 450°C)

➢ Homogénéité de la température assurée par un ventilateur

➢ Programmateur de température

➢ Doit chauffer et refroidir très rapidement

➢ Gradient de température pour pouvoir séparer en un minimum de temps

des mélanges de composés peu volatils et très volatils
 Le four

Enceinte thermostaté

Ventilateur

Colonne
 Phase stationnaire

➢ Film polymérique qui recouvre ou qui est greffé sur la paroi interne de la
colonne capillaire

➢ Équilibres d’interactions entre solutés et phases différents suivant la

nature de la phase

Paramètres de choix de la phase stationnaire

✓ Nature
✓ Polarité
✓ Stabilité
✓ Température minimale et maximale d’utilisation
 Phase stationnaire : Polarité
Composé non polaire

Composé polaire
 Phase stationnaire : Polarité

Les phases stationnaires

• Les phases les plus répandues sont les polymères siliconés dérivés du diméthyl
polysiloxane.

• Cette phase est greffée sur la colonne en silice par l'intermédiaire d’une liaison -
O-Si-O- .

• Suivant le pourcentage de groupement R par rapport aux groupes CH3, on peut

modifier la polarité de la colonne et donc ses propriétés en chromatographie.
 Phase stationnaire : Polarité

• Si R = CH3, la colonne est complètement apolaire et sépare les produits suivant

leur point d'ébullition (noms commerciaux : DB-1, OV101, SE30...).

• Si le % de R = Phényle est égal à 5%, on a la colonne la plus utilisée en

CPG, elle est répertoriée sous les noms commerciaux suivants: DB5, CPsil5,
OV5...

▪ Si on incorpore un substituant cyanopropyle (R = -CH2-CH2-CH2-CN) la polarité

augmente beaucoup (à cause du fort moment dipolaire du groupe -CN). Ce sont les
phases DB 1701, CPSil 18, OV 17..
 Phase stationnaire : Polarité
Ces phases à base de silicone présentent deux avantages pour la CPG :
• Une bonne inertie chimique, elles ne réagissent ni avec les phases mobiles, ni avec les
produits injectés.

• Une très bonne tenue à la température, elles peuvent être chauffées sans dommage
jusqu'à 300°C

Ils existent d'autres phases beaucoup plus polaires à base de polyéthylène glycol.
HO-(-CH2-CH2-O-)n-O-(Silice)
• Elles sont greffées sur les parois en silice de la colonne par l'intermédiaire d'une
liaison Si-O-C
• Les dénominations commerciales de ces phases sont: Carbowax, DB-wax, CP wax
52.
Ces phases sont utilisables entre 20° et 250°C, elles sont moins inertes que les phases
siliconées, elles sont en particulier très sensibles à l'oxygène
 Phase stationnaire : Polarité
Exemple
 Choix de la colonne
Diamètre de la colonne
- L’efficacité est inversement proportionnelle au diamètre de la colonne

• Diminuer par 2 le diamètre de la colonne

• double l’efficacité

• Augmente la résolution d’un facteur 1,4

- Le temps de rétention

• est inversement proportionnel au diamètre en isotherme

- La pression est inversement proportionnelle au carré du rayon de la colonne

• Pression multipliée par 1,7 quand on passe d’un diamètre 0,32 mm à 0,25 mm

- Capacité augmente avec le diamètre de la colonne

Efficacité Temps de rétention Résolution

Pr. M. Dakir 2021-22 20

 Diamètre de la colonne
Exemple

➢ Gain en temps d’analyse

➢ Perte en efficacité (N) et en résolution (R)

➢ Gain en capacité d’échantillon

 Choix de la colonne

Longueur de la colonne

Plus la colonne est longue :

✓ Plus la résolution est améliorée
✓ Mais plus le temps d’analyse augmente
✓ Plus le cout de la colonne est important

Exemple

➢ Avec une colonne de 60 m, on gagne 40% en résolution par rapport à une

colonne de 30 m

➢ Avec une colonne de 60 m, on double le temps d’analyse par rapport à une

colonne de 30 m
 Choix de la colonne

Longueur de la colonne

La résolution augmente proportionnellement à la racine carrée

de la longueur de la colonne
 Choix de la colonne
Longueur de la colonne

• Les colonnes capillaires sont disponibles dans des longueurs de : 10, 15, 20, 25, 30,
50, 60 et 120 m

• Augmenter la longueur de la colonne est la dernière option pour augmenter la

résolution

• Utiliser la colonne la plus courte (commencer par 25 – 30m)

• La pression en tête de colonne croît avec la longueur

• Les colonnes de 10 – 15 m est bien adaptée pour les composés bien séparés ou pour
des échantillons à nombre d’analytes réduits

• Les colonnes de 50 – 60 m sont utilisées lorsque le nombre de soluté est important.

 Choix de la colonne
Longueur de la colonne

Exemple
GC/MS chromatogram of Lichina pygmaea volatile compounds with putative
chemical structures of the most abundant compounds.
HPLC Préparative
 Introduction
► La chromatographie est une technique qui se présente sous plusieurs formes,
comme la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie
liquide haute performance (HPLC) et la chromatographie liquide en phase
gazeuse (GLC, plus connue sous le nom de GC).

► Chacune de ces formes de chromatographie a une variété d'utilisations dans les

sciences analytiques.

► Pour comprendre chacune des techniques chromatographiques, en particulier

l'HPLC qui fait l'objet de cet introduction, il faut d'abord expliquer ce qu'est la
chromatographie et les principes de base de la chromatographie.
► La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) se présente sous de
nombreuses formes différentes et constitue une méthode d'analyse primaire dans
de nombreux types de laboratoires.

► L'HPLC sépare les mélanges de composés en leurs composants individuels grâce

à l'interaction du composé, d'une phase mobile liquide et d'une phase
stationnaire inerte.

►Les interactions entre la phase mobile et la phase stationnaire sont diverses et

dépendent des types de composés à séparer et de la mesure dans laquelle la
séparation est nécessaire.

► Les interactions entre la phase mobile et la phase stationnaire sont diverses et

dépendent des types de composés à séparer et de la mesure dans laquelle la
séparation est nécessaire.
► Un exemple de ce chromatogramme est illustré à la figure ci-après, où le petit pic
au début est le pic du soluté non retenu et indique le point auquel l'injection a été
détectée (changement de pression du système).

► L'axe des x représente le temps et l'axe des y la réponse du détecteur.

► Un certain nombre de modes de séparation sont utilisés en chromatographie

liquide.
Les modes les plus couramment utilisés en criminalistique (‫ )الطب الشرعي‬sont
phases inversées (RP).

► La séparation des composés s'opère dans la phase stationnaire de la CLHP

emballée dans la colonne (généralement en acier inoxydable, mais d'autres
matériaux de logement sont disponibles)

► Le temps qu'il faut à un composé pour traverser la colonne et atteindre le détecteur

est appelé le temps de rétention (tR).
Chromatogramme de base montrant un mélange à quatre composants
► Idéalement, chaque composé du mélange d'échantillons aura un temps de rétention
différent.
► La séparation dépend de la distribution des composés entre la phase stationnaire et
la phase mobile et peut être représentée par le coefficient de distribution, K

où Cstat est la concentration du composé X dans la phase stationnaire et Cmob est

la concentration du composé X dans la phase mobile (voir figure ci-après).

► Un composé qui a une plus grande affinité pour la phase stationnaire mettra plus
de temps à traverser la colonne que celui qui a une plus grande affinité pour la
phase mobile
► Pour que la séparation ait lieu, le coefficient de distribution de chacun des
composés doit être différent pour une phase mobile et une phase stationnaire
donnée.

Distribution des composés entre la phase stationnaire et la phase mobile

 Facteur de rétention

► Le facteur de rétention (k′), qui était auparavant connu sous le nom de facteur
de capacité, représente la capacité d'une phase stationnaire à attirer un analyte.

► Le facteur k′ peut être défini comme le temps pendant lequel l'échantillon reste
dans la phase stationnaire (tR) par rapport au temps pendant lequel il réside dans
la phase mobile (tM), comme le montre la figure ci-apèrs. Le facteur de
rétention est représenté par l'équation suivante.
 Facteur de rétention

Considérons l'exemple de l’expérience suivante:

Exercice:
► Quelles sont les valeurs k′ des analytes élués à 3,3 et 4,6 minutes ?
Corrigé:
► Nous pouvons donc les calculer à l'aide de la formule suivante:

► Les valeurs de k′ pour les pics 2 et 3 peuvent être déterminés comme suit :

Le composé correspondant au pic 3 est le plus retenu (tR important)

► Ici, nous constatons que plus l'analyte est retenu longtemps (c'est-à-dire plus de
temps de rétention), plus la valeur de k′ est grande. Il est généralement admis
parmi les chromatographes qu'une valeur de k′ comprise entre 1 et 10 est une
valeur optimale.

► Une valeur inférieure à 1 signifie que le composé n'est effectivement pas retenu
ou qu'il n'y a pas d'interaction avec la substance. Aucune interaction n'a lieu avec
la phase stationnaire

► Il s'agit d'une situation indésirable car aucune chromatographie n'a lieu (c'est-à-
dire que rien n'est retenu par la colonne).

► k′ peut être utilisée plutôt que le temps de rétention car il est plus reproductible
d'une série à l'autre.
► Ceci est dû au fait que k′ est indépendant de la vitesse de la phase mobile et
donc moins sensible aux fluctuations du système HPLC.

Facteur de séparation

► Le facteur de séparation (α) est utilisé pour décrire la position de deux pics l'un
par rapport à l'autre et est mesuré à l'aide de l'équation suivante :

► Ce facteur est calculé à l'aide du facteur de rétention (k′) pour chacun des pics
des composants.
► Le facteur de séparation (figure ci-après) dépend d'un certain nombre de
facteurs, tels que la nature de la phase stationnaire, la phase mobile, la
température, et les composés d'intérêt.

► En utilisant l'exemple précédent, nous pouvons calculer α pour les pics A et B, où

tRB = 5,00, tRA = 2,80, et tM = 1,2 :

Facteur de séparation
 Modes de Séparation

► En chromatographie liquide, les séparations s'effectuent selon l'un des deux

principes suivants : la partition et l'adsorption.

► Dans le cas de la partition (chromatographie liquide-liquide), on utilise une phase

stationnaire liquide.

►Cette phase est chimiquement liée à un support inerte finement divisé (cette
dernière méthode : parition est plus courante).

► Dans toutes les formes de chromatographie liquide, comme le nom l'indique, nous
avons une phase mobile liquide.
 ► Pour que la séparation se produise avec ce type de chromatographie,
l'échantillon liquide est dispersé dans la phase mobile avec les analytes d'intérêt
étant répartis entre la phase mobile et le substrat, en fonction de leurs
coefficients de partage

► Pour rappel, le coefficient de partage, Kp, est exprimé par l'équation suivante:

► La différence des valeurs des coefficients de partage entraîne des vitesses de

migration différentes des analytes, ce qui affecte la séparation.

► Dans le cas de l'adsorption (chromatographie liquide-solide), une phase

stationnaire solide est utilisée, connu sous le nom d'adsorption, affecte la
séparation
► Comme il s'agit de chromatographie liquide, la phase mobile est un liquide.

► La séparation est affectée par l'équilibre qui est atteint entre les molécules qui
sont adsorbées sur la phase stationnaire et celles qui sont non liées dans la phase
mobile.
► Les colonnes (figure ci-dessous) sont de forme tubulaire, sont données dans
l'ordre suivant : diamètre interne × longueur, taille des particules du matériau de
garnissage (par exemple, 4,6 × 150 mm, 3,5 µm)

Colonne HPLC
► Ces colonnes varient en termes de diamètre interne, de longueur et de taille de
particule (qui affectera la taille des pores), mais le choix dépendra d'un certain
nombre de facteurs, notamment les composés à analyser et les débits requis

► Nous pouvons modifier les phases mobile et stationnaire en fonction de la nature

chimique des composés présents dans un échantillon que nous voulons séparer.
► En modifiant la composition de la phase mobile ou en changeant la polarité de la
phase stationnaire, nous changeons le mode dans lequel la séparation a lieu.

► Les modes les plus couramment rencontrés et utilisés en HPLC sont:

phase normale, phase inverse…etc

► D'autres modes, comme la chromatographie chirale, existent également, mais ne

trouvent que très peu, voire pas du tout, d'applications dans le domaine de la
médecine légale.

HPLC en phase normale

► Les systèmes de chromatographie en phase normale utilisent une phase

stationnaire polaire avec une phase mobile non polaire.
► En général, les matériaux de garnissage des colonnes à phase normale sont

composés de perles sphériques de silice non modifiées (des matériaux de

remplissage de type cyano, amine ou diol peuvent également être utilisés)

► La phase mobile étant constituée de solvants organiques non polaires tels que

l’éther de pétrole ou l'hexane. Le tableau ci-après, présente les principales

différences entre les matériaux de garnissage typiques de la phase normale.

Principales différences dans les matériaux d’emballage de la phase normale typique

a Cette gamme peut être étendue de 1,5 à 10 ; toutefois, il faut acheter des
colonnes spéciales à phase liée.
►Dans ce mode de séparation, par rapport à la phase inverse, les composés les
plus non polaires élueront en premier et auront le temps de rétention le plus
court, tandis que les composés les moins non polaires seront élués plus tard (voir
figure ci-dessous).

Séparation dans la chromatographie NP

Les séparations se produisent parce que les composés les plus polaires du
mélange ont une affinité plus élevée pour la phase stationnaire et les moins
polaires ont une affinité plus élevée pour la phase mobile (comme le montre la
figure ci-après)

Exemples de séparation NP-HPLC

HPLC en phase inverse

► Les systèmes de chromatographie en phase inverse utilisent une phase

stationnaire non polaire avec une phase mobile polaire. En général, les
matériaux de garnissage des colonnes sont composés de billes de silice
sphériques revêtues de chaînes alkyle hydrophobes (-CH2-CH2-CH2-).

► Les matériaux de revêtement typiques C4, C8 et C18 ; plus la chaîne est longue,
plus la phase stationnaire est non polaire.
► D'autres matériaux de garnissage de colonne sont également utilisés en
chromatographie en phase inverse, et ils peuvent inclure le phényle.

► Ces colonnes seront utilisées avec des phases mobiles contenant des mélanges de
solvants aqueux et organiques.

► Les colonnes les plus utilisées sont C8 et C18 (C18 étant la plus utilisée), ainsi
que celles phénoliques (voir tableau)

Les principales différences entre les colonnes C8, C18 et phényle

a Ces gammes peuvent être étendues de 1,5 à 10 ; cependant, des colonnes
spéciales à phase liée doivent être achetées.
Dans le système en phase inverse, les solutés non polaires auront une plus
grande affinité pour la phase stationnaire avec les composants les plus polaires
de la phase mobile.