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Chapitre N6

Le Greffage

La Chromatographie de Partage
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Sommaire

I) Introduction page 3

II) Le greffage page 4

21 La raction de greffage
22 Le End-Capping

III) La chromatographie de partage en phase inverse page 6

31 La phase stationnaire
311 Longueur et diamtre de colonne
312 La nature du greffon
313 Le nombre de greffons
314 Surface hydrocarbone
32 La phase mobile
321 Rle de leau
322 Rle de la composante organique
323 Dveloppement isocratique et en gradient dlution
33 Les soluts
331 Le partage dans le systme octanol / eau
332 Les paramtres de solubilit
IV) Les constituants de la chane HPLC page 14
41 Les pompes

42 Linjection

43 La dtection
431 Gnralits
432 Les diffrents dtecteurs
433 Les dtecteurs absorptiomtriques
434 Rfractomtre et DDL
435 Les autres dtecteurs
V) La drivatisation page 21

51 Drivatisation pr colonne
52 Drivatisation post colonne

VI) Les autres techniques chromatographiques page 23

61 Lappariement dions
62 La chromatographie chirale
63 La permation de gel
64 Lchange dions
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I) Introduction

Comme on la vu dans le chapitre prcdent, la chromatographie dadsorption prsente


ses limites et ses contraintes, que ce soit au niveau de la polarit de la phase stationnaire, dans
son maintien dtat dactivit et dans la prparation des phases mobiles. Ds le dbut du
XXme sicle, aprs les travaux de Tswett, les scientifiques ont utilis, en colonne ouverte, une
multitude de supports chromatographiques, (brique pille, verre) pour tester leur aptitude
interagir avec des soluts, le tout stant sold par une concentration de rflexion sur les
silices et les alumines.

Hors cet aspect tait limitatif, en tant quinteractions, du fait de la polarit de la phase, les
chercheurs ont tent de modifier celle-ci en adsorbant des composs trs polaires (amines,
polyols) la surface de celle-ci. Ils ont obtenu, ainsi, des phases stationnaires de polarit
diffrente permettant daccrotre leur champ dinvestigation. On peut citer par exemple,
ladsorption de polyamines lourdes polyfonctionnelles qui sadsorbaient irrversiblement
la surface des silices, par liaisons hydrognes, et qui conduisaient lobtention de nouveaux
supports chromatographiques. Cette technique prsentait des avantages, au niveau du
laboratoire, car elle permettait dobtenir in situ des phases de polarit diverses, la
discrtion de loprateur. A partir dune silice nue, il pouvait crer une phase stationnaire
adapte son problme.

En contrepartie, elles avaient leurs inconvnients : Le principal est li leffet de Bleeding


li la dsorption de lentit adsorbe sur le support siliceux.. En effet, sous laction du flux
de phase mobile et des forces que cela gnre, lespces adsorbe, au cours du temps, tait
dsorbe de la surface et limine de la colonne chromatographique, ce qui conduisait,
terme, lobtention dune colonne de silice nue. Il sensuivait des problmes de
reproductibilit des analyses qui ne pouvaient tre transposables lchelle du contrle.

Pour rsoudre cette difficult, il fallait pouvoir immobiliser ces entits la surface du
support. Dans les annes 1970, la technique dimmobilisation, par greffage, a t
suffisamment matrise pour tre dveloppe et commercialise.

Le second aspect de lvolution de ces techniques chromatographique est li la technicit.


En effet, lamlioration des rsolutions chromatographiques passait par lutilisation de
supports de granulomtrie plus petites (en colonne ouverte, on utilise classiquement des
granulomtrie de plusieurs dizaines de microns). Hors ces granulomtries plus petites
gnrent des pertes de charges trs importantes (loi de Darcy : la perte de charge est
inversement proportionnelle au carr du diamtre des particules) et on ne disposait pas de
systme de pompage permettant dassurer des dbits constants (classiquement 1 ml/mn) sous
des pressions de plusieurs centaines de bars. Il fallut attendre lvolution de la mcanique
pour pouvoir disposer de pompes fiables rpondant ces critres, ce qui fut ralis dans les
annes soixante
( ceci explique le terme originel de HPLC : chromatographie liquide haute pression, les
pressions appliques en tte de colonne taient alors de lordre de 400 bars).

La conjonction de ces deux phnomnes a vu lexplosion de cette technique dans les annes
1970 et son dveloppement pour en faire, aujourdhui, une technique de contrle, que lon
peut qualifier dincontournable.
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II) Le greffage des silices

21 La raction de greffage

Deuxime tape de cette volution, le greffage constitue une pierre angulaire du


dveloppement de la chromatographie et de sa terminologie.

Pour simplifier le problme, le greffage a consist immobiliser, par cration dune liaison
chimique covalente, une entit sur un support siliceux. Divers types de greffage ont t
utiliss avec plus ou moins de satisfaction : On ne retiendra que, cest le plus stable et le plus
utilis, que le greffage par les silanes. Il consiste a crer une liaison Si-O-Si entre un silanol
du support siliceux et le silicium dun drivs sillyl adapt suivant le schma ractionnel :

R1 R2
O Cl O
O O
Si + Si Si
O
O
R2
R3
O
Si
R3 + HCl

H O R1

R1, R2 et R3 pouvant prsenter nimporte quelle fonctionnalit. Dune manire gnrale, Un


des substituants, R3 du driv sillylant, porte la fonctionnalit que lon veut introduire sur le
support siliceux, les deux autres (R1 et R2) tant, soit des halognes soit des fonctions
theroxydes qui shydrolysent pour librer des silanols ce qui conduit des phase
stationnaires du type :

O R2 O OH
O H2O O
Si Si Si Si
O R3 O R3
O R1 HO
O

Suivant la nature de R3, on peut, par ce biais, obtenir des phases stationnaires de polarits trs
tendues. Historiquement, les premires phases greffes prsentaient un radical
R3 = octadcyl (C18H37). Depuis, la nature des greffons sest largement toffe : On rencontre
classiquement des greffons de type alkyl (C8H17, C3H7 , C2H5) de type phnyl (C6H5), de type
amine (C3H6NH2), nitrile (C3H6CN) et autres polyols (propylne glycols.).

On comprendra aisment que lon peut (cest pas toujours simple) greffer nimporte quelle
fonctionnalit sur un support siliceux par ce type de mcanisme et ainsi obtenir une palette de
phases stationnaires de fonctionnalit et de polarit diffrentes. Cet aspect est largement
utilis de nos jours lchelle du laboratoire (synthse de phases chirales) et lchelle du
laboratoire de contrle (commercialisation dun grand nombre de supports greffs aussi bien
en colonne quen plaques CCM).

Le greffon tant physiquement liquide, on ne parlera plus de chromatographie dadsorption


(chromatographie liquide-solide) mais de chromatographie de partage(chromatographie
liquide-liquide) entre une phase liquide (la phase mobile) et une phase liquide (le greffon)
immobilise sur un support solide.
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A ce propos, on observe actuellement un large dveloppement de supports non plus siliceux


mais polymriques (co-polymres styrne-divinyl benzne) qui prsentent certains avantages
par rapport aux silices (on va rapidement comprendre pourquoi).
Comme on vient de le voir, cette notion de greffage et de silices greffes introduit un nouveau
concept en terme de chromatographie : Le partage. Pour bien comprendre la terminologie
utilise, on doit se replacer dans le contexte technique : A lorigine, on utilisait un support
polaire (phase stationnaire que ce soit des silices ou des alumines) et des phases mobiles peu
polaires. On parlait alors de chromatographie en phase normale. Avec lapport du greffage (et
notamment des phases octadcyle C18), on a utilis des phases stationnaires apolaires avec des
phases mobiles, au contraire, trs polaires, do le concept de chromatographie en phase
inverse qui sest largement rpandu et que lon dveloppera dans le paragraphe suivant. On
peut cependant, ds prsent dresser un tableau dapplication de cette chromatographie de
partage en fonction de la nature du solut et des polarit des couples (phase mobile / phase
stationnaire) utiliss :

Solut Polaire Moyennement Moyennement Peu et apolaire


polaire polaire
Eluant Moyennement Faiblement Fortement Moyennement
polaire polaire polaire polaire
Exemple CH2Cl2/Hexane CH2Cl2/Hexane CH3OH/H2O CH3OH/H2O
80/20 (v/v) 5/95 (v/v) 40/60 (v/v) 90/10 (v/v)
Phase Silice greffes Silices greffes Silices greffes Silices greffes
stationnaire polaires polaires peu et apolaires peu et apolaires
NH2, CN, Diols NH2, CN, Diols Phnyls, C18, Phnyls, C18,
C8 C8
Type de Partage en Partage en Partage en Partage en
chromatographie phase normale phase normale phase inverse phase inverse

Avant de dvelopper la chromatographie de partage en phase inverse, il est bon de complter


cet aspect greffage par le traitement que doivent subir ces supports afin de conduire des
chromatogrammes de bonne qualit. On comprendra aisment que lors de cette tape de
greffage, tous les silanols de la surface du support siliceux ne seront pas atteint par le ractif
sillylant. Il sensuit quil va en rester et que ceux-ci resteront des sites potentiels dadsorption,
ce qui peut conduire des interactions nfastes (tranes de pics chromatographiques..). On
rsoud ce problme par le traitement de End-capping.

22 Le End-capping

Afin dliminer (partiellement) ces silanols rsiduels (aprs greffage), les supports siliceux
sont traits pat un agent sillylant chane courte (le TMCS, Trimthyl Chlorosilane, en
gnral), qui lavantage, par sa taille, de pouvoir ragie chimiquement, avec les silanols qui
ne pourraient le faire par gne strique :

CH3
O-Si-C18H37 Cl
O-Si-C18H37 Si(CH3)3
Si
O Si O OH CH3
H3C O Si O O
O O O O
Si O Si Si Si O Si Si + HCl
O O O O O O
O O O O O O
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A lissue de ce traitement, la surface du support prsente donc des sites greffs par lentit
choisie(octadcyl par exemple) des sites end-capps et des silanols rsiduels qui ne sont pas
accessibles aux molcules de trimthylchlorosilane. La prsence de ces derniers ne gne pas
lanalyse chromatographique dans la mesure ou ntant pas accessible la molcule de
TMCS, il ne le seront pas, non plus, aux molcules de soluts. On peut donc schmatiser la
surface finale du support chromatographique (dans le cas dune silice greffe octadcyle) :

(H3C)3Si
O

H37C18-Si-O O Si O
O OH
Si Si Si O-Si(CH 3)3 O-Si-C 18H37
O
O O O
O O O Si O O Si O
O
O Si O
O Si Si O
O O
O O O

Pour conclure sur ce thme du greffage, on notera que dans le cas de petits greffons (C2, C3)
on a recours un spacer (bras) pour loigner celui-ci de la surface du support siliceux et
favoriser ainsi les interactions spcifiques entre le greffon et le solut.

Comme on a pu le constater dans ce paragraphe, le greffage sest considrablement dvelopp


autour du concept de phase inverse. Lapparition de ce type de phase dans les annes 1970 a
rvolutionn le monde la chromatographie et cette technique a supplant ladsorption au point
que 80 % des sparations chromatographiques sont aujourdhui ralises par chromatographie
de partage en phase inverse. Ce qui justifie le paragraphe suivant.

III) La chromatographie de partage en phase inverse.

Pour illustrer cette technique, on sappuie sur la norme analytique concernant le dosage
dhydrocarbures aromatiques polycycliques ( P.H.A : polluants) dans leau (NF T 90-115).
La structure des six PHA quantifis est prsente ci-dessous :

Fluoranthne C16H10 Benzo (a) pyrne C


20H12 Benzo (b) fluoranthne C
20H12
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Benzo (k) fluoranthne C


20H12 Indno(
1, 2, 3-cd) pyr ne C
22H12 Benzo (g,h,i)prylne22CH12
La mthode met en uvre :

- Une phase dextraction au cyclohexane


- Une phase de concentration (1 ml) sous pression rduite
- Une phase de purification sur colonne dalumine
- Une phase de concentration et reprise 1 ml de solvant
- Une analyse pare chromatographie HPLC

La phase dextraction est ralise sur une eau brute (volume V1 = 250ml) par 25 ml de
cyclohexane, labri de la lumire, les PHA tant sensibles la photo-oxydation. Aprs
sparation des phases organiques et aqueuses, la fraction organique est sche sur sulfate de
sodium anhydre puis concentre environ 1 ml sous pression rduite.

Dans la phase de purification, on utilise une colonne dalumine pralablement active


(schage 550C dans un four pendant 2h) puis conservation dans un flacon avec 6% deau.
On retrouve ici, cette notion dactivation et disohydrie du support voque dans le chapitre
prcdent. A partir de ce support, une colonne (200 mm, diamtre 6 mm) est ralise.
Lextrait, prcdemment obtenu est dpos en tte de colonne, puis lu par du cyclohexane.
Les six HAP tant de nature trs peu polaires, les impurets restent fixes sur la colonne
chromatographique et les HAP luent avec le solvant comme schmatis ci-dessous :

Solution Cyclohexane
Cyclohexane

HAP + impurets Impurets

Gel dalumine Gel dalumine

Eluat = Cyclohexane Eluat = Cyclohexane


+ HAP
1ere phase 2nde phase
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La fraction cyclohexanique est recueillie puis concentre sous vide sec. Le rsidu est repris
par 1 ml de mthanol CH3OH (ou dactonitrile CH3CN) pour tre chromatographi par
HPLC.
Lanalyse chromatographique de cet chantillon est ralis dans les conditions suivantes :
- Phase stationnaire : Silice RP18 ou Lichrosorb C18 L = 250 mm =
- Injection 20 l
- Phase mobile : CH3CN / H2O 85/15 Dbit : 1 ml mn-1
- Dtection : Flurorimtrique : excitation = 360 nm mission > 420 nm

Ces diffrents termes concernant lanalyse appellent quelques commentaires concernant la


technique en elle-mme et le matriel utilis. Cest ce que nous allons dvelopper dans les
paragraphes suivants.

31 La phase stationnaire

Elle est constitue dune silice greffe octadcyl silane (C18H37) de longueur 250 mm et de
diamtre (classique) 1 de pouce. On se retrouve en prsence dune phase stationnaire apolaire
et dune phase mobile qui sera polaire. Do le concept de chromatographie en phase inverse..
Divers termes concernant ce descriptif de colonne sont prendre en compte : sa gomtrie et
la nature de la phase :

311 La longueur et le diamtre de la colonne chromatographique

Comme on peut aisment le concevoir, la longueur de la colonne est en corrlation directe


avec lefficacit du systme chromatographique. Cependant, il nest pas question dutiliser
des colonnes chromatographiques de plusieurs dizaines de centimtres (problmes
dencombrement et de remplissage). Classiquement on utilise des colonnes commerciales de
15 et 25 cm. Dans le cas de sparations aises, on utilisera des colonnes de faibles longueur
(temps danalyses plus courts), sinon on utilise des colonnes de 25 cm. Dans certaines
applications particulires, on utilisera des colonnes de longueurs infrieures
fast chromatographie.
En ce qui concerne les diamtres des colonnes commerciales, ils sont classiquement de de
pouce, ce qui correspond 4.6 mm de diamtre intrieur.

312 La nature du greffon

Ce type de chromatographie (partage en phase inverse) est bas sur les interactions
hydrophobes entre le solut, la phase mobile et la phase stationnaire. Schmatiquement, on
peut considrer la phase stationnaire solvate par la composante organique de la phase mobile
(lactonitrile ou le mthanol). Le solut se partage alors entre cette phase stationnaire
solvate et la phase mobile contenant de leau. On peut comprendre simplement que, plus la
longueur du greffon sera importante, plus linteraction avec la phase stationnaire sera
importante et, par voie de consquence, plus la rtention sera grande. Ainsi lorsque lon
passera dune phase stationnaire greffe octadcyle une phase stationnaire greffe octyle
(C8H17), on diminuera les interactions dun facteur sensiblement gal 2 et la rtention se
rduira dun facteur 2. Do le premier concept en chromatographie en phase inverse :

La rtention est proportionnelle la longueur du greffon


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En terme dapplication, pour analyser des soluts fort caractre hydrophobe (lipophile) on
pourra utiliser des supports greffs chane courte (C8), et linverse, pour des soluts
faible caractre lipophile (hydrophobe), on utilisera des supports greffs longue chane (C18)
Dans la ralit de labsolu, on utilise bien souvent ce qui est disponible au laboratoire
(essentiellement des supports longue chane C18).

313 Le nombre de greffon

De manire similaire la longueur du greffon, on comprendra que la force des interactions


augmentera avec le nombre de sites dinteractions. Cela se traduit par le constat que :

La rtention augmente avec le nombre de greffons

Si on double le nombre de greffon par unit de surface du support, on double sensiblement le


nombre dinteractions entre le solut et la phase stationnaire et, par voie de consquence, on
double la valeur du facteur de capacit k (ces valeurs ne sont pas obligatoirement doubles
dans la mesure ou tous les sites greffes ne sont pas obligatoirement accessibles aux soluts).

Considration dordre pratique, en fonction de la nature du greffon, il nest pas toujours


possible daugmenter le taux de greffage sur un support donn (problme de gne strique).

314 Gnralisation la surface hydrocarbone

Ces deux notions sont regroupes sous un seul terme : la surface hydrocarbone qui traduit le
produit de la surface dun greffon par le nombre de greffons (le tout tant exprim par m de
support ou par gramme de support).En appelant S la surface hydrocarbone dun greffon et n
le nombre de greffon par gramme de support, on peut valuer la rtention comme
proportionnelle au produit n.S selon une expression du type

log10 k = a n.S + b

Pratiquement, on prfre utiliser le taux de carbone du support (il intgre les greffons et le
carbone apport par le traitement de end-capping. Classiquement, les silices utilises en
chromatographie en phase inverse ont des taux de carbone compris entre 8 et 15%. Les
supports fort taux de carbones seront appropries aux sparations de soluts ayant de faibles
interactions hydrophobes et les faibles taux seront ddies aux sparations de soluts ayant de
fortes interactions avec la phase stationnaire solvate. Les diffrentes courbes ci-dessous
illustrent ces propos.
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32 La phase mobile

Beaucoup plus simples mettre en uvre quen chromatographie dadsorption, elles sont
basiquement constitues deau et de mthanol ou dactonitrile. Cest le cas dans lexemple
propos ou la phase mobile est constitue dun binaire actonitrile / eau 85/15 (v/v).

321 Rle de leau

Dans ce type de chromatographie, la rtention repose sur le caractre hydrophobe des soluts.
On concevra aisment que plus la teneur en eau, dans la phase mobile, plus le caractre
hydrophobe des soluts sera marqu, et plus la rtention sera importante. On peut gnraliser
cette notion en disant que la variation du facteur de capacit est proportionnelle la teneur en
eau. Diffrentes lois de proportionnalits ont t voques par les auteurs suivant que lon
s intressait aux binaires mthanols/eau ou aux binaires actonitrile/eau. La loi la plus
gnrale est une relation quadratique entre le logarithme dcimal du facteur de capacit et x la
teneur en eau du type :

log10 k = ax + bx + c

322 Rle de la composante organique

Deux solvants organiques sont utiliss en partage en phase inverse : Le mthanol CH3OH et
lactonitrile CH3CN. Ces deux solvants appartiennent des classes diffrentes (VI pour
lactonitrile et II pour le mthanol), ce qui leur confre des proprits diffrentes : Leurs
paramtres de polarit sont repris dans le tableau ci-dessous

Solvant Classe Polarit P xe xd xn


Eau VIII 10.2 0.37 0.37 0.25
CH3OH II 5.1 0.48 0.22 0.31
CH3CN VI 5.8 0.31 0.27 0.42

On constate que le mthanol a un meilleur pouvoir accepteur (xe), par contre lactonitrile un
meilleur caractre dipolaire (xa). On a par ce biais, possibilit de modifier les interactions
entre la phase mobile (hydrophile) et le solut.

Comme en chromatographie dadsorption, les solvants organiques sont caractriss par leur
force luante (la rfrence tant leau pure). Le facteur de capacit dun solut st alors
fonction de sa valeur (pour une phase mobile constiute deau pure) et de la fraction de
solvant organique utilise dans la phase mobile tudie :

log10 k = log10 keau S* B


Expression dans laquelle S* reprsente la force luante du solvant B (fraction organique) et
B sa fraction volumique. A titre indicatif, on donne ci-dessous les forces luantes des
principaux solvants et modificateurs utilis s en phase inverse.

Solvant S* Solvant S*
Eau 0 Dioxanne 3.5
Mthanol 3.0 Isopropanol 4.2
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Actonitrile 3.1 Ttrahydrofuranne 4.4

Au-del de la force luante apporte par la composante organique de la phase mobile, on peut
tre amen remplacer une partie de celle-ci par un autre constituant organique (THF,
dioxanne), ceci afin de modifier slectivement des interactions entre certains soluts et la
phase mobile(do lutilisation de ternaires).

323 Dveloppement en mode isocratique et en gradient dlution.

Le dveloppement le plus simple consiste travailler composition de phase mobile


constante, ce que lon appelle mode isocratique, cest le cas dans notre application, la phase
mobile est constitue de 85% dactonitrile et 15 % deau. Pour certaines applications,
travailler dans ces conditions conduit des rtentions trop faibles (coalescence des pics
chromatographiques) ou trop grandes (soluts trs hydrophobes). On est alors amen faire
varier la composition de la phase mobile (comme on la dj vu pour ladsorption).
Dans le cas de la chromatographie de partage en phase inverse, on diminue, au cours du
temps, la teneur en eau de la phase mobile, afin de diminuer les interactions hydrophobes et,
par voie de consquence, diminuer la rtention des composs les plus retenus.

Lexemple ci-dessous appliqu de la chromatographie de partage en phase normale(silice


greffe cyano propyle), illustre ce propos. Dans tous les cas on dmarre llution avec une
forte teneur en eau (lie la nature des soluts sparer) et on augmente progressivement la
teneur en solvant organique
12

La ralisation de telles lutions ncessite des systmes de pompage particuliers que lon
abordera dans le paragraphe suivant.

33 Les soluts

Le dernier point li cette chromatographie en phase inverse concerne le solut. Pour tre
gnral, on peut retenir que sa rtention est inversement proportionnelle sa polarit. Traduit
autrement, plus le solut prsentera de fonctionnalits caractre polaire (fonction OH,
COOH, NH2), plus con caractre hydrophile sera marqu et moins grande sera sa rtention.

Schmatiquement, lordre dlution est linverse de celui observ en chromatographie


dadsorption.

Les auteurs ont cependant tudis le moyen de prvoir la rtention dun solut sur un systme
chromatographique en fonction de sa structure. Diverses approches ont t ralises. Parmi
celles-ci on peut citer lutilisation des constantes de partage dans le systme octanol / eau et
les paramtres de solubilit de Rekker et Hansch.

331 Les constantes de partage dans le systme octanol/eau

Dans ce concept, loctanol CH3-(CH2)6-CH2-OH et leau reprsentent respectivement les deux


composantes du systme chromatographique (loctanol pour la phase stationnaire solvate) et
leau pour la phase mobile (hydrophile). Un solut, S, mis au contact de ce binaire (dans une
ampoule dcanter, se partage entres-elles pour conduire un quilibre :

Seau Soctanol

Cet quilibre est rgit par une constante dquilibre P, P = [S]octanol / [S]eau

Plus la valeur de K est leve, plus laffinit de S pour la phase stationnaire sera grande et
plus sa rtention sera importante. Le choix de la phase mobile sorientera alors vers des
teneurs en eau plutt faibles.
Il existe alors une relation linaire entre k et P du type :

log10 k = a log10P + b

La courbe ci-dessous illustre ce propos


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332 Les paramtres de solubilit de Rekker et Hansch

Le systme prcdent tant fastidieux, il est ncessaire de procder la manipulation de


partage de chaque solut dans le systme octanol / eau, Rekker tudi un autre systme de
prdiction de comportement permettant de calculer cette constante de partage partir de la
structure du solut. Pour ce faire, il a dtermin, pour chaque motif constitutif dune
molcule, un incrment (fi) li sa nature et son environnement (aliphatique ou aromatique).
A cela, il a introduit la notion deffets intramolculaires fi (conjugaison, proximit de
groupements polaires) qui ne sont que le produit dune constante magique (CM = 0.268)
par un nombre clef kj (kj = 1 pour leffet de conjugaison par exemple) ce qui se traduit par
lexpression :

Log P = fi + CM kj
Le tableau ci-dessous donne quelques valeurs de ces incrments fi

Appliqu lexemple de lactophnone et de lalcool phnyl1 propanol2 , on peut calculer :


O

CH3
CH3

OH

1-phenylpropan-2-ol
Actophnone
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Pour lactophnone : Noyau aromatique ki = 1.886 CO ki = -0.842


CH3 ki = 0.702 Soit Log P = 1.746

Pour lalcool aromatique ; Noyau aromatique ki = 1.886 CH2 ki = 0.530


CH ki = 0.235 OH ki = -1.491 CH3 ki = 0.702
Soit Log P = 1.862

On peut en conclure que ces deux soluts auront un comportement chromatographique


relativement similaire et que lactophnone aura une rtention plus faible que lalcool
aromatique (celui-ci une polarit plus grande par la fonction OH mais il a en mme temps
une hydrophobie plus leve par la prsence de trois carbones sur sa chane latrale)..

IV) les constituants de la chane HPLC


Comme on la dj vu dune manire gnrale, une chane chromatographique HPLC peut tre
schmatise de la manire suivante :

Sans voir, dans le dtail tous les constitua,ts de cet ensemble, on va dtailler trois points important de
cet ensemble, savoir le systme de pompage, linjecteur et les systme de dtection.

41 Les systmes de pompage

La pompe permet de dlivrer un dbit constant de phase mobile vers la colonne. Les pertes de charge,
dans les colonnes chromatographique, tant originellement de plusieurs centaines de bars, le
dveloppement de la technique a t troitement li celui des pompes en terme dtanchit et de
constance de dbit. Aujourdhui, les pertes de charges dans les systmes chromatographique est plutt
de lordre de 50-100 bars, parfois pls lorsque lon utilise des phases mobiles contenant beaucoup
deau.
15

En terme mcanique, on utilise essentiellement des pompes piston une ou plusieurs ttes mues par
une came de forme varie suivant le nombre de tte. Un schma de principe dune pompe deux ttes
montes en parallle et came en forme de cardiode est prsent ci-aprs.
Lavantage de tels systmes est la constance du dbit. Linconvnient est la prsence de deux sries de
clapets (une par piston) monts sur les lignes dadmission et de refoulement. Ces clapets sont le cur
de la pompe. Afin dobtenir un dbit constant dans la colonne chromatographique, le clapet de
refoulement doit tre hermtiquement ferm lors de la phase daspiration de la phase mobile dans la
chambre de pompe et, linverse, lors de la phase de refoulement, cest le clapet situ sur la ligne
dadmission qui doit tre hermtiquement ferm.
Ceci impose davoir des phases mobiles exempte de particules en suspension (filtration sur filtre de
porosit 0,45 m. De plus, elles doivent tre exempte de gaz dissous (ceux-ci se dsorberaient la
compression et creraient des problmes dtanchit. Pour cela on procde un dgazage pralable
des phase mobiles (traitement des phases mobiles aux ultra-sons) Dautres contraintes existent,
notamment dans le cas de changement de phase mobile, mais ne seront pas abordes dans le cadre de
ce chapitre

En mode isocratique, une seule pompe suffit lapprovisionnement de la colonne en phase mobile (il
suffit de prparer sa phase mobile avant le pompage). Dans le cas du gradient dlution, le systme est
plus complexe : On peut procder de deux manires :

- Soit on pompe indpendamment les diffrents constituants de la phase mobile et on


procde leur mlange, dans la chambre de mlange, via une lectrovanne : On parlera
alors de gradient haute pression. Ans cette action, on notera quil ncessite autant de
pompes que de composants de phase mobile (trois en gnral).
- Soit on procde au mlange des diffrents constituants de la phase mobile, dans la
chambre de mlange, via une lectrovanne et ensuite on pompe celle-ci pour linjecter
dans la colonne chromatographique. On parle alors de gradient basse pression qui ne
ncessite quun seul systme de pompage.

Lintrt du second systme est vident par rapport aux clapets et des problmes de maintenance quils
gnrent. Un schma de principe dun tel systme est prsent ci-aprs
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42 Linjection

Dans une grande majorit des cas on utilise des vannes dinjections six voies dont le schma
de principe est donn ci-dessous :

Ces vannes sont constitues de deux parties : Un stator et un rotor spar par un mica solidaire
du rotor. Le stator est quip de six connections (numrotes de 1 6) et 3 gorges en formes
de haricots et dcales de 60 sont graves sur le mica. Le rotor peut occuper 2 positions Load
(chargement) et Inject (injection vers la colonne chromatographique)

Dans la premire position, Load, la pompe est connecte directement vers la colonne (voies 1
et 2) via le mica. Les positions 3 et 6 sont relies entre-elles par une boucle externe dun
volume fixe (en gnral 20l, mais il peut tre diffrent). La position 5 est relie une
seringue externe et la position 4 est relie lvent. La position du mica met en
communication les positions 5 et 6, les positions 3 et 4. On peut ainsi procder au remplissage
de la boucle avec lchantillon analyser (ce remplissage est ralis laide dune seringue
externe de 100 ou 250 l qui devra rester en position, une fois le chargement ralis afin
dviter les problmes de vidange par siphonage de la boucle dinjection.

Dans la position Inject, on fait subir une rotation de 60 au rotor, et par voie de consquence
au mica. La position 1 se trouve alors connecte la position 6 (boucle) elle-mme relie la
position 3 (par la boucle externe). Par lintermdiaire du mica, la position 3 est relie la
colonne chromatographique (position 2) : On procde ainsi linjection des 20l
dchantillon dans la colonne chromatographique. On notera que pendant cette opration, les
positions 4 et 5 sont relies entre-elles par lintermdiaire du mica, ce qui limine la
possibilit dinjection multiple. Cette action ralise, on peut alors retirer la seringue
dinjection (position 5) sans risuqe de vidange de la boucle dinjection. En gnral, on ne
travaillera pas en balayage de boucle, si bien quau bout de 1minute environ de balayage on
repositionnera le rotor dans sa position initiale, Load.
17

Le principal avantage de ce systme dinjection est la constance du volume inject (en prenant
toutefois certaines prcautions). Cet aspect est fondamental puisquil autorise lutilisation de
mthode dtalonnage externe, ce qui simplifie, dans bien des cas, la procdure de
quantification.

A partir de ce systme lmentaire dinjecteur, on peut concevoir des systmes de plus en plus
complexes (vannes dinjections 24 voies avec rtro balayage, injections multi colonnes, ect..
La seconde possibilit est lautomatisation de linjection via un passeur automatique
dchantillons. Mcaniques ou pneumatiques, ces systmes mettent en uvre trois ras (suivant
les axes x,y et z du tridre) qui vont permettre la prhension de lchantillon (flacons vials),
son positionnement sous une seringue de prlvement et le chargement et linjection par
lintermdiaire dune vanne six voies.(reste simplement loprateur bien le programmer)

Dautres systmes dinjection existent sur le march, notamment les vannes dinjection
tiroir. On retiendra simplement que leur utilisation est plutt rserve la chromatographie
prparative.

43 La dtection

Dernier maillon fondamental de la chane chromatographique HPLC, le dtecteur, et par


extension, la dtection. Un certain nombre de concepts fondamentaux seront abords dans ce
paragraphe, ainsi quun panorama des diffrents dtecteurs utiliss. Certains dentre eux, par
leur universalit dutilisation ou leur spcificit, seront plus dvelopps.

431 Gnralits

Un de points communs tous les systmes de dtection est la notion de drive de ligne de
base et de bruit ( court et long terme)

La drive traduit lcart entre la ligne de base moyenne et lhorizontale sur une priode
assez longue (1 heure). Elle est quantifie par la valeur de langle obtenue.
Le bruit long terme est mesur sur une chelle de temps plus courte (une dizaine de
minute).Cest lui qui va fixer la quantit minimale dtectable de solut. Plus ce bruit est
important, moins la limite de dtection sera faible.
Le bruit court terme est mesur sur des intervalles de temps de 1 minute. Il traduit les
fluctuations rapides de la ligne de base (du signal) et peut tre gnant en quantification.
Le schma ci-dessous illustre ces trois termes.
18

Deuxime point important des dtecteurs est la quantit minimale dtectable. Lie au
bruit court terme, cette notion traduit la plus petite quantit (le plus petit signal) que lon
peut considrer comme fiable et traduisant la quantit relle de solut prsente. Au minimum,
cette quantit minimale se traduit par un signal gal au moins deux fois le bruit (cette valeur
peut tre beaucoup plus importante selon les laboratoires).
Dernier pont, la sensibilit du dtecteur traduit la pente de la courbe signal en fonction
de la concentration. La courbe ci-dessous traduit ces deux notions :

432 Panorama des diffrents dtecteurs

On classifie les diffrents dtecteurs en trois groupes :

- Les dtecteurs simples


- Les dtecteurs semi informatifs
- Les dtecteurs intelligents

Suivant le type de rponse attendue, on utilisera prfrentiellement lun ou lautre. Cependant,


lchelle dinvestissement crot avec le niveau dinstruction (cest bien connu) ce qui rend
les dtecteurs intelligents utilisables essentiellement au niveau de la recherche. En analyse de
routine, on rencontrera essentiellement des dtecteurs simples dans certaines applications
haute valeur ajoute, on peut tre confront des dtecteurs semi informatifs.
Pour se fixer un ordre dide, un dtecteur simple demande un investissement de lordre de 7
10.000 euros, un dtecteur semi informatif de lordre de 15 20.000 euros. Un dtecteur
intelligent, le spectromtre de masse coupl la chromatographie, met en uvre des
investissements de plusieurs centaines de milliers deuros.

Dtecteurs Simples Dtecteurs Semi Informatifs Dtecteurs Intelligents


UV Visible UV Visible multi longueur Barrette de diode
Fluorimtre dondes Infra-rouge transforme
Rfractomtre* Fluorimtre programmables de Fourrier
Dtecteur Diffusion de RMN
lumire (DDL) Spectromtre de masse

Electrochimique Electrochimique multi


Conductimtre* lectrodes
* Dtecteur Diffrentiel
19

432 Les dtecteurs bass sur labsorption et lmission molculaire


(UV Visible et fluorimtre, mono et multi , barrette de diode)

Dutilisation largement rpandue, les dtecteurs utilisant les proprits dabsorption


molculaire des molcules de solut(domaine UV ou visible) et dmission molculaire
(fluorimtre), ils reposent tous deux sur labsorption dun rayonnement lumineux pour passer
un tat excit puis revenir ltat fondamental

- Directement dans le cas de labsorption molculaire avec restitution de lnergie sous


forme de chaleur
- En passant par un tat intermdiaire avec restitution de lnergie sous forme
lumineuse puis retour ltat fondamental avec mission de chaleur.
Cette opration concerne les lectrons molculaires (lectrons de liaison) On aura loccasion
de revoir ces concept dans le chapitre concernant labsorption molculaire.
Schmatiquement, on peut le reprsenter sous la forme :

E Etat fondamental Etat excit Retour ltat fondamental


Absorption molculaire

E Etat fondamental Etat excit Passage ltat intermdiaire


Emission molculaire (Fluorimtrie)

Lnergie change pour passer dun tat un autre E = h = h c /


Expression dans laquelle h est la constante de Planck, c la clrit de la lumire et la
longueur donde de la radiation (mise ou absorbe).

Dans le cas de la dtection UV-visible, on irradie le solut une longueur telle quil va
absorber de lnergie et on mesurera le signal transmis.
Dans le cas de la fluorimtrie, on irradie le solut avec une radiation adapte son excitation
et on mesure lintensit de la radiation mise par le solut lors de son passage ltat
intermdiaire. La variation dnergie tant pluds faible, ce passage va saccompagner dune
mission une longueur donde plus grande que celle de la radiation dmission (cest ce que
20

lon observe dans la norme propose. Dans les deux cas, la rponse est proportionnelle la
concentration (Loi de Beer-Lambert).
La sensibilit de tels dtecteurs peut-tre trs leve et est lie au coefficient dextinction
molaire du solut.
Dans le cas de la fluorimtrie elle peut atteindre 10-12 mol /l. Dans la norme prsente, les
quantits minimales dtectables sont de lordre de 10 ng /l pour les benzo fluoranthnes et
benzopyrne et de 50 ng / l pour les autres composs, ce qui correspond des concentrations
molaires de 4*10-11 et 2 10-10 mole /l

La limite dutilisation de ces dtecteurs est lie au fait que les soluts doivent absorber la
lumire (dans le domaine UV ou visible) ou doivent tre potentiellement fluorescent. On
verra, par les ractions de drivatisation, comment on peut contourner ce problme

433 Le rfractomtre et le dtecteur DDL

Autres dtecteur caractre universel, le rfractomtre diffrentiel. Son principe est bas sur
la mesure de la diffrence dindice de rfraction entre la phase mobile pure et lluat en sortie
de colonne. Beaucoup moins sensible que les autres dtecteurs (10-6 mole/l) et sensible la
temprature, il prsente linconvnient dtre diffrentiel, ce qui interdit les lutions en mode
gradient de concentration. En effet on ne sait pas, techniquement, remplir la cellule de
rfrence avec la phase mobile de mme composition que celle de lluat (sans les soluts
videmment). Cet aspect limite son utilisation llution en mode isocratique.

Une application classique dutilisation de ce dtecteur concerne lanalyse des sucres (a courte
chane (DP1, DP2, DP3) qui nabsorbent pas en UV, les seuils de dtection se situant autour
de 10-5 mole/l.

Lapparition du dtecteur diffusion de lumire a permis de contourner le problme de


llution. 10 100 fois plus sensible que le rfractomtre, le DDL est un dtecteur mesure
directe, ce qui permet des lutions en mode gradient. Le principe est bas sur la formation
dun brouillard en sortie de colonne, dans la chambre de nbulisation et schage partiel des
fines gouttelettes sur la buse de mesure. Lchantillon est irradie (par une lampe au sodium
en gnral, et on mesure lintensit du rayon diffract ( 110 environ).

Appliqu lanalyse des sucres, il permet lanalyse doligomres plus lourds (jusqu DP 12).

434 Les autres dtecteurs

Parmi les autres dtecteurs rencontrs en chromatographie liquide, on peut citer, le dtecteur
conductimtrique qui est particulirement appliqu la chromatographie ionique. Son
principe repose sur la mesure de la conductivit de lluat compare celle de la phase
mobile. Systme diffrentiel, il nest utilisable, ltat brut, quen mode isocratique.
Les progrs de la technologie ont transform ce type de dtection avec une notion de
suppression de fond qui rend ce mode de dtection applicable en gradient dlution.

Autre dtecteur spcifique appliqu des soluts oxydo-rductibles (cathcolamines par


exemple) le dtecteur lectrochimique permet datteindre des seuils de dtection trs
faibles. Cependant son emploi (ampromtrie et voltamtrie) laisse son utilisation restreinte
en terme de contrle.
21

Les dtecteurs semi informatifs reposent sur des principes quivalents ceux des dtecteurs
simples. La diffrence rside dans le fait quils vont offrir la possibilit de comparer des
rponses diffrentes longueurs dondes (absorptiomtrie et fluorimtrie) ou par rapport
diffrents types dlectrodes (lectrochimique). Quatre niveaux de dtections taient souvent
utiliss (en absorption molculaire).

Les progrs de la technologie et de linformatique ont permis de balayer le spectre lumineux


(UV et Visible) en des temps restreints (de lordre de la milli seconde) ce qui a introduit la
notion de dtecteurs intelligents (Barrette de diode) qui permet denregistre non seulement un
signal optique en fonction du temps (lution) mais galement de balayer lensemble du
spectre optique en fonction du temps. Ceci conduit des chromatogrammes 3D certes plus
complexes lire mais qui fournissent des informations sur la nature de lluat mais galement
sur le spectre dabsorption du solut lu (cette information donne des renseignements
prcieux sur la puret du solut prsent sous le pic chromatographique).

Fort de ces progrs technologiques, les chercheurs ont dvelopp et adapt des techniques
plus lourdes ( Infra-rouge transforme de Fourrier, Rsonance Magntique Nuclaire et
Spectromtrie de masse) qui fournissent non seulement des informations en terme de
quantification du solut mais galement des informations sur lidentification du solut prsent
sous le pic chromatographique. Cet aspect dbordant le cadre du contrle simple ne sera pas
abord ni dvelopp dans le cadre de ce cours.

V) La drivatisation

Le solut, tant ce quil est, loprateur na pas grand moyen de le changer. Cependant il peut
tre amen le modifier soit pour amliorer la qualit des sparations (on reverra cet aspect
en chromatographie en phase gazeuse : Amlioration de la volatilit des soluts sous forme
desters ou dthers), soit pour amliorer la qualit du chromatogramme obtenu et le niveau de
dtection de ceux-ci. Dans cette seconde optique, deux procds sont utiliss :

- La drivatisation pr colonne
- La drivatisation post colonne

Ces deux techniques ncessitent une phase de mise au point notamment en ce qui concerne la
slectivit de la raction de drivatisation et sa cintique ractionnelle.

51 La drivatisation pr colonne : Application aux acides amins

Ces soluts, combien important pour le cycle de la vie, prsentent des rponses faibles au
niveau des dtecteurs classiquement utiliss. Un des moyens utiliss pour amliorer leur
dtection consiste les traiter par lorthphataladhyde pour conduire des drivs prsentant
un chromophore important qui permet dabaisser le seuil de dtection. La raction de
drivatisation ayant lieu avant lanalyse chromatographique, on comprendra aisment que lon
ne sparera pas les acides amins mais leurs drivs. Un exemple daminogramme est expos
ci-dessous.
Aprs hydrolyse totale de la matire protique(HCl concentr pendant 48h 110C), les
acides amins constitutifs sont traits par une solution dorthophtalaldhyde suivant le schma
ractionnel (appliqu lalanine):
22

COOH H COOH H
O O

H3C O N
OH + OH

NH2 CH3

Alanine 2-formylbenzoic acid 2-{[(1-carboxyethyl)imino]methyl}benzoic acid

Le mlange de drivs dimines est alors chromatographi (dans les 3 mn suivant la raction
de drivatisation) sur une colonne spcifique OPA HR (alltech) quip dun dtecteur de
fluorescence (excit. = 325 nm, mis. = 470 nm). Llution est ralise en mode gradient
dlution avec un binaire constitu de :

Une phase A : Actate de sodium 20mM (pH = 5,7) / Dioxanne / Isopropanol


(92.5/4.5/3.0 v/v/v)
Une phase B : Acide actique 20 mM ajust pH 5.7 par NaOH

Le gradient dlution prsente le profil suivant :

Temps (mn) 0 9 33 42 45
%B 0 7 46 85 0
%A 100 93 54 15 100

Lanalyse de lensemble des acides amins (except le tryptophane) dure environ 1h et


conduit au chromatogramme suivant :
23

52 La drivatisation post colonne :Application lacide ascorbique (vitamine C)

Une autre possibilit consiste raliser la raction de drivatisation en sortie de la colonne


chromatographique. Cette mthodologie ncessite lemploi de matriel plus sophistiqu
(racteur post colonne) mont en ligne sur la chane chromatographique (ce qui ncessite une
seconde pompe pour amener les ractifs de drivatisation) et une mise au point (optimisation
et rptabilit) plus pointue. Lavantage rside dans le fait que lon peut mettre en uvre une
raction post colonne spcifique au solut analys.

Un exemple dapplication de cette technique est illustr par le dosage de la vitamine C (acide
ascorbique) ,de ses drivs (acide isoascorbique) et composs rduits (acide
dhydroascorbique et isodhydroascorbique.

Dans cette sparation, ralise sur silice greffe C18 (chromatographie de paire dion : phase
mobile : chlorure de dodcyl trimthyl ammonium 2.3 mM en milieu tamponn), on ralise,
post colonne une raction de drivatisation pour introduire sur les soluts un chromophore
rendant ceux-ci fluorescent (excitation 350 nm et mission 430 nm).

VI) Les autres techniques HPLC

A partir de ces deux concepts de base (adsorption et partage), on peut dcliner la technique
suivant un certain nombre de terminologie qui diffrent soit par le domaine dapplication, soit
par la nature du greffon (et de la phase mobile) soit par la nature de la phase stationnaire.

Parmi les principales, on peut citer quatre techniques prsentes dans le tableau ci-aprs :

Technique Phase stationnaire Phase mobile Applications


Paire dions C8, C18 Actonitrile, Composs ionisables
Mthanol, Eau (acides, amines..)
Chirale Greffon chiral, Tampons aqueux, Composs chiraux et
Cyclodextrines phases organiques asymtriques
Echange dion Rsines changeuses Tampons aqueux Cations et anions
dions minraux
Polymres poreux Tampons aqueux, Polymres
Permation de gel THF, CH2Cl2 organiques et
polymres
hydrophiles

61 Chromatographie de Paire dions

Dans cette technique, on utilise une phase stationnaire apolaire et une phase mobile aqueuse
de manire similaire la chromatographie en phase inverse. Le concept diffre par le domaine
dapplication et la modification sensible de la phase mobile.
La technique sapplique aux espces organiques ionises (ou ionisables). De par leur caractre
ioniques, ces espces sont fortement hydrophiles et donc prsentent des rtentions faibles,
voire nulle, en chromatographie en phase inverse. On va donc crer in Situ une paire dion
entre le solut et une entit ionique que lon va introduire dans la phase mobile. Deux familles
de composs sont utiliss suivant que les soluts ont un caractre cationique ou anionique :
24

Dans le cas de soluts anioniques, on utilisera des sels dammonium. Dans le cas de soluts
cationiques, on utilisera des sels dacides sulfoniques :
Exemples :

R-COO- + (R-NH3+,Cl-) [R-COO-,+NH3-R]

Paire dions stable qui sera spare en phase inverse. On comprendra aisment que la nature
de R influera sur le choix de R, de manire adapter les interactions de la paire dion avec la
phase stationnaire : Si R est petit, on choisira R plutt volumineux et, linverse, si R est
volumineux, on choisira R petit.

Le mme concept est applicable aux espces cationiques :

R-NH3+ + (R-SO3-, Na+) [R-NH3+,-O3S-R]

Ces paires dions seront alors spares suivant les critres de la chromatographie en phase
inverse.

62 Chromatographie chirale

Secteur particulier de la chromatographie, la chromatographie chirale concerne la sparation


des isomres des soluts prsentant une activit optiques (nantiomres, diastrosiomres).
Elle a donc un domaine dapplication li aux principes actifs (mdical) mais galement aux
armes. Diffrentes techniques sont mises en jeu : Pour simplifier la prsentation, on utilise
des interactions spcifiques entre deux espces chirales. Pour quil y ait reconnaissance
chirale, il faut trois points dinteraction entre les deux espces (Rgle des trois points de
Dalglish). Deux possibilits soffrent loprateur : Soit la phase stationnaire est chirale et
lon utilise des phases mobiles classiques (peu polaires ou hydrophiles suivant la nature des
soluts), soit n utilise une phase stationnaire non chirale et on utilisera des phases mobiles
contenant un modificateur chiral.

63 Chromatographie de permation de gel

La chromatographie de permation de gel, ou chromatographie dexclusion, sapplique aux


domaine des polymres, que ceux-ci soient hydrophobes ou hydrophiles. La technique est
base sur une sparation des macromolcules sur des supports poreux. Suivant la taille des
molcules, elles pourront (ou ne pourront pas) pntrer dans les pores du support
chromatographique et seront ainsi spares les unes des autres suivant le critre de leur taille.

Pour un support donn (diamtre de pore fix), une grosse molcule, de taille suprieure au
diamtre des pores du support, ne pourra pntrer dans aucun pore du support. Elle traversera
alors la colonne, sans interaction avec le support et sera lue avec le volume mort (rtention
nulle).
A linverse, une petite molcule pntrera dans tous les pores du support et prsentera une
rtention maximum
Entre les deux, en fonction de leur taille, les autres molcules pntreront dans un nombre
plus ou moins important de pore du support et conduiront des rtentions plus ou moins
importante, comprise entre le volume mort et la rtention maximum.
25

Un logiciel de traitement des chromatogrammes permet alors de dterminer la rpartition des


macromolcules suivant leur population et leur taille.

64 Chromatographie dchange dions

Dernier aspect abord dans ce chapitre, cette technique sapplique aux ions minraux (anions
et cations). Elle est base sur des comptitions d interactions Coulombienne entre la phase
stationnaire, les soluts et la phase mobile.

Dans le cas de sparation de cations, Na+, Ca2+,Fe3+, on utilisera un support anionique de


type rsine sulfonique ou carboxylique (dautres supports existent) sur lequel on va fixer nos
cations (sens 1) et on luera le systme avec une solution acide (H+) (sens 2), ce que lon peut
schmatiser :

1
-
Rsine-SO3 H + Na+ +
mob Rsine-SO3-Na+ + H+mob
2

Dans le cas de sparation danions, Cl-, SO42-, PO43-, on utilisera un support cationique de
type rsine ammonium (dautres supports existent) sur lequel on va fixer nos anions (sens 1)
et on luera le systme avec une solution basique (OH-) (sens 2), ce que lon peut
schmatiser :

1
Rsine-NH3+OH- + Cl-mob Rsine-NH3+Cl- + OH-mob
2

La nature des rsines et des phases mobiles peut tre vaste en fonction des applications. On
concevra aisment, en ce qui concerne les soluts, que leur rtention sera fonction de leur
taille et de leur charge ; Les interactions les pls fortes auront lieux avec les espces les plus
charges et les plus petites.

Un exemple dapplication de cette technique est illustr par la norme NF T 90-

Une application que vous rencontrerez, peut tre, dans votre vie quotidienne, concerne les
adoucisseurs deau (domestique) Ce ne sont que des mlanges de rsines cationiques (sous
forme OH-) et de rsines anioniques (sous forme H+). Sur le premier support on va fixer les
anions polluant leau (et librer des ions OH-) et sur le second, on va fixer les cations (et
librer des ions H+), ce qui permet dobtenir une eau de bonne qualit (suivant la nature des
rsines)