A.

6/ Chromatographie liquide de haute performance (CLHP)

High performance liquid chromatography (HPLC, en anglais)

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• L’HPLC est classée parmi les techniques chromatographiques liquides
modernes.

• Son champ d'applications comprend en grande partie celui de la

chromatographie en phase gazeuse (c.à.d. la CLPH peut analyser une grande
partie des molécules qu’on peut aussi analyser par CG).

• Elle a aussi pour objectif de séparer des molécules non chargées, non
volatiles et thermiquement instables.

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• L’ CPLH présente de nombreux avantages:

1. La résolution et la vitesse d’analyse sont de loin meilleures que les techniques

classiques: donc, l’CPLH est plus rapide et plus précise.
2. Les colonnes de l’CPLH peuvent être réutilisées sans avoir à les remplir ou à les
régénérer.
3. La reproductibilité de l’analyse est considérablement améliorée car les
paramètres qui peuvent agir sur l’efficacité de la séparation peuvent être
étroitement contrôlés.
4. Le fonctionnement de l’appareil et l’analyse des données sont facilement
automatisés.

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• A QUOI SONT DUS CES AVANTAGES?
Ils sont dus:
1. Au développement de supports stationnaires très élaborés. Ce sont des micro-
particules sphériques dont le diamètre est compris entre 2 et 5 µm ou de matériaux
monolithiques poreux (voir figure ci-dessous).
2. A l’amélioration du débit d’élution en appliquant de fortes pressions au flux de
solvant.

Sphériques Monolithiques

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• Plus les particules formant la phase stationnaires sont petites et plus il est difficile
d’y faire écouler le solvant. On doit donc utiliser des pompes spéciales qui
poussent le solvant sous des pressions très élevées à travers la colonne.

La particularité de la CLHP est de faire intervenir des mécanismes d’échange

soluté/phase mobile/phase stationnaire basés sur les coefficients d’adsorption ou de
partage.

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 A.4.5/ La HPLC

• A l’origine, le P de C.L.H.P correspondait donc au mot Pression. Actuellement, la

grande efficacité de la technique font que le P désigne le mot Performance.

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NOTION DE BASE & PRINCIPE

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 Notions de base
• Le temps de rétention d’un soluté en HPLC =
tR = le temps nécessaire pour avoir le maximum
d’élution d’un soluté particulier. Il est analogue
aux mesures du temps de rétention en GC.

• Le volume d’élution d’un soluté = VR = le

volume de solvant nécessaire pour éluer un
soluté et il est défini par l’équation suivante
avec F, le débit d’élution:
VR = F * tR

• La résolution (ou une mesure de l’efficacité de

la colonne) = R = elle indique la façon dont les
solutés sont séparés; elle est définie selon
l’équation suivante où tR(A) et tR(B) sont le temps R>1 bonne séparation
de rétention de deux solutés et, wa et wb sont R<1 mauvaise séparation
la largeur des pics à la base de ces deux mêmes donc les paramètres
solutés: appliqués à la colonne ne
sont pas les bons.
R = 2 * ( tR(A) - tR(B) )/(wa - wb)
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Principe :
• Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant.
• La phase mobile liquide (éluant), poussée par une pompe sous haute pression,
parcourt le système chromatographique: l’injecteur, la colonne dans le four et le
détecteur. La température du four est maintenue constante.
• Le mélange à analyser est injecté puis, transporté au travers du système
chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité
entre la phase mobile et la phase stationnaire.
• En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont
caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

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 Instrumentation

Porte solvants
(phase mobile)

Dégazeur

Pompe analytique

Module Injecteur
(auto-échantillonneur)

Compartiment thermostaté
de la colonne

Détecteur UV

• Une installation de CLHP comporte divers modules spécialisés (= chaque module à sa

propre fonction), qui se présentent dans des boîtiers distincts ou intégrés dans un même
châssis pour des raisons de moindre encombrement (c.à.d. pour prendre moins de place). 10
 Instrumentation
L’injecteur

L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne doit se faire en un

temps bref afin de perturber le moins possible le régime de circulation de la phase
mobile qui doit être stable de la colonne au détecteur. On utilise pour ce faire, une
vanne haute pression à plusieurs voies, manuelle ou motorisée dans le cas des injecteurs
automatiques, placée juste avant la colonne . Il s’agit d’une pièce de précision qui doit
résister à des pressions pouvant dépasser 30 000 kPa.

Vanne d’injection pour CLHP et boucles assorties

Vanne vue de l’arrière (vanne à 6 entrées/sorties avec une boucle
raccordée) et assortiment de boucles de différents volumes

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 Instrumentation
L’injecteur
Elle fonctionne en deux temps :

➤ Dans la position chargement (a), où seule la

communication entre pompe et colonne est assurée,
l’échantillon est introduit à pression atmosphérique
à l’aide d’une seringue dans un petit volume
tubulaire appelé boucle. Celle-ci, dont il existe tout
un choix de volumes, est soit extérieure, soit
intégrée dans le corps de la vanne.

➤ Dans la position injection (b), l’échantillon est

inséré dans le flux de phase mobile par rotation de
60 ◦ d’un levier qui permet d’inverser le sens de
circulation dans la boucle. Une bonne
reproductibilité des volumes n’est atteinte que si la
boucle a été totalement remplie par l’échantillon. Le
volume prélevé avec la seringue est donc toujours
largement supérieur à celui de la boucle.

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PHASES STATIONNAIRE & MOBILE

13
Choix de la phase mobile et stationnaire:

• Le succès d’une séparation par CLPH dépend à la fois de la colonne et du solvant

choisis.

• Plusieurs propriétés du solvant doivent être considérées, à savoir:

 Sa pureté: des solvants de pureté élevées sont requis. Plusieurs laboratoires

ne peuvent acheter ces solvants à cause de leur coût élevé, ils préfèrent purifier
des solvants de moindre grade par microfiltration.

Sa réactivité: la phase mobile ne doit pas réagir avec l’échantillon analysé et
la phase stationnaire dans la colonne.

Sa compatibilité avec le détecteur: un solvant doit être choisi avec

précaution pour éviter les interférences avec le détecteur.

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Choix de la phase mobile et stationnaire:
• Suivant un principe général, pour une phase stationnaire polaire, on utilise une
phase mobile apolaire et vice-versa. La chromatographie est dite :

 en phase normale dans le premier cas (PS: polaire et PM: apolaire). Les molécules
apolaires s'éluent plus rapidement tandis que des molécules polaires sont retenus.

 à polarité de phase inversée (« RP − HPLC ») dans le second cas (PS: apolaire et

hydrophobe ; et, PM: polaire).Un composé polaire migre plus vite qu’un composé
apolaire. En revanche, les composés polaires sont assez difficiles à séparer entre eux.
Il faut réaliser des gradients d’élution.

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Choix de la phase mobile et stationnaire:

Intérêt d'un gradient de solvant

Dans la pratique, on procède par tâtonnement pour obtenir le résultat le plus

satisfaisant. Les appareils actuel peuvent ainsi mélanger jusqu'à 4 solvant différents
dont chacun peut lui même être déjà un mélange de solvants différents il y a donc
de grandes possibilités en ce domaine.

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La phase stationnaire: (Pour chromatographie en phase normale)
Le gel de silice est la matière de base des phases stationnaires actuelles.
Ce matériau très polaire comporte des groupements silanols (Si–OH) en nombre
variable.

Remarque: inconvénient de la silice: au pH<2

(hydrolyse Si-O-Si-R) et au pH>8 (dissolution)

Cependant, le gel de silice n’est plus utilisé tel quel en chromatographie analytique. De
nature hydrophile, ses caractéristiques changent au cours du temps entraînant un
manque de reproductibilité des séparations.

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La phase stationnaire: (Pour chromatographie en phase inversée)

Pour diminuer sa polarité, on rend le gel de silice essentiellement hydrophobe. Pour

cela, on fixe des molécules organiques sur les fonctions silanols présentes en surface
du gel. Une grande partie des groupements silanols est alors éliminée.

Le gel de silice ainsi modifié devient assimilable à un liquide immobilisé, la séparation

mettant en jeu les coefficients de partage et non plus les coefficients d’adsorption.

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La phase stationnaire:
Stockage des colonnes :
Les colonnes non utilisées doivent être hermétiquement bouchées imprégnées avec un
solvant approprié (très souvent le méthanol) pour éviter un assèchement très néfaste.
Selon le type de phase stationnaire on utilisera un solvant de stockage différent
comme suit :

Silices vierges :
Hexane 50 mL – Dichlorométhane 50 mL – Isopropanol 50 mL – dichlorométhane 30
mL – solvant de stockage 50 mL (ou éluant si purge )

Phase inverse : C1, C2 , C6, C8, C18, phényle,

Eau distillée 50 mL – Méthanol 50 mL – Acétonitrile 50 mL –THF 50 mL – Méthanol 50
mL – (Eluant si purge)

Phase normale : CN, NH2, Diol, PAC

Chloroforme 50 mL – Dichlorométhane 50 mL – Isopropanol 50 mL –
dichlorométhane 30 mL – solvant de stockage 50 mL (éluant si purge)

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La phase stationnaire: CONCLUSION

 Colonnes utilisées en chromatographie à polarité de phase normale: elles sont

remplies de silice (phase stationnaire polaire). Elle doit sa polarité aux groupements
silanols Si-OH qui sont polaires. Pour que la séparation soit efficace, la phase mobile doit
alors être peu polaire. Les solutés sont élués dans l'ordre de polarité croissante (du moins
polaire au plus polaire) (Exemple: carbure, puis cétone enfin alcool).

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 La phase mobile: (Pour chromatographie en phase inversée)

 Colonnes utilisées en chromatographie à phase inverse: sur les particules de silice

(support) ont été greffées des chaînes alkylées (le plus souvent de chaines alkyles à 8 ou 18
atomes de carbones ou autres) pour faire une phase stationnaire apolaire. Dans ce cas, pour
que la séparation soit efficace, la phase mobile est polaire (généralement à base d’eau). Les
solutés sont élués dans l'ordre de polarité décroissante (du plus polaire au moins polaire).

Sachant que la plupart des applications actuelles font appel à des gels de silice
transformés (peu polaires et hydrophobe), on choisit comme phases mobiles des
mélanges d’eau et d’un modifiant comme le méthanol ou l’acétonitrile. 21
DETECTEURS

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Détecteur UV - Visible
Détection polychromatique
Les détecteurs plus perfectionnés permettent d’enregistrer l’absorbance à plusieurs
longueurs d’onde quasi-simultanément,

Le détecteur à barrette de diodes permet non seulement d’obtenir un

chromatogramme, mais il fournit des renseignements spectraux pouvant servir à
s’assurer de l’identité des composés séparés. C’est ce qu’on nomme l’analyse de
certitude

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 APPLICATION 1
Conditions
Column: Discovery C18, 15 cm x 4.6 mm, 5 μm particles
Mobile Phase: methanol/water (60:40)
Flow Rate: 1 mL/min
Temp: 30°C
Det: 254 nm UV
Inj: 10μL, 1 μg/mL each analyte

Analyte Data
1. Aniline
2. N-Ethylaniline
3. N-Propylaniline
4. N,N-Dimethylaniline
5. N-Butylaniline
6. N,N-Diethylaniline

A partir des chromatogrammes déterminer quand cela est possible, la nature

et la concentration des composés présents dans l'échantillon.

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25
 APPLICATION 2
On obtient le chromatogramme suivant pour une solution étalon contenant 13
antidépresseurs à la même concentration de 20 mg/L.
Le premier pic correspond à une impureté contenue dans le solvant.

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Un comprimé d'un médicament contenant deux antidépresseurs est dissout dans
250 mL d'éluant puis injecté dans les même conditions que l'étalon précédent.
On obtient le chromatogramme échantillon suivant.

Quels sont les deux antidépresseurs présents ?

Quelle masse un comprimé en contient-il ?

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