Chapitre 4

Chromatographie Liquide Haute

Performance
(HPLC)
 Introduction

La chromatographie liquide haute performance est très utilisée dans tous les
domaines de la chimie analytique.
Son succès est du au fait qu’il est possible de modifier la résolution en jouant sur
la composition de la phase mobile.
Elle utilise des colonnes remplies d’une phase stationnaire constituée de particules
sphériques de très petites dimensions de diamètre couramment compris entre 2 et 5
mm ce qui conduit à de grandes efficacité et résolution.
L’inconvénient est que plus les particules sont petites et plus il est difficile de faire
s’écouler le solvant, on doit donc utiliser des pompes spéciales qui poussent le
solvant sous des pressions très élevées.
A l’origine le P de C.L.H.P correspondait donc au mot Pression.
La grande efficacité de la technique font que le P désigne actuellement le mot
Performance..
Chaîne H.P.L.C
 Les pompes

La pompe force la phase mobile à traverser la colonne dont la phase fixe très
compacte crée une perte de charge qui peut atteindre 2 M Pa en utilisation
courante.
On doit donc maintenir une pression extrêmement élevée en amont de l’injecteur
pour vaincre cette perte de charge et permettre la traversée de la colonne par
l’éluant.

La pression à imposer dépend des facteurs suivants :

• débit de la phase mobile
• viscosité de l’éluant
• taille des grains de la phase stationnaire
• géométrie de la colonne
 Les pompes
Les pompes doivent répondre aux exigences suivantes :

 fournir des pressions élevées jusqu'à 400 bars

 débit stable, non pulsé et réglable de 0,1 à 10 mL/min avec un contrôle
meilleur que 0,5 %
 résistance à la corrosion quelque soit le solvant utilisé.

Pour des débits standard (0,1 à 10 mL/min), 0n utilise des pompes débitmétriques
conçues pour maintenir un débit stable et non pulsé, on utilise pour cela deux
pistons de tailles ou de courses différentes.
Un des pistons situé en amont a un volume deux fois plus important que l’autre
situé en aval.
 Les pompes

Remarques :
1) Pour des débits très faibles (de 1 mL à 0,1 mL/min) on utilise des pompes «
seringues » mues par un moteur à vitesse linéaire constante.

2) Les pressions élevées utilisées en HPLC ne présentent pas de risque d’explosion

en raison de l’incompressibilité des liquides et des solides, un problème mécanique
se traduit généralement par une simple fuite du solvant.

Il existe deux modes de fonctionnement :

 Le mode isocratique pour lequel la composition de la phase mobile est fixe.
 Le mode gradient de solvant pour lequel on fait varier la composition du solvant
en cours d’analyse en vue d’améliorer les séparations et surtout de raccourcir les
temps d’analyse.
Les gradients de solvant nécessitent des pompes particulières permettant de faire
varier la composition du mélange éluant.
 Les pompes

Bien entendu ce type de chromatographie nécessite des pompes particulières. On

utilise le plus souvent un jeu de vannes proportionnelles pour mélanger les divers
solvants dans une chambre de mélange à basse pression avant d’envoyer le
mélange dans la pompe à haute pression.

Dans tous les cas on complète

le dispositif avec divers
éléments de régulation de la
pression et du débit en
particulier pour amortir les
pulsations.
 Injecteurs

L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne doit se faire en

un temps bref afin de perturber le moins possible le régime de circulation de la
phase mobile qui doit être stable de la colonne au détecteur. On utilise pour ce
faire, une vanne haute pression à plusieurs voies, manuelle ou motorisée dans le
cas des injecteurs automatiques, placée juste avant la colonne . Il s’agit d’une
pièce de précision qui doit résister à des pressions pouvant dépasser 30 000 kPa.

Dans la position chargement, où seule la communication entre pompe et colonne

est assurée , l’échantillon est introduit à pression atmosphérique à l’aide d’une
seringue dans un petit volume tubulaire appelé boucle. Celle-ci, dont il existe tout
un choix de volumes, est soit extérieure, soit intégrée dans le corps de la vanne.
Dans la position injection, l’échantillon est inséré dans le flux de phase mobile par
rotation de 60◦ d’un levier qui permet d’inverser le sens de circulation dans la
boucle. Une bonne reproductibilité des volumes n’est atteinte que si la boucle a été
totalement remplie par l’échantillon. Le volume prélevé avec laseringue est donc
toujours largement supérieur à celui de la boucle.
Injecteurs
 Colonnes
C’est la partie active du système, c’est elle qui joue le rôle prépondérant. La
colonne est un cylindre calibré généralement en acier inoxydable parfois doublé
d’un matériaux inerte (verre ou plastique spéciaux). Son diamètre varie de 0,5 à 5
mm et sa longueur de 0,5 à 30 cm. La phase stationnaire est maintenue entre deux
disques frittés.
Les colonnes « standard » dont le diamètre interne (DI) est d’environ 4,5 mm et la
longueur de 10 cm , sont de plus en plus supplantées par des colonnes de plus
faibles diamètres, baptisées narrow-bore (DI 2-4 mm), micro-bore (DI 1-2 mm),
capillaires remplies (DI 0,1-1 mm). Ces modèles sont apparus suite à l’évolution
des phases stationnaires customisées et pour simplifier les problèmes de couplage
avec la spectrométrie de masse.

Toute application en chromatographie correspond avant tout à une séparation. La

colonne doit donc avoir une efficacité suffisante. Une colonne courte permettra
d’aller plus vite. Une colonne étroite se traduira par une économie de phase
mobile. Ainsi pour une colonne standard, le débit est de l’ordre de 1 mL/min, alors
qu’il tombe à quelques μL/min pour une colonne micro-bore, ce qui nécessite des
pompes et des détecteurs adaptés – quelques gouttes suffisant pour éluer tous les
composés.
 Colonnes

Protection de la colonne :
La colonne est souvent précédée d’une pré colonne remplie de la même phase
stationnaire très courte (0,5 à 1 cm). Le rôle de la pré colonne est de fixer les
composé dont l’affinité avec la phase stationnaire est trop élevée et qui ne migrent
pas dans les conditions utilisée. La pré colonne est changée périodiquement.
 Colonnes
Filtration de l’échantillon
On utilise souvent un système de filtration de porosité inférieure à 0,5 mm pour fixer les
micro particules qui à la longue pourrait colmater la colonne, ce système de filtration peu
être intégré au circuit H.P.L.C entre injecteur et colonne, mais on peu aussi procéder en
amont en filtrant l’échantillon avant injection.
On utilise alors une seringue pour pousser l’échantillon à travers un filtre de très faible
porosité dont la nature dépend du solvant utilisé (aqueux ou purement organique) , une fois
l’échantillon filtré on procède à son injection.
On protège ainsi également l’injecteur qui peut être obstrué par des particules insolubles.
 Phases stationnaires

La recherche d’une bonne résolution chromatographique et par voie de

conséquence d’une efficacité élevée, a conduit à la création de phases
stationnaires de nature et de structures variées. Pour raccourcir les temps
d’analyse, il faut tenter d’accélérer dans la colonne les transferts entre les phases
mobile et fixe.

Le gel de silice
C’est la phase stationnaire la plus utilisée en chromatographie et notamment en
C.L.H.P.
Le gel de silice est constitué de micro sphères de diamètre sensiblement constant
pouvant varier de 2 à 5 mm.
Le diamètre doit être le même pour toutes les particules si on veut éviter la création
de chemins préférentiels.
Ces micro sphères sont obtenues par agglutination en présence d’un liant organique
urée/formol de microparticules (appelées sol-gel) elles mêmes obtenues par
polymérisation puis hydrolyse contrôlée du tétraéthoxysilane.
 Phases stationnaires

Une vue agrandie d’une micro sphère ressemblerait à la figure suivante ou l’on
voit que ces sphères ne sont en réalité pas homogènes et régulières et qu’il existe
des lacunes appelées pores. Ces pores jouent un grand rôle car elles constituent
des zones d’adsorption préférentielles.
 Phases stationnaires

Pour remplir la colonne d’une manière homogène, il est préparé sous forme, soit
de microparticules sphériques, soit d’un monolithe poreux

Représentations imagées de quelques types de gels de silice (porosité et dimensions).

1- structure comportant des pores de diffusion répartis dans la totalité de la particule.
2- structure comportant des fissures de perfusion pour accélérer le processus de transfert.
3 et 4- Particules poreuse en surface avec un noyau non poreux.
5- détail de structure d’un remplissage du type monolithique
 Phases stationnaires
L’emploi de particules de très faible diamètre (< 2 μm) augmente la surface de contact et
diminue l’HEPT, mais produit une perte de charge (pression qu'il faut appliquer pour faire
passer la phase mobile dans la colonne chromatographique) beaucoup plus importante que
pour les plus grosses particules. On est donc amené à réduire la longueur de la colonne, ce
qui va à l’encontre des performances. On gagne cependant en temps d’analyse. Les phases
monolithiques offrent une alternative intéressante à la fois parce que la perte de charge est
beaucoup plus faible et que les performances ne sont altérées par des débits élevés.

Nature de la phase stationnaire et efficacité.

L’HETP décroît avec la taille des particules, mais à débit identique la perte de charge
augmente. Les colonnes monolithiques améliorant les transferts de masse entre les
phases, apparaissent supérieures. Essais réalisés avec des colonnes de 5 cm remplies
d’une phase stationnaire RP-18 de même fabrication et en prenant le naphtalène comme
composé test.
 Phases stationnaires
Les propriétés des gels de silice dépendent de nombreux paramètres : structure
interne, porosité ouverte (dimension et répartition des pores), surface spécifique,
résistance à l’écrasement et polarité.
Le mécanisme d’action du gel de silice repose sur l’adsorption, phénomène qui
consiste en l’accumulation d’un composé à l’interface entre deux phases. Dans les
cas les plus simples, il y a formation d’une monocouche (isotherme de Langmuir),
mais souvent il se crée aussi une attraction entre les molécules déjà adsorbées et
celles qui sont restées en solution. C’est la raison principale de la non-symétrie des
pics d’élution.
Bien qu’ayant une capacité d’adsorption élevée, le gel de silice décrit
précédemment n’est plus utilisé tel quel en chromatographie analytique.
Hydrophile par nature, ses caractéristiques évoluent au cours du temps, entraînant
un manque de reproductibilité des séparations.

Phénomènes d’adsorption et de partage.

L’adsorption est un phénomène d’interface à la
différence de l’absorption
 Phases stationnaires
Les silices greffées
La surface des micro sphères de silice comporte des groupement silanol : Si – OH
qui sont essentiels au phénomènes d’adsorption en particulier parce qu’il
permettent la formation de liaisons hydrogène (chimiesorption)et sont responsables
de la polarité et de l’acidité de la silice. Ces groupement silanol s’ils sont trop
nombreux entraînent de trop importantes adsorption et leur nombre doit être
soigneusement contrôlé.
Pour de nombreuses application on préfère désactiver une partie de ces sites par
hydratation, l’eau est alors prioritairement adsorbée.
 Phases stationnaires
Le gel de silice ainsi modifié devient assimilable à un liquide immobilisé, la
séparation mettant en jeu les coefficients de partage et non plus les coefficients
d’adsorption. Ces phases greffées, dont la polarité peut être ajustée avec précision,
sont à l’origine de la chromatographie de partage à polarité de phase inversée,
utilisée dans quasiment toutes les séparations.
Ces modifications de la surface du gel conduisent à deux types de phases :

Phases monomériques (10–15 μm d’épaisseur). Elles sont obtenues en faisant

réagir un monochlorosilane en présence d’une base sur les fonctions silanols de
surface. On prépare ainsi les phases classiques RP–8 (groupement
diméthyloctylsilane) et RP–18 (groupement diméthyloctadécylsilane, ou ODS).
Une fraction des groupements Si-OH demeure cependant intacte. Elle peut être la
cause d’interactions polaires gênantes.

Phases polymériques (25 μm ou plus en épaisseur). On utilise cette fois un di-

ou trichlorosilane en présence de vapeur d’eau qui provoque une polymérisation
en solution du réactif avant dépôt et greffage sur la silice. On obtient ainsi une
couche polymérique réticulée.
Phases stationnaires
 Phases stationnaires
Les gels de silice précédents, comportant des greffons alkyles à 8 ou 18 atomes de
carbone, sont polyvalents et par conséquent très utilisés (65 % des applications),
mais pour améliorer la séparation de certaines classes de composés, il est fait
appel à des phases stationnaires spécifiques. Sur une âme de silice, sont fixés des
ligands porteurs de fonctions (groupements aminopropyle, cyanopropyle,
benzyle) ou des greffons dipolaires (zwitterions) pour conférer une polarité
intermédiaire à la phase stationnaire. La séparation des mélanges comportant à la
fois des constituants polaires et non polaires, qui exigent des phases mobiles
riches en eau, s’en trouve améliorée. Les sucres, les peptides et autres composés
hydrophiles deviennent séparables.

Le gel de silice, à son tour, peut être remplacé par l’alumine ou l’oxyde de
zirconium (ZrO2) comme supports de dépôts réticulés à base de polybutadiène ou
d’autres polymères styrène/divinylbenzène ou hydroxyméthylstyrène. Ces phases
OH pas greffe
stationnaires présentent une meilleure stabilité en milieu basique ou acide,
certaines colonnes pouvant être rincées à la soude 1M, ce que ne supportent pas
les liaisons Si–O–C. Signalons enfin que le graphite poreux sous forme de
sphères dont la surface est 100 % carbone, donc totalement hydrophobe, a reçu
des applications pour les composés ayant des facteurs de rétention élevés.
 Phases mobiles
Suivant un principe général, à une phase stationnaire polaire on oppose une phase mobile peu
ou pas polaire et vice-versa. La chromatographie est dite en phase normale dans le premier cas
et à polarité de phase inversée (« R − HPLC ») dans le second.
Sachant que la plupart des applications actuelles font appel à des gels de silice transformés, peu
polaires, de nature plutôt hydrophobe, on choisit comme phases mobiles des mélanges d’eau et
d’un modifiant tel le méthanol ou l’acétonitrile.
En changeant la composition de la phase mobile, donc sa polarité, on agit par l’intermédiaire
des coefficients de distribution K (CS/CM) sur les facteurs de rétention k des composés. La
difficulté pour le chromatographiste est de faire le bon choix en fonction des composés à
séparer.

« Force » des solvants utilisés comme phases mobiles.

On peut, en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d’élution de la phase mobile. On
notera que la viscosité, donc la pression en tête de colonne varie selon la composition de la
phase mobile.
 Phases mobiles
La composition de l’éluant et en particulier sa tension superficielle joue aussi un grand
rôle, plus la tension superficielle sera forte et plus le temps de rétention sera long.
L’eau est de tout les solvants celui qui présente la plus forte tension superficielle,
aussi, plus la teneur en eau sera importante et plus les composés seront retenus par la
peu polaire
phase stationnaire.
On pourra donc jouer sur les séparations en modifiant la teneur en eau de l’éluant, une
forte proportion en solvant organique diminuera le temps d’analyse mais cela au
dépend de la résolution.

Influence de la teneur en solvant organique dans la phase mobile :

On fait varier la polarité et la tension superficielle de la phase mobile en faisant varier
sa teneur en solvant organique. Cela joue à la fois sur les temps de rétention et sur les
facteurs de rétention k et modifie donc la qualité de la séparation.
On observe souvent une corrélation linéaire entre les logarithmes des facteurs de
rétention et le logarithme de la teneur en solvant organique.

log k = a log x + b

x est la teneur en solvant organique exprimée en pourcentage volumique

 Phases mobiles

Polarités de quelques familles de composés organiques ainsi que des principaux

types de greffons des phases stationnaires actuelles.
 Détecteurs
Il existe de nombreux types de détecteurs mais tous doivent avoir un certain nombre
de caractéristiques pour pouvoir être utilisés :
1) Réponse proportionnelle à la concentration de la substance détectée

2) Sensibilité élevée : c’est la pente de la droite : réponse = f (Concentration) plus

cette pente sera élevée et plus le détecteur sera sensible à de faibles variation de
concentration.
3) Inertie la plus faible possible : le détecteur doit avoir une réponse rapide et
réagir instantanément aux variations de la concentration. Il doit également avoir
un volume mort aussi petit que possible.
 Détecteurs
4) Grande stabilité du signal : ligne de base horizontale (dérive minimale) et la moins
bruitée possible
Pour qu’un pic soit exploitable on considère généralement que son rapport S/B
signal / bruit doit être au moins de trois.
Le bruit se traduit par des oscillations plus ou moins marquées autour de la ligne de
base, ce bruit de fond aléatoire provient de diverses causes : variation de
température, de la pression, instabilité électronique, etc.. Cas HPLC mn gradient d'elution
Par ailleurs on doit avoir une ligne de base aussi proche que possible de l’horizontale
c’est la dérive de la ligne de base.
ni identifier ni detecter
 Détecteurs
Détecteurs spectrophotométriques
La détection est basée sur la loi de Lambert-Beer (A =ελ.l.C) : l’absorbance A de la
phase mobile est mesurée en sortie de colonne, à la longueur d’onde λ ou plusieurs
longueurs d’onde dans l’UV ou le visible. La phase mobile ne doit pas, ou très peu,
absorber par elle-même. L’intensité de l’absorption dépend du coefficient
d’absorption molaire ελ, ce qui rend impossible, par la simple observation d’un
chromatogramme, de se faire une idée de la concentration des espèces repérées,
même de manière très approximative. La détection UV correspond donc à une
détection sélective. analyser uniquement des composes chromophore
Pour les composés qui n’ont pas de spectre d’absorption exploitable, on fait appel à
la « dérivation » post-colonne des analytes.
 Détecteurs
Ce type de détection U.V est la plus répandue, elle présente de nombreux
avantages :

 Très forte sensibilité on peut détecter des analytes jusqu’à des concentrations de
l’ordre de 10-8 mole.L-1.
 Grande sélectivité : on peut en choisissant bien sa longueur d’onde ne détecter
que le produit qu’on veut analyser ce qui simplifie le chromatogramme en
suprimant les pics indésirables.
 Les détecteurs pouvant mesurer l'absorbance à quatre longueurs d'ondes
simultanément ou ceux à réseau de diodes traçant le spectre permettent de
s'assurer de l'homogénéité d'un pic et ainsi se rendre compte d'une possible co-
élution simultanée de deux composés différents non résolus.
 renseignements spectraux sur les substances par le spectre UV (réseau de
diodes)
 peu sensible aux variations de débit et de température
 utilisation et entretien facile.
 peut être utiliser en mode gradient d'élution.
 Détecteurs
Détection monochromatique :
 La détection ne se fait alors que pour une seule longueur d’onde.
 Le modèle de base est composé de :
 une source monochromatique (lampe au deutérium ou au mercure)
 monochromateur isolant une bande étroite (10 nm) ou une raie (raie à 254 nm
du mercure par exemple)
 d’une cellule de circulation de volume faible (de quelques μL) avec un trajet
optique de 1 mm à 1 cm.
 d’un analyseur optique (photo multiplicateur ou photodiode)
 Détecteurs
Détection polychromatique.
Les détecteurs plus perfectionnés permettent soit d’enregistrer l’absorbance à
plusieurs longueurs d’onde quasi-simultanément, soit de capter en une fraction de
seconde tout un domaine de longueurs d’onde sans interrompre la circulation dans
la colonne.
On peut aussi grâce a un réseau de diodes (barrette de diodes) mesurer
l’absorbance simultanément dans tout un domaine du spectre, on obtient ainsi le
spectre UV de l’analyte ce qui
permet son identification. Dans la pratique les spectres sont stockés en mémoire
et sont visualisables par la suite à l’aide d’un logiciel approprié. On obtient un
« spectro-chromatogramme en trois dimension » : tR , A , λ
 Détecteurs
Détecteur spectrofluorimétrique

Les composés fluorescents réémettent sous forme de radiations lumineuses une

fraction plus ou moins grande du rayonnement de la source auquel ils sont soumis.
L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la concentration de la substance à
condition que celle-ci reste faible. Les détecteurs de fluorescence à la fois sensibles
et sélectifs sont utilisables pour les composés naturellement fluorescents et pour
tous ceux qui peuvent le devenir par traitement préalable à la détection.
Dans ce dernier cas on fait appel aux procédés de dérivation pré- ou post-colonne :
un automate placé soit avant la colonne soit entre la colonne et le détecteur
effectue une ou plusieurs réactions sur les composés afin de les rendre fluorescents.
En suivant ce principe, on dose les traces de carbamates (pesticides) dans
l’environnement, par saponification avec de la soude puis réaction sur l’aldéhyde
o-phtalique, pour transformer la méthylamine en un dérivé fluorescent.
Ce type de détecteur est très sensible (100 à 1000 fois plus que le détecteur U.V) et
très sélectif.
Détecteurs
 Détecteurs
Détecteur réfractométrique

Ce type de détecteur comporte un réfractomètre différentiel qui a pour objet de

mesurer en continu la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et
l’effluent de la colonne.
Pour cela un faisceau lumineux (mono- ou polychromatique) passe à travers une
cellule comportant deux compartiments dont l’un est rempli avec la phase mobile
seule et l’autre
avec l’effluent en sortie de colonne. La différence d’indice entre les deux liquides,
qui apparaît lorsqu’un composé est mélangé à l’éluant, se traduit par un
déplacement angulaire du rayon réfracté.

Il est pratiquement universel mais très peu sensible, il est de plus sensible aux
variations de températures. Il est inutilisable en mode gradient sauf si les solvants
utilisés ont des indices de réfraction très proches. Les pics obtenus peuvent être
positifs ou négatifs selon que l’indice de réfraction augmente ou diminue.