Technique analyses (révision)

tp1 HPLC
Partie théorique
Qu'est-ce que l'HPLC ?

1- Explication

HPLC: High Performance Liquid Chromatography.

High Performance ou haute performance dans le contexte de l'HPLC met l'accent sur la qualité, la
rapidité et l'efficacité de la séparation des composants dans un échantillon liquide.

Chromatography : la séparation des composants.

2- Définition

L'HPLC (Chromatographie Liquide à Haute Performance) est une technique analytique utilisée pour
séparer, identifier et quantifier les composants d'un mélange liquide.

3- Mode de fonctionnement de l’HPLC

Le mode de fonctionnement ma3narou kifah takhdem l’appareille hadi li essmha HPLC .

• Awal haja nkhdmou des solutions (wahd ta3 colorant azoique w solution lakhor ta3 phenol)
• Nahkm nhaz chwiya men kola solution w nkhlathom (3lah nkhalathom ? puisque hada le
melange li khrjlna, rah ndirlou analyse fi HPLC, ma3natha rah ndirlou identification na3rf
wach kain fih, w ndirlou quantification ma3natha na3rf concentration ta3 phenol gdah ?w
na3raf concentration ta3 colorant azoique gdah ? w na3rf chkon howa le plus polaire w na3rf
tani ch7al khain men composé fi le mélange ta3na hadak li khalatnah )
 • 9bal mandir l’analyse, n7oto la phase mobile fi réservoir (fi tp ta3na hada la phase mobile
hiya l’eau et l’acetonitrile)
• Ncha3lou système de pompage ta3na (la pompe tmaachiiilna la phase mobile fi l’appareille
kamla)
• 9bal manbdaw l’analyse lazm ndirou nettoyage lhadi l’appareille b la phase mobile bah na7iw
les impuretés les kainin fi la colonne ta3na (ya3ni li kainin fi la phase stationnaire)
• Njib seringue nhaz biha des microlitres man le melange li khdamto
• Chouf fi la photo lfo9 talga boucle d’injection (hadik l boucle fiha deux fonction laod et inject
), ki n3amerha ndir laod w ki nbda nmachi l’echantillion ta3i fi la machine ndir inject .
• Hada le melange (phenol et colorant azoique ) li dertlou injection , ra7 thazou la phase mobil
m3aha tadih la colonne.
• 9bal manro7o la colonne lazm tafham bali l’HPLC ta3na hadi li rana n9raw fiha rahi HPLC de
partage type inverse (ma3natha la phase mobile rahi polaire et la phase stationnaire rahi a
polaire)
• Narj3ou drk win kona, la phase mobile ta3na ay tmchi fi circuit ta3 l’appareille w tmachi fi le
mélange (echantillion) ta3na m3aha , hadik l’echantillion troh la colonne, ki todkhol fiha tbda
la separation des composes chimique ma3naha (la separation ta3 le melange li khdmnah).
• Kifh na3rf bali srat separation ? , l’appareille ta3na fiha détecteur et affichage , hadak le
détecteur ymad signale l’affichage w ybanoulna des pics hadou ngouloulhom des
chromatogrammes.
• Pic ta3na li tokhroj lowla hiya ta3 composé le plus polaire (puisque la phase mobile ta3na rahi
polaire donc 3ando affinité liha w yokhroj howa lowal), pic tanya li tokhroj hiya ta3 le
composé apolaire (3la khater ma3ndouch affinité m3a la phase mobile donc ytawl bah
yokhroj), 3ndo affinité m3a la phase stationnaire.
• Drka na9drou na3rfou ch7al kain mn composé fi le mélange a partir les pics (les
chromatogrammes), ya3ni kol pic ta3 composé.
• Fi l’HPLC ta3na hadi, katbin fi la colonne C8 (ma3natha chaine aliphatique fiha 8 carbone)

Le mode de fonctionnement de l'HPLC, ou chromatographie liquide à haute performance, implique

plusieurs étapes clés :

• Injection de l'échantillon : L'échantillon est introduit dans le système HPLC à l'aide d'une
seringue. Généralement, de petites quantités (microlitres à millilitres) de l'échantillon sont
injectées dans le flux de la phase mobile.
• Pompage de la phase mobile : La phase mobile, souvent un mélange de solvants, est
pompée à haute pression à travers la colonne chromatographique. Cette pression élevée est
maintenue par une pompe HPLC pour permettre un écoulement constant de la phase mobile
à travers la colonne.
• Interaction avec la phase stationnaire : La colonne chromatographique contient une phase
stationnaire. Les composants de l'échantillon interagissent différemment avec cette phase
stationnaire en fonction de leur polarité, de leur taille, de leurs liaisons chimiques, ce qui
entraîne leur séparation pendant leur passage à travers la colonne.
• Séparation des composants (Chromatography) : Les composants de l'échantillon se séparent
en fonction de leur affinité relative pour la phase stationnaire et la phase mobile. Certains
 composants interagissent plus fortement avec la phase stationnaire et sont ralentis, tandis
que d'autres se déplacent plus rapidement. Cela crée une séparation entre les composants.
• Détection : Une fois les composants séparés, ils passent devant un détecteur qui analyse leur
présence et leur concentration. Les détecteurs courants en HPLC incluent les détecteurs
UV/Vis, les détecteurs à fluorescence, les détecteurs à indice de réfraction, ou même les
détecteurs de masse (MS).

Analyse des données : Les signaux générés par le détecteur sont enregistrés et analysés par un
logiciel spécialisé. Ces données sont ensuite utilisées pour quantifier les composants présents dans
l'échantillon.

Quels sont les composants essentiels d'un système HPLC ?

Un système HPLC comprend une pompe pour déplacer le solvant, une colonne chromatographique
(stationnaire), un détecteur pour mesurer les composants et un système d'injection pour introduire
l'échantillon.

Quelle est la différence entre HPLC et chromatographie liquide classique ?

L'HPLC utilise des pressions plus élevées et des colonnes plus fines, offrant une meilleure résolution
et une séparation plus rapide des composants par rapport à la chromatographie liquide classique.

Comment fonctionne la séparation des composants en HPLC ?

Les composants de l'échantillon interagissent différemment avec la phase stationnaire à l'intérieur de

la colonne, ce qui entraîne leur séparation en fonction de leur affinité relative pour la phase
stationnaire et la phase mobile.

Quels sont les types de détection utilisés en HPLC ?

R : Les détecteurs courants en HPLC comprennent les détecteurs UV/Vis, les détecteurs à
fluorescence, les détecteurs à indice de réfraction, les détecteurs de masse (MS), entre autres.

Quelles sont les applications ou les utilisations de l'HPLC ?

L'HPLC est largement utilisée dans l'analyse pharmaceutique, la recherche biomédicale, le contrôle
qualité dans l'industrie alimentaire, l'analyse environnementale, la recherche en sciences des
matériaux, et bien d'autres domaines pour son efficacité dans la séparation et l'analyse des
composants complexes.

Qu'est-ce que la phase mobile en HPLC ?

La phase mobile en HPLC est le solvant (liquide ou mélange de liquides) utilisé pour transporter
l'échantillon à travers la colonne chromatographique.

Quel est le rôle de la phase mobile en HPLC ?

La phase mobile permet de déplacer l'échantillon à travers la colonne chromatographique, favorisant

ainsi l'interaction des composants avec la phase stationnaire pour leur séparation.
Quels facteurs influencent le choix de la phase mobile en HPLC ?

La sélection de la phase mobile dépend de plusieurs facteurs tels que la nature des composants de
l'échantillon, la sélectivité requise, la solubilité des analytes, et les exigences de la méthode
analytique.

Comment le choix de la phase mobile affecte-t-il la séparation des composants en HPLC ?

La phase mobile influence l'interaction entre les composants de l'échantillon et la phase stationnaire,
ce qui affecte la séparation des analytes en modifiant leur vitesse de migration et leur affinité relative
pour la colonne chromatographique.

Qu'est-ce que la phase stationnaire en HPLC ?

La phase stationnaire en HPLC est le matériau fixe à l'intérieur de la colonne chromatographique sur
lequel les composants de l'échantillon interagissent lors de la séparation.

Quel est le rôle de la phase stationnaire en HPLC ?

La phase stationnaire permet la séparation des composants en fonction de leur affinité relative avec
cette phase, en modifiant leur temps de rétention et leur migration à travers la colonne.

Quels sont les types de phases stationnaires utilisées en HPLC ?

Les phases stationnaires en HPLC peuvent être des matériaux poreux (comme des gels de silice ou
des polymères), des phases chimiquement modifiées pour une sélectivité spécifique, ou des phases
monolithiques avec une structure continue.

Comment choisir la phase stationnaire appropriée en HPLC ?

Le choix de la phase stationnaire dépend de la nature des composants à séparer, de leurs interactions
souhaitées avec la phase stationnaire, de la polarité, de la taille des particules, et des conditions
opératoires spécifiques.

Comment la phase stationnaire affecte-t-elle la séparation en HPLC ?

La phase stationnaire influence la séparation en permettant des interactions sélectives avec les
composants de l'échantillon, ce qui modifie leur temps de rétention et leur ordre d'élution, facilitant
la séparation.

Manipulation TP HPLC