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Le Greffage
La Chromatographie de Partage
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Sommaire
I) Introduction page 3
21 La raction de greffage
22 Le End-Capping
31 La phase stationnaire
311 Longueur et diamtre de colonne
312 La nature du greffon
313 Le nombre de greffons
314 Surface hydrocarbone
32 La phase mobile
321 Rle de leau
322 Rle de la composante organique
323 Dveloppement isocratique et en gradient dlution
33 Les soluts
331 Le partage dans le systme octanol / eau
332 Les paramtres de solubilit
IV) Les constituants de la chane HPLC page 14
41 Les pompes
42 Linjection
43 La dtection
431 Gnralits
432 Les diffrents dtecteurs
433 Les dtecteurs absorptiomtriques
434 Rfractomtre et DDL
435 Les autres dtecteurs
V) La drivatisation page 21
51 Drivatisation pr colonne
52 Drivatisation post colonne
61 Lappariement dions
62 La chromatographie chirale
63 La permation de gel
64 Lchange dions
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I) Introduction
Hors cet aspect tait limitatif, en tant quinteractions, du fait de la polarit de la phase, les
chercheurs ont tent de modifier celle-ci en adsorbant des composs trs polaires (amines,
polyols) la surface de celle-ci. Ils ont obtenu, ainsi, des phases stationnaires de polarit
diffrente permettant daccrotre leur champ dinvestigation. On peut citer par exemple,
ladsorption de polyamines lourdes polyfonctionnelles qui sadsorbaient irrversiblement
la surface des silices, par liaisons hydrognes, et qui conduisaient lobtention de nouveaux
supports chromatographiques. Cette technique prsentait des avantages, au niveau du
laboratoire, car elle permettait dobtenir in situ des phases de polarit diverses, la
discrtion de loprateur. A partir dune silice nue, il pouvait crer une phase stationnaire
adapte son problme.
Pour rsoudre cette difficult, il fallait pouvoir immobiliser ces entits la surface du
support. Dans les annes 1970, la technique dimmobilisation, par greffage, a t
suffisamment matrise pour tre dveloppe et commercialise.
La conjonction de ces deux phnomnes a vu lexplosion de cette technique dans les annes
1970 et son dveloppement pour en faire, aujourdhui, une technique de contrle, que lon
peut qualifier dincontournable.
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21 La raction de greffage
Pour simplifier le problme, le greffage a consist immobiliser, par cration dune liaison
chimique covalente, une entit sur un support siliceux. Divers types de greffage ont t
utiliss avec plus ou moins de satisfaction : On ne retiendra que, cest le plus stable et le plus
utilis, que le greffage par les silanes. Il consiste a crer une liaison Si-O-Si entre un silanol
du support siliceux et le silicium dun drivs sillyl adapt suivant le schma ractionnel :
R1 R2
O Cl O
O O
Si + Si Si
O
O
R2
R3
O
Si
R3 + HCl
H O R1
O R2 O OH
O H2O O
Si Si Si Si
O R3 O R3
O R1 HO
O
Suivant la nature de R3, on peut, par ce biais, obtenir des phases stationnaires de polarits trs
tendues. Historiquement, les premires phases greffes prsentaient un radical
R3 = octadcyl (C18H37). Depuis, la nature des greffons sest largement toffe : On rencontre
classiquement des greffons de type alkyl (C8H17, C3H7 , C2H5) de type phnyl (C6H5), de type
amine (C3H6NH2), nitrile (C3H6CN) et autres polyols (propylne glycols.).
On comprendra aisment que lon peut (cest pas toujours simple) greffer nimporte quelle
fonctionnalit sur un support siliceux par ce type de mcanisme et ainsi obtenir une palette de
phases stationnaires de fonctionnalit et de polarit diffrentes. Cet aspect est largement
utilis de nos jours lchelle du laboratoire (synthse de phases chirales) et lchelle du
laboratoire de contrle (commercialisation dun grand nombre de supports greffs aussi bien
en colonne quen plaques CCM).
22 Le End-capping
Afin dliminer (partiellement) ces silanols rsiduels (aprs greffage), les supports siliceux
sont traits pat un agent sillylant chane courte (le TMCS, Trimthyl Chlorosilane, en
gnral), qui lavantage, par sa taille, de pouvoir ragie chimiquement, avec les silanols qui
ne pourraient le faire par gne strique :
CH3
O-Si-C18H37 Cl
O-Si-C18H37 Si(CH3)3
Si
O Si O OH CH3
H3C O Si O O
O O O O
Si O Si Si Si O Si Si + HCl
O O O O O O
O O O O O O
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A lissue de ce traitement, la surface du support prsente donc des sites greffs par lentit
choisie(octadcyl par exemple) des sites end-capps et des silanols rsiduels qui ne sont pas
accessibles aux molcules de trimthylchlorosilane. La prsence de ces derniers ne gne pas
lanalyse chromatographique dans la mesure ou ntant pas accessible la molcule de
TMCS, il ne le seront pas, non plus, aux molcules de soluts. On peut donc schmatiser la
surface finale du support chromatographique (dans le cas dune silice greffe octadcyle) :
(H3C)3Si
O
H37C18-Si-O O Si O
O OH
Si Si Si O-Si(CH 3)3 O-Si-C 18H37
O
O O O
O O O Si O O Si O
O
O Si O
O Si Si O
O O
O O O
Pour conclure sur ce thme du greffage, on notera que dans le cas de petits greffons (C2, C3)
on a recours un spacer (bras) pour loigner celui-ci de la surface du support siliceux et
favoriser ainsi les interactions spcifiques entre le greffon et le solut.
Pour illustrer cette technique, on sappuie sur la norme analytique concernant le dosage
dhydrocarbures aromatiques polycycliques ( P.H.A : polluants) dans leau (NF T 90-115).
La structure des six PHA quantifis est prsente ci-dessous :
La phase dextraction est ralise sur une eau brute (volume V1 = 250ml) par 25 ml de
cyclohexane, labri de la lumire, les PHA tant sensibles la photo-oxydation. Aprs
sparation des phases organiques et aqueuses, la fraction organique est sche sur sulfate de
sodium anhydre puis concentre environ 1 ml sous pression rduite.
Solution Cyclohexane
Cyclohexane
La fraction cyclohexanique est recueillie puis concentre sous vide sec. Le rsidu est repris
par 1 ml de mthanol CH3OH (ou dactonitrile CH3CN) pour tre chromatographi par
HPLC.
Lanalyse chromatographique de cet chantillon est ralis dans les conditions suivantes :
- Phase stationnaire : Silice RP18 ou Lichrosorb C18 L = 250 mm =
- Injection 20 l
- Phase mobile : CH3CN / H2O 85/15 Dbit : 1 ml mn-1
- Dtection : Flurorimtrique : excitation = 360 nm mission > 420 nm
31 La phase stationnaire
Elle est constitue dune silice greffe octadcyl silane (C18H37) de longueur 250 mm et de
diamtre (classique) 1 de pouce. On se retrouve en prsence dune phase stationnaire apolaire
et dune phase mobile qui sera polaire. Do le concept de chromatographie en phase inverse..
Divers termes concernant ce descriptif de colonne sont prendre en compte : sa gomtrie et
la nature de la phase :
Ce type de chromatographie (partage en phase inverse) est bas sur les interactions
hydrophobes entre le solut, la phase mobile et la phase stationnaire. Schmatiquement, on
peut considrer la phase stationnaire solvate par la composante organique de la phase mobile
(lactonitrile ou le mthanol). Le solut se partage alors entre cette phase stationnaire
solvate et la phase mobile contenant de leau. On peut comprendre simplement que, plus la
longueur du greffon sera importante, plus linteraction avec la phase stationnaire sera
importante et, par voie de consquence, plus la rtention sera grande. Ainsi lorsque lon
passera dune phase stationnaire greffe octadcyle une phase stationnaire greffe octyle
(C8H17), on diminuera les interactions dun facteur sensiblement gal 2 et la rtention se
rduira dun facteur 2. Do le premier concept en chromatographie en phase inverse :
En terme dapplication, pour analyser des soluts fort caractre hydrophobe (lipophile) on
pourra utiliser des supports greffs chane courte (C8), et linverse, pour des soluts
faible caractre lipophile (hydrophobe), on utilisera des supports greffs longue chane (C18)
Dans la ralit de labsolu, on utilise bien souvent ce qui est disponible au laboratoire
(essentiellement des supports longue chane C18).
Ces deux notions sont regroupes sous un seul terme : la surface hydrocarbone qui traduit le
produit de la surface dun greffon par le nombre de greffons (le tout tant exprim par m de
support ou par gramme de support).En appelant S la surface hydrocarbone dun greffon et n
le nombre de greffon par gramme de support, on peut valuer la rtention comme
proportionnelle au produit n.S selon une expression du type
log10 k = a n.S + b
Pratiquement, on prfre utiliser le taux de carbone du support (il intgre les greffons et le
carbone apport par le traitement de end-capping. Classiquement, les silices utilises en
chromatographie en phase inverse ont des taux de carbone compris entre 8 et 15%. Les
supports fort taux de carbones seront appropries aux sparations de soluts ayant de faibles
interactions hydrophobes et les faibles taux seront ddies aux sparations de soluts ayant de
fortes interactions avec la phase stationnaire solvate. Les diffrentes courbes ci-dessous
illustrent ces propos.
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32 La phase mobile
Beaucoup plus simples mettre en uvre quen chromatographie dadsorption, elles sont
basiquement constitues deau et de mthanol ou dactonitrile. Cest le cas dans lexemple
propos ou la phase mobile est constitue dun binaire actonitrile / eau 85/15 (v/v).
Dans ce type de chromatographie, la rtention repose sur le caractre hydrophobe des soluts.
On concevra aisment que plus la teneur en eau, dans la phase mobile, plus le caractre
hydrophobe des soluts sera marqu, et plus la rtention sera importante. On peut gnraliser
cette notion en disant que la variation du facteur de capacit est proportionnelle la teneur en
eau. Diffrentes lois de proportionnalits ont t voques par les auteurs suivant que lon
s intressait aux binaires mthanols/eau ou aux binaires actonitrile/eau. La loi la plus
gnrale est une relation quadratique entre le logarithme dcimal du facteur de capacit et x la
teneur en eau du type :
log10 k = ax + bx + c
Deux solvants organiques sont utiliss en partage en phase inverse : Le mthanol CH3OH et
lactonitrile CH3CN. Ces deux solvants appartiennent des classes diffrentes (VI pour
lactonitrile et II pour le mthanol), ce qui leur confre des proprits diffrentes : Leurs
paramtres de polarit sont repris dans le tableau ci-dessous
On constate que le mthanol a un meilleur pouvoir accepteur (xe), par contre lactonitrile un
meilleur caractre dipolaire (xa). On a par ce biais, possibilit de modifier les interactions
entre la phase mobile (hydrophile) et le solut.
Comme en chromatographie dadsorption, les solvants organiques sont caractriss par leur
force luante (la rfrence tant leau pure). Le facteur de capacit dun solut st alors
fonction de sa valeur (pour une phase mobile constiute deau pure) et de la fraction de
solvant organique utilise dans la phase mobile tudie :
Solvant S* Solvant S*
Eau 0 Dioxanne 3.5
Mthanol 3.0 Isopropanol 4.2
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Au-del de la force luante apporte par la composante organique de la phase mobile, on peut
tre amen remplacer une partie de celle-ci par un autre constituant organique (THF,
dioxanne), ceci afin de modifier slectivement des interactions entre certains soluts et la
phase mobile(do lutilisation de ternaires).
La ralisation de telles lutions ncessite des systmes de pompage particuliers que lon
abordera dans le paragraphe suivant.
33 Les soluts
Le dernier point li cette chromatographie en phase inverse concerne le solut. Pour tre
gnral, on peut retenir que sa rtention est inversement proportionnelle sa polarit. Traduit
autrement, plus le solut prsentera de fonctionnalits caractre polaire (fonction OH,
COOH, NH2), plus con caractre hydrophile sera marqu et moins grande sera sa rtention.
Les auteurs ont cependant tudis le moyen de prvoir la rtention dun solut sur un systme
chromatographique en fonction de sa structure. Diverses approches ont t ralises. Parmi
celles-ci on peut citer lutilisation des constantes de partage dans le systme octanol / eau et
les paramtres de solubilit de Rekker et Hansch.
Seau Soctanol
Cet quilibre est rgit par une constante dquilibre P, P = [S]octanol / [S]eau
Plus la valeur de K est leve, plus laffinit de S pour la phase stationnaire sera grande et
plus sa rtention sera importante. Le choix de la phase mobile sorientera alors vers des
teneurs en eau plutt faibles.
Il existe alors une relation linaire entre k et P du type :
log10 k = a log10P + b
Log P = fi + CM kj
Le tableau ci-dessous donne quelques valeurs de ces incrments fi
CH3
CH3
OH
1-phenylpropan-2-ol
Actophnone
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Sans voir, dans le dtail tous les constitua,ts de cet ensemble, on va dtailler trois points important de
cet ensemble, savoir le systme de pompage, linjecteur et les systme de dtection.
La pompe permet de dlivrer un dbit constant de phase mobile vers la colonne. Les pertes de charge,
dans les colonnes chromatographique, tant originellement de plusieurs centaines de bars, le
dveloppement de la technique a t troitement li celui des pompes en terme dtanchit et de
constance de dbit. Aujourdhui, les pertes de charges dans les systmes chromatographique est plutt
de lordre de 50-100 bars, parfois pls lorsque lon utilise des phases mobiles contenant beaucoup
deau.
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En terme mcanique, on utilise essentiellement des pompes piston une ou plusieurs ttes mues par
une came de forme varie suivant le nombre de tte. Un schma de principe dune pompe deux ttes
montes en parallle et came en forme de cardiode est prsent ci-aprs.
Lavantage de tels systmes est la constance du dbit. Linconvnient est la prsence de deux sries de
clapets (une par piston) monts sur les lignes dadmission et de refoulement. Ces clapets sont le cur
de la pompe. Afin dobtenir un dbit constant dans la colonne chromatographique, le clapet de
refoulement doit tre hermtiquement ferm lors de la phase daspiration de la phase mobile dans la
chambre de pompe et, linverse, lors de la phase de refoulement, cest le clapet situ sur la ligne
dadmission qui doit tre hermtiquement ferm.
Ceci impose davoir des phases mobiles exempte de particules en suspension (filtration sur filtre de
porosit 0,45 m. De plus, elles doivent tre exempte de gaz dissous (ceux-ci se dsorberaient la
compression et creraient des problmes dtanchit. Pour cela on procde un dgazage pralable
des phase mobiles (traitement des phases mobiles aux ultra-sons) Dautres contraintes existent,
notamment dans le cas de changement de phase mobile, mais ne seront pas abordes dans le cadre de
ce chapitre
En mode isocratique, une seule pompe suffit lapprovisionnement de la colonne en phase mobile (il
suffit de prparer sa phase mobile avant le pompage). Dans le cas du gradient dlution, le systme est
plus complexe : On peut procder de deux manires :
Lintrt du second systme est vident par rapport aux clapets et des problmes de maintenance quils
gnrent. Un schma de principe dun tel systme est prsent ci-aprs
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42 Linjection
Dans une grande majorit des cas on utilise des vannes dinjections six voies dont le schma
de principe est donn ci-dessous :
Ces vannes sont constitues de deux parties : Un stator et un rotor spar par un mica solidaire
du rotor. Le stator est quip de six connections (numrotes de 1 6) et 3 gorges en formes
de haricots et dcales de 60 sont graves sur le mica. Le rotor peut occuper 2 positions Load
(chargement) et Inject (injection vers la colonne chromatographique)
Dans la premire position, Load, la pompe est connecte directement vers la colonne (voies 1
et 2) via le mica. Les positions 3 et 6 sont relies entre-elles par une boucle externe dun
volume fixe (en gnral 20l, mais il peut tre diffrent). La position 5 est relie une
seringue externe et la position 4 est relie lvent. La position du mica met en
communication les positions 5 et 6, les positions 3 et 4. On peut ainsi procder au remplissage
de la boucle avec lchantillon analyser (ce remplissage est ralis laide dune seringue
externe de 100 ou 250 l qui devra rester en position, une fois le chargement ralis afin
dviter les problmes de vidange par siphonage de la boucle dinjection.
Dans la position Inject, on fait subir une rotation de 60 au rotor, et par voie de consquence
au mica. La position 1 se trouve alors connecte la position 6 (boucle) elle-mme relie la
position 3 (par la boucle externe). Par lintermdiaire du mica, la position 3 est relie la
colonne chromatographique (position 2) : On procde ainsi linjection des 20l
dchantillon dans la colonne chromatographique. On notera que pendant cette opration, les
positions 4 et 5 sont relies entre-elles par lintermdiaire du mica, ce qui limine la
possibilit dinjection multiple. Cette action ralise, on peut alors retirer la seringue
dinjection (position 5) sans risuqe de vidange de la boucle dinjection. En gnral, on ne
travaillera pas en balayage de boucle, si bien quau bout de 1minute environ de balayage on
repositionnera le rotor dans sa position initiale, Load.
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Le principal avantage de ce systme dinjection est la constance du volume inject (en prenant
toutefois certaines prcautions). Cet aspect est fondamental puisquil autorise lutilisation de
mthode dtalonnage externe, ce qui simplifie, dans bien des cas, la procdure de
quantification.
A partir de ce systme lmentaire dinjecteur, on peut concevoir des systmes de plus en plus
complexes (vannes dinjections 24 voies avec rtro balayage, injections multi colonnes, ect..
La seconde possibilit est lautomatisation de linjection via un passeur automatique
dchantillons. Mcaniques ou pneumatiques, ces systmes mettent en uvre trois ras (suivant
les axes x,y et z du tridre) qui vont permettre la prhension de lchantillon (flacons vials),
son positionnement sous une seringue de prlvement et le chargement et linjection par
lintermdiaire dune vanne six voies.(reste simplement loprateur bien le programmer)
Dautres systmes dinjection existent sur le march, notamment les vannes dinjection
tiroir. On retiendra simplement que leur utilisation est plutt rserve la chromatographie
prparative.
43 La dtection
431 Gnralits
Un de points communs tous les systmes de dtection est la notion de drive de ligne de
base et de bruit ( court et long terme)
La drive traduit lcart entre la ligne de base moyenne et lhorizontale sur une priode
assez longue (1 heure). Elle est quantifie par la valeur de langle obtenue.
Le bruit long terme est mesur sur une chelle de temps plus courte (une dizaine de
minute).Cest lui qui va fixer la quantit minimale dtectable de solut. Plus ce bruit est
important, moins la limite de dtection sera faible.
Le bruit court terme est mesur sur des intervalles de temps de 1 minute. Il traduit les
fluctuations rapides de la ligne de base (du signal) et peut tre gnant en quantification.
Le schma ci-dessous illustre ces trois termes.
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Deuxime point important des dtecteurs est la quantit minimale dtectable. Lie au
bruit court terme, cette notion traduit la plus petite quantit (le plus petit signal) que lon
peut considrer comme fiable et traduisant la quantit relle de solut prsente. Au minimum,
cette quantit minimale se traduit par un signal gal au moins deux fois le bruit (cette valeur
peut tre beaucoup plus importante selon les laboratoires).
Dernier pont, la sensibilit du dtecteur traduit la pente de la courbe signal en fonction
de la concentration. La courbe ci-dessous traduit ces deux notions :
Absorption molculaire
Dans le cas de la dtection UV-visible, on irradie le solut une longueur telle quil va
absorber de lnergie et on mesurera le signal transmis.
Dans le cas de la fluorimtrie, on irradie le solut avec une radiation adapte son excitation
et on mesure lintensit de la radiation mise par le solut lors de son passage ltat
intermdiaire. La variation dnergie tant pluds faible, ce passage va saccompagner dune
mission une longueur donde plus grande que celle de la radiation dmission (cest ce que
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lon observe dans la norme propose. Dans les deux cas, la rponse est proportionnelle la
concentration (Loi de Beer-Lambert).
La sensibilit de tels dtecteurs peut-tre trs leve et est lie au coefficient dextinction
molaire du solut.
Dans le cas de la fluorimtrie elle peut atteindre 10-12 mol /l. Dans la norme prsente, les
quantits minimales dtectables sont de lordre de 10 ng /l pour les benzo fluoranthnes et
benzopyrne et de 50 ng / l pour les autres composs, ce qui correspond des concentrations
molaires de 4*10-11 et 2 10-10 mole /l
La limite dutilisation de ces dtecteurs est lie au fait que les soluts doivent absorber la
lumire (dans le domaine UV ou visible) ou doivent tre potentiellement fluorescent. On
verra, par les ractions de drivatisation, comment on peut contourner ce problme
Autres dtecteur caractre universel, le rfractomtre diffrentiel. Son principe est bas sur
la mesure de la diffrence dindice de rfraction entre la phase mobile pure et lluat en sortie
de colonne. Beaucoup moins sensible que les autres dtecteurs (10-6 mole/l) et sensible la
temprature, il prsente linconvnient dtre diffrentiel, ce qui interdit les lutions en mode
gradient de concentration. En effet on ne sait pas, techniquement, remplir la cellule de
rfrence avec la phase mobile de mme composition que celle de lluat (sans les soluts
videmment). Cet aspect limite son utilisation llution en mode isocratique.
Une application classique dutilisation de ce dtecteur concerne lanalyse des sucres (a courte
chane (DP1, DP2, DP3) qui nabsorbent pas en UV, les seuils de dtection se situant autour
de 10-5 mole/l.
Appliqu lanalyse des sucres, il permet lanalyse doligomres plus lourds (jusqu DP 12).
Parmi les autres dtecteurs rencontrs en chromatographie liquide, on peut citer, le dtecteur
conductimtrique qui est particulirement appliqu la chromatographie ionique. Son
principe repose sur la mesure de la conductivit de lluat compare celle de la phase
mobile. Systme diffrentiel, il nest utilisable, ltat brut, quen mode isocratique.
Les progrs de la technologie ont transform ce type de dtection avec une notion de
suppression de fond qui rend ce mode de dtection applicable en gradient dlution.
Les dtecteurs semi informatifs reposent sur des principes quivalents ceux des dtecteurs
simples. La diffrence rside dans le fait quils vont offrir la possibilit de comparer des
rponses diffrentes longueurs dondes (absorptiomtrie et fluorimtrie) ou par rapport
diffrents types dlectrodes (lectrochimique). Quatre niveaux de dtections taient souvent
utiliss (en absorption molculaire).
Fort de ces progrs technologiques, les chercheurs ont dvelopp et adapt des techniques
plus lourdes ( Infra-rouge transforme de Fourrier, Rsonance Magntique Nuclaire et
Spectromtrie de masse) qui fournissent non seulement des informations en terme de
quantification du solut mais galement des informations sur lidentification du solut prsent
sous le pic chromatographique. Cet aspect dbordant le cadre du contrle simple ne sera pas
abord ni dvelopp dans le cadre de ce cours.
V) La drivatisation
Le solut, tant ce quil est, loprateur na pas grand moyen de le changer. Cependant il peut
tre amen le modifier soit pour amliorer la qualit des sparations (on reverra cet aspect
en chromatographie en phase gazeuse : Amlioration de la volatilit des soluts sous forme
desters ou dthers), soit pour amliorer la qualit du chromatogramme obtenu et le niveau de
dtection de ceux-ci. Dans cette seconde optique, deux procds sont utiliss :
- La drivatisation pr colonne
- La drivatisation post colonne
Ces deux techniques ncessitent une phase de mise au point notamment en ce qui concerne la
slectivit de la raction de drivatisation et sa cintique ractionnelle.
Ces soluts, combien important pour le cycle de la vie, prsentent des rponses faibles au
niveau des dtecteurs classiquement utiliss. Un des moyens utiliss pour amliorer leur
dtection consiste les traiter par lorthphataladhyde pour conduire des drivs prsentant
un chromophore important qui permet dabaisser le seuil de dtection. La raction de
drivatisation ayant lieu avant lanalyse chromatographique, on comprendra aisment que lon
ne sparera pas les acides amins mais leurs drivs. Un exemple daminogramme est expos
ci-dessous.
Aprs hydrolyse totale de la matire protique(HCl concentr pendant 48h 110C), les
acides amins constitutifs sont traits par une solution dorthophtalaldhyde suivant le schma
ractionnel (appliqu lalanine):
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COOH H COOH H
O O
H3C O N
OH + OH
NH2 CH3
Le mlange de drivs dimines est alors chromatographi (dans les 3 mn suivant la raction
de drivatisation) sur une colonne spcifique OPA HR (alltech) quip dun dtecteur de
fluorescence (excit. = 325 nm, mis. = 470 nm). Llution est ralise en mode gradient
dlution avec un binaire constitu de :
Temps (mn) 0 9 33 42 45
%B 0 7 46 85 0
%A 100 93 54 15 100
Un exemple dapplication de cette technique est illustr par le dosage de la vitamine C (acide
ascorbique) ,de ses drivs (acide isoascorbique) et composs rduits (acide
dhydroascorbique et isodhydroascorbique.
Dans cette sparation, ralise sur silice greffe C18 (chromatographie de paire dion : phase
mobile : chlorure de dodcyl trimthyl ammonium 2.3 mM en milieu tamponn), on ralise,
post colonne une raction de drivatisation pour introduire sur les soluts un chromophore
rendant ceux-ci fluorescent (excitation 350 nm et mission 430 nm).
A partir de ces deux concepts de base (adsorption et partage), on peut dcliner la technique
suivant un certain nombre de terminologie qui diffrent soit par le domaine dapplication, soit
par la nature du greffon (et de la phase mobile) soit par la nature de la phase stationnaire.
Parmi les principales, on peut citer quatre techniques prsentes dans le tableau ci-aprs :
Dans cette technique, on utilise une phase stationnaire apolaire et une phase mobile aqueuse
de manire similaire la chromatographie en phase inverse. Le concept diffre par le domaine
dapplication et la modification sensible de la phase mobile.
La technique sapplique aux espces organiques ionises (ou ionisables). De par leur caractre
ioniques, ces espces sont fortement hydrophiles et donc prsentent des rtentions faibles,
voire nulle, en chromatographie en phase inverse. On va donc crer in Situ une paire dion
entre le solut et une entit ionique que lon va introduire dans la phase mobile. Deux familles
de composs sont utiliss suivant que les soluts ont un caractre cationique ou anionique :
24
Dans le cas de soluts anioniques, on utilisera des sels dammonium. Dans le cas de soluts
cationiques, on utilisera des sels dacides sulfoniques :
Exemples :
Paire dions stable qui sera spare en phase inverse. On comprendra aisment que la nature
de R influera sur le choix de R, de manire adapter les interactions de la paire dion avec la
phase stationnaire : Si R est petit, on choisira R plutt volumineux et, linverse, si R est
volumineux, on choisira R petit.
Ces paires dions seront alors spares suivant les critres de la chromatographie en phase
inverse.
62 Chromatographie chirale
Pour un support donn (diamtre de pore fix), une grosse molcule, de taille suprieure au
diamtre des pores du support, ne pourra pntrer dans aucun pore du support. Elle traversera
alors la colonne, sans interaction avec le support et sera lue avec le volume mort (rtention
nulle).
A linverse, une petite molcule pntrera dans tous les pores du support et prsentera une
rtention maximum
Entre les deux, en fonction de leur taille, les autres molcules pntreront dans un nombre
plus ou moins important de pore du support et conduiront des rtentions plus ou moins
importante, comprise entre le volume mort et la rtention maximum.
25
Dernier aspect abord dans ce chapitre, cette technique sapplique aux ions minraux (anions
et cations). Elle est base sur des comptitions d interactions Coulombienne entre la phase
stationnaire, les soluts et la phase mobile.
1
-
Rsine-SO3 H + Na+ +
mob Rsine-SO3-Na+ + H+mob
2
Dans le cas de sparation danions, Cl-, SO42-, PO43-, on utilisera un support cationique de
type rsine ammonium (dautres supports existent) sur lequel on va fixer nos anions (sens 1)
et on luera le systme avec une solution basique (OH-) (sens 2), ce que lon peut
schmatiser :
1
Rsine-NH3+OH- + Cl-mob Rsine-NH3+Cl- + OH-mob
2
La nature des rsines et des phases mobiles peut tre vaste en fonction des applications. On
concevra aisment, en ce qui concerne les soluts, que leur rtention sera fonction de leur
taille et de leur charge ; Les interactions les pls fortes auront lieux avec les espces les plus
charges et les plus petites.
Une application que vous rencontrerez, peut tre, dans votre vie quotidienne, concerne les
adoucisseurs deau (domestique) Ce ne sont que des mlanges de rsines cationiques (sous
forme OH-) et de rsines anioniques (sous forme H+). Sur le premier support on va fixer les
anions polluant leau (et librer des ions OH-) et sur le second, on va fixer les cations (et
librer des ions H+), ce qui permet dobtenir une eau de bonne qualit (suivant la nature des
rsines)