Aspects Théoriques de La Chromatographie BSSH

ASPECTS THEORIQUES DE LA
CHROMATOGRAPHIE
Dr. H. BEN SI SAID
I. Généralités
II. Etude théorique de la chromatographie
III. Les grandeurs fondamentales de la chromatographie
IV. Optimisation de la séparation
UNIVERSITE MOULOUD MAMMERI DE TIZIOUZOU

FACULTE DE MEDECINE - DEPARTEMENT DE PHARMACIE
LABORATOIRE DE CHIMIE ANALYTIQUE
Dr. H. BEN SI SAID (3ème année Pharmacie) Aspects théoriques de la chromatographie
I. Généralités
1. Introduction :
La chromatographie est une méthode analytique qui est largement utilisée pour la séparation,
l’identification et le dosage des constituants chimiques dans des mélanges complexes. Il
n’existe aucune méthode de séparation qui soit aussi puissant et d’application aussi générale.
2. Historique :
Bien que certains historiens fassent remonter l’origine de la chromatographie jusqu'à
l’Antiquité, on retient, généralement, les travaux du botaniste russe Tswett, qui, en séparant
les pigments de la chlorophylle sous la forme d’anneaux colorés sur une colonne remplie de
carbonate de calcium, a donné le nom de chromatographie (séparation selon les couleurs) à
la méthode (1903). Ont été rassemblées ici quelques grandes dates de l’évolution de la
chromatographie :
1903 − Séparation de pigments (Tswett)
1931 − Séparations préparatives (Kuhn et Lederer)
1938 − Chromatographie sur couche mince (Ismailov et Shraiber)
1939 − Chromatographie par échange d’ions (Samuelson)
1941 − Chromatographie de partage (Martin et Synge)
1952 − Chromatographie en phase gazeuse sur colonnes remplies (James et Martin)
1954 − Séparation des acides aminés par chromatographie d’échange d’ions (Moore et
Stein)
1959 − Chromatographie en phase gazeuse sur colonnes capillaires (Golay)
1962 − Chromatographie en phase supercritique (Klesper)
1968 − Chromatographie en phase liquide à haute performance (Giddings et Kirkland)
3. Définitions :
La chromatographie est une méthode de
séparation non destructrice d’un mélange
liquide ou gazeux en ses différents constituants.
C’est également une méthode analytique qui a
pour but d’identifier et de quantifier les
composés d’un mélange homogène.
UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 1 sur 24

Le principe repose sur les équilibres de concentration des composés présents entre deux
phases non miscibles en contact :
✓ La phase stationnaire qui est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un
support
✓ La phase mobile se déplace au contact de la phase stationnaire.
L’entraînement à des vitesses différentes des composés présents dans la colonne par la phase
mobile conduit à leur séparation. Les composés traversent la colonne avec des temps qui
dépendent de leurs propriétés intrinsèques (taille, structure…) ou de leur affinité avec la
phase stationnaire (polarité…). A leur sortie de la colonne, le détecteur mesure en continu
la quantité de chacun des constituants du mélange.
4. Classification des méthodes chromatographiques :

Les méthodes chromatographiques regroupent des techniques très variées qui peuvent être
classées selon trois modalités différentes :
1. Classification selon le procédé opératoire.
2. Classification selon la nature physique des phases
3. Classification selon le phénomène mis en œuvre
4.1. Classifications selon les procédés utilisés : (classification générale)

4.1.1 Selon le conditionnement de la phase stationnaire :
A. Chromatographie sur colonne : la phase stationnaire est maintenue dans un tube étroit
et la phase mobile y progresse par gravité ou sous l’action d’une différence de
pression
B. Chromatographie planaire : la phase stationnaire est présente à la surface d’un
support plat (Chromatographie sur couche mince) ou immobilisée à l’intérieur des
pores d’une feuille de cellulose (Chromatographie sur papier).
4.1.2 Selon les modalités de migration de la phase mobile :
A. Chromatographie par développement : les constituants de l'échantillon restent sur la
phase stationnaire)
B. Chromatographie d'élution : les substances sont entraînées hors de la phase
stationnaire).
4.2. Classification selon la nature des phases (classification principale) :
• La phase mobile est un fluide, donc soit un liquide, soit un gaz (soit encore un fluide
"supercritique")
• La phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide.
La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités :

✓ Chromatographie liquide—solide (cas de Tswett) (LSC)
✓ Chromatographie liquide—liquide (LLC)
➢ Chromatographie gaz—solide (GSC ou GC)

➢ Chromatographie gaz—liquide (GLC ou GC)
❖ Chromatographie en phase supercritique (SFC)

4.3. Classification selon le phénomène chromatographique :
Ce dernier dépend de la nature (et de la structure) de la phase stationnaire utilisée (qui
impose les interactions avec le soluté). On distinguera donc :
4.3.1 La chromatographie d'adsorption (LSC, GSC) :
Lorsque la phase stationnaire est un solide adsorbant et que la séparation est fondée sur les
différences d’adsorption des molécules du mélange par la phase stationnaire.
A. Rappel sur les phénomènes d’adsorption :
L’adsorption est un phénomène physique de surface qui consiste à la rétention plus au moins
énergique d’un soluté (solide, gaz, liquide) sur une surface solide. Cette rétention est induite
par des forces différents types : électrostatiques, inductives, force de dispersion de London,
liaisons hydrogènes et forces de transfert de charge.
Pour que cette adsorption soit utilisable à des fins séparatives, il est nécessaire que cette
rétention soit REVERSIBLE.
Les relations qui expriment les différents équilibres sont
présentées dans le schéma suivant :
La variation de la concentration de soluté adsorbé en fonction de sa concentration dans

l’éluant est donnée par la relation de Freundlich :
Cads = concentration du soluté par gramme d’adsorbant

Cm = concentration du soluté dans l’éluant
K = coefficient d’adsorption : Constante qui dépend du soluté, adsorbant et l’éluant.

B. Chromatographie d’adsorption :
La silice et l’alumine sont les phases stationnaires les plus
utilisées. Le soluté et le solvant peuvent être attirés par les
sites polaires situés à la surface de la phase stationnaire
adsorbante.
Si les solutés présentent des interactions différentes vis-à-
vis de la phase stationnaire, leur séparation sera possible
✓ Elle s’applique à la séparation des composés comportant des groupements
fonctionnels polaires.
4.3.2 La chromatographie de partage (LLC, GLC) :
La phase stationnaire est un liquide déposé ou greffé sur un support
solide. La séparation est basée sur le partage du soluté entre les deux
phases liquides (Solubilité relative = mise en jeu de coefficients de
partage).
✓ Elle convient à la séparation des molécules plus au moins polaires dont le poids
moléculaire < 2000
4.3.3 Chromatographie par échange d’ion (CL)1 :
La phase stationnaire est un solide ayant des propriétés
particulières que l’on appelle un « échangeur d’ions ». Ce solide
comporte des groupements fonctionnels fixes ionisés ou
ionisables. Les ions qui assurent l’électroneutralité de la structure
sont mobiles et échangeables avec ceux de la phase mobile en
contact avec l’échangeur (greffé sur des polymères ou des silices).
✓ Elle convient à la séparation des solutés ionisés ou ionisables.
4.3.4 Chromatographie d’exclusion stérique (CL) : (On dit aussi de
perméation ou de filtration sur gel).
La phase stationnaire est un matériau poreux (généralement un
GEL) ayant des pores de dimension bien déterminée. Il se
comporte comme un véritable tamis vis-à-vis des molécules
ayant des masses et tailles différentes. La dimension des pores
est voisine des dimensions de certaines des molécules à
séparer.
1
CL = Chromatographie liquide

Celles qui sont trop grosses pour pénétrer dans les pores sont exclues de la phase stationnaire
et sont éluées d’abord, celles qui pénètrent sont éluées ensuite.
✓ Elle convient à la séparation des composés à haut poids moléculaires :
macromolécules dont les protéines et polymères.
A côté de ces phénomènes chromatographiques, il se développent des procédés plus
spécifiques reposant sur des interactions plus sélectives.
4.3.5 La chromatographie de paires d’ions (CL).
On forme des paires d’ions entre les constituants (ionisés) du mélange à séparer et un contre-
ion convenable. Ces paires d’ions se distribuent entre la phase mobile et la phase stationnaire
(le plus souvent celle-ci est une phase greffée).
4.3.6 La chromatographie d’échange de ligands (CL).
La phase stationnaire contient une espèce fixée irréversiblement capable de former des
complexes avec les solutés à séparer.
4.3.7 La chromatographie d’affinité (CL).
Cette méthode s’apparente à celle de l’échange de ligand. Elle est dite bio-spécifique lorsque
la phase stationnaire est constituée d’un ligand présentant une grande affinité pour certaines
molécules bioactives.
4.3.8 La chromatographie chirale (séparation des énantiomères)
5. Principe de la séparation en chromatographique :

Dans toute méthode chromatographique, les séparations sont fondées sur la distribution des
solutés entre deux phases non miscibles, l’une fixe dite phase stationnaire, l’autre en
mouvement dite phase mobile.
De la sorte, l’opération de partage des espèces à séparer entre les deux phases se trouve
répétée automatiquement un très grand nombre de fois pour chaque espèce de manière
continue (succession d’équilibres) permettant ainsi l’exploitation de différences minimes du
coefficient de distribution des espèces entre les deux phases.
Alors que la phase mobile tend à entraîner les espèces à séparer dans son mouvement, la
phase stationnaire tend à les retarder, d’autant plus fortement que les interactions mises en
jeu sont plus intenses, nombreuses et plus énergétiques ; il en résulte que les analytes ont,
pour la plupart, des vitesses de déplacement différentes et inférieures à celle de la phase
mobile, d’où la notion de rétention et la possibilité de séparations.

6. Mise en œuvre pratique de la chromatographie sur colonne :

L’expérience de base en chromatographie peut être décrite comme suit (figure 1) :
1. On immobilise dans une colonne un solide finement divisé appelé phase stationnaire.
2. On place au sommet de cette colonne un petit volume de l’échantillon à séparer.
3. On force cet échantillon à traverser la colonne de haut en bas au moyen de la phase mobile
afin d’entraîner ses divers constituants.
Si les composés présents migrent à des vitesses différentes, ils pourront être recueillis
séparément, chacun en solution dans la phase mobile.
Figure 1 : L’expérience de base en chromatographie.
Ce procédé est devenu en soi une méthode d’analyse lorsqu’on eut l’idée de mesurer les
temps de migration des composés dans la colonne pour les identifier. Pour cela il devenait
indispensable de maîtriser certains paramètres (débit de la phase mobile, température etc.)
et il fallait placer en sortie de colonne un détecteur pour repérer les changements de
composition de la phase mobile (figure 2).
Cette application de la chromatographie, dont le but n’est plus de récupérer les composés
séparés mais de mesurer leurs temps de passage dans la colonne s’est développée lentement.
Figure 2 : schéma d’un système chromatographique
Chaque séparation effectuée donne lieu à un enregistrement particulier appelé

chromatogramme, qui correspond au tracé des variations de composition de la phase éluée
au cours du temps. Pour obtenir ce document particulier, il faut placer à l’extrémité aval de
la colonne un capteur appelé détecteur dont il existe un grand nombre de variantes.

II. Etude théorique de la chromatographie.
1. Introduction :
On a vu que dans le cas de la chromatographie sur colonne on obtient, à la sortie du
détecteur, un « signal » que l’on peut enregistrer graphiquement : le chromatogramme.
Chaque constituant est caractérisé, sur le chromatogramme, par un « pic ». Les pics seront
plus ou moins larges et plus ou moins éloignés les uns des autres en fonction de leur durée
de rétention dans la colonne ; ils rendront compte de l’efficacité de la séparation.
Si on obtient une séparation imparfaite de deux composés, deux démarches sont concevables
pour pallier ce problème :
✓ La première revient à éloigner les pics l’un de l’autre en modifiants leurs paramètres
de rétention. Cette démarche est fondée sur la thermodynamique de la séparation.
✓ La seconde consiste à rendre chacun des pics plus étroits en modifiant les paramètres
qui influencent la cinétique des séparations pour rendre la séparation plus efficace.
Ainsi, les théories de la séparation chromatographique peuvent être classées en théories
thermodynamiques, qui traitent des temps ou des volumes de rétention, et en théories
cinétiques, qui s’attachent au processus de transfert de matière (qui influence
l’élargissement des pics).
2. Théories de la chromatographie :
L’étude théorique de la chromatographie a tout d’abord été effectuée en assimilant la
colonne chromatographique à une colonne à distiller où la progression des substances est
considérée comme une succession d’équilibres se réalisant entièrement dans des étages ou
plateaux fictifs appelés plateaux théoriques.
Cette notion de plateaux théoriques appliquée à la colonne chromatographique permet
d’expliquer par des lois les phénomènes d’élution et de séparation. Mais cette théorie
présente des imperfections car elle assimile la chromatographie à une suite discontinue
d’opérations et elle suppose que chaque équilibre se réalise entièrement sans tenir compte
des phénomènes de diffusion et de l’écoulement continu de la phase mobile qui en réalité
diminuent les échanges.
Pour compléter cette théorie, d’autres théories ont été élaborées comme la théorie cinétique
dans laquelle l’aspect dynamique de la phase mobile est pris en considération ainsi que
l’influence de facteurs tels que la température et la pression.

2.1. Théorie des plateaux :

Dans cette théorie, une colonne chromatographique est considérée comme constituée par
une juxtaposition de volumes identiques contenant tous les mêmes proportions de phase
stationnaire et de phase mobile (figure 3).
Figure 3 : illustration de la théorie des plateaux
Par analogie avec la distillation et avec l’extraction, chaque volume ainsi défini est appelé
plateau théorique car dans chacun, les équilibres de répartition des substances entre phase
mobile et phase stationnaire sont supposés se réaliser entièrement de telle sorte que
l’équation exprimant l’équilibre général soit satisfaite :
K est le coefficient de partition d’une substance entre la phase stationnaire et la phase

mobile. Pour la chromatographie :
✓ Gaz et liquide : ce coefficient est appelé coefficient de partage
✓ D’adsorption : ce coefficient est appelé coefficient de d’adsorption
✓ Sur gel : ce coefficient est appelé coefficient de diffusion…
NB : Cette relation est vérifiée uniquement lorsque ces concentrations ne sont pas très importantes (ce qui
sera toujours admis).
2.1.1 Hauteur équivalente à un plateau théorique :

Les équilibres successifs au cours de la migration du soluté sont à la base de la notion de
plateau théorique selon lequel la colonne de longueur L est découpée en N petits disques
fictifs de même hauteur H, numérotés de 1 à n.
Pour chacun d’eux, la concentration du soluté dans la phase mobile est en équilibre avec la
concentration dans la phase stationnaire de ce soluté. À chaque nouvel équilibre le soluté a
progressé d’un petit disque supplémentaire dans la colonne, appelé plateau théorique.
La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT ou H) vaut donc :

H et N caractérisent le fonctionnement de la colonne car ils dépendent de
la nature des phases, de la géométrie de la colonne et de tous les facteurs influençant les
équilibres.
Pour des colonnes de même longueur, celles où les équilibres se réalisent le plus rapidement
ont le nombre de plateaux théoriques le plus élevé ou sont celles dont le HEPT sont les plus
basses.
2.1.2 Equilibre sur la colonne :
Si on se place à l’instant I, le plateau J contient une
masse totale de soluté mT qui se compose de la
quantité mM de ce soluté qui vient d’arriver de la phase
mobile du plateau J −1, en équilibre à l’instant I −1, à
laquelle s’ajoute la quantité mS déjà présente dans la
phase stationnaire du plateau J à l’instant I − 1.
En posant MS = K.MM et en écrivant que pour chaque plateau MT = MM + MS, on peut pour
chaque plateau, par une formule de récurrence, calculer M T (ainsi que MM et MS) :
Exemple pratique :
Considérons le cas d’un composé qui après avoir été déposé à l’entrée d’une colonne, est
élué par une phase mobile de composition fixe.
Supposons que l’on parte de 64 mg d’un composé pur dont le coefficient de distribution K
est égal à 1. On suppose par ailleurs que la colonne fait cinq plateaux théoriques. Un plateau
théorique est représenté ici par une case du tableau suivant. La colonne est vue aux instants
qui correspondent aux cinq états d’équilibres successifs.
A l’instant 1, le soluté se trouve concentré dans le plateau 1 : 32 mg se fixe dans la phase
stationnaire et 32 mg restent dans la phase mobile.
L’instant 2 correspond à l’équilibre suivant qui apparaît après avoir ajouté un volume de
phase mobile égal à celui que contient un plateau. Les deux premiers plateaux sont
maintenant concernés. Dans le premier plateau 16 mg du soluté sont cédés à la phase mobile
pure (K=1). Par contre dans le plateau 2, 16 mg se fixent sur la phase stationnaire.

De proche en proche on arrive au profil de répartition du soluté à l’instant 5 tel qu’il est
indiqué dans la 5ème colonne du tableau. Instants 1, 2, 3, 4 et 5
Plateau 1, 2, 3, 4 et 5
Quand au chromatogramme (figure 4),

il représente la masse transitant dans la
phase mobile par le N+1ème plateau au
cours des équilibres successifs.
Figure 4 : Chromatogramme (model
des plateaux théoriques)
2.1.3 Avantages et inconvénients de la théorie des plateaux :

Permet :
✓ D’identifier les composés à séparer au moyen de paramètres que la théorie définit.
✓ De chiffrer l’efficacité d’une colonne par le calcul du nombre de plateaux théoriques.
Rend compte :
✓ De la forme gaussienne des pics et des différents facteurs influençant le déplacement
des solutés
Elle ne permet pas :
✓ D’interpréter l’élargissement des bandes en raison de l’hypothèse selon laquelle les
conditions d’équilibre sont partout respectées pendant l’élution.
Ne prend pas en compte :
✓ L’état dynamique existant dans la colonne où la φm se déplace par rapport à la φs à
une vitesse telle que l’équilibre n’a pas le temps de s’établir.

2.2. Théorie cinétique :

La théorie des plateaux a permis d’arriver à un certain nombre de conclusions
expérimentalement vérifiées, mais elle néglige le fait que la chromatographie est un
phénomène dynamique résultant du passage continu de la phase mobile sur la phase
stationnaire.
On observe en effet, un élargissement ou un rétrécissement des pics que la théorie des
plateaux ne peut pas exprimer.
La théorie cinétique lie le nombre de plateaux d’une colonne ou plus exactement la HEPT à
la vitesse d’écoulement de la phase mobile et à différents facteurs dépendants qui n’avaient
pas été pris en considération par la théorie des plateaux. Cette théorie cinétique est
représentée par l’équation de Van Deemter :
Cette équation est généralement appliquée à la chromatographie gazeuse. Elle établit une
relation simplifiée entre la vitesse linéaire d’écoulement (ou le débit) de la phase mobile u,
la diffusion turbulente A, la diffusion longitudinale B et la résistance au transfert de masse
C.
2.2.1 Vitesse d’écoulement de la phase mobile :
La vitesse d’écoulement u de la phase mobile dépend de la température, de la pression
imposée à la phase mobile et de la nature de la colonne.
A une température constante, elle est définie par la relation issue de la loi de Darcy :
2.2.2 Termes d’équation de Van Deemter :

1er terme A : Diffusion turbulente, Anisotropie d’écoulement ou EDDY diffusion :
Il est dû à l’écoulement irrégulier de la phase mobile à travers la phase
stationnaire. Leurs tailles et leurs formes ne sont pas identiques et les
trajets effectués autour de chacune sont différents.
La substance à chromatographier progresse donc également de manière
irrégulière, il en résulte un élargissement de la zone dans laquelle elle
se trouve par suite du phénomène de diffusion.
Le terme A, indépendant du débit de la phase mobile, ne dépend que des particules et croît
avec leur diamètre. λ : régularité du remplissage
dp : diamètre des particules de la phase stationnaire
2ème terme B : diffusion longitudinale :

Rend compte de la diffusion des molécules dans la direction de
l’écoulement de la phase mobile. Ce phénomène est général pour
toutes les particules se trouvant dans un fluide en mouvement et est
d’autant plus important que la vitesse est faible : B = 2 γ Dm
Dm : est le coefficient de diffusion du composé considéré dans la phase
mobile. Ce paramètre est négligeable lorsque la phase mobile est un
liquide, il est de 104 à 106 fois plus important lorsqu’il s’agit d’un gaz.
Ce facteur de diffusion augment avec l’élévation de la température
mais diminue lorsque la pression croît.
γ : est appelé facteur de tortuosité. Il représente l’influence de la colonne (granulométrie des
particules, régularité du remplissage…). Il est d’autant plus faible que le cheminement des
molécules est plus uniforme.
3ème terme C : facteur de résistance aux transferts de masse
C représente les inégalités de passage des molécules d’une phase à l’autre.
C = C M + CS
✓ Dans la phase mobile toutes les molécules ne sont pas entraînées à la même vitesse et
celles du milieu du flux progressent plus vite que celles se trouvant à l’extérieur créant
ainsi des conditions de partage différentes.
✓ Le contact phase mobile phase stationnaire ne s’effectue pas partout de manière
identique et les molécules de soluté fixées dans la phase stationnaire sont situées à
des distances variables de la phase mobile et l’élution ne se fait pas partout à la même
vitesse.
Tous ces phénomènes entraînent des retards aux établissements d’équilibre d’autant plus
accentués que le débit de la phase mobile est plus rapide.

➢ Pour atténuer ces facteurs de résistance, il y aura lieu de diminuer les distances à parcourir
dans chaque phase en réduisant le diamètre des particules, l’épaisseur de la phase
stationnaire et en utilisant une colonne régulièrement remplie et bien tassée.
La courbe représentant l’équation de Van Deemter est une hyperbole (figure 5). Elle montre
que la variation de la HEPT en fonction de la vitesse d’écoulement passe par une valeur
minimale calculée en cherchant la valeur de u correspondant à l’annulation de la dérivée
première de cette fonction :
Pour que f’(u) = 0 il faut que :
Dans ce cas, la hauteur efficace d’un plateau théorique est :
Figure 5 : courbe de Van Deemter
✓ Pour u > uo l’augmentation du débit provoque une augmentation de la HEPT. Les

temps de contact entre les deux phases sont courts et les équilibres n’ont pas le temps
de s’établir complètement.
✓ Pour u < uo Les phénomènes de diffusion longitudinale deviennent prépondérants et
entraînent également une augmentation de la HEPT.
De manière pratique, il convient donc de rechercher les conditions opératoires qui, pour
une colonne donnée, permettent d’obtenir la plus grande efficacité c’est‐à‐dire la plus
faible valeur de la HEPT.
2.2.3 Equation de Knox :
Une autre équation – connue sous le nom d’équation de Knox –
plus récente (1977), est applicable aux divers types de
chromatographie liquide. Elle fait intervenir la hauteur réduite :

✓ Hauteur de plateau réduite :

En chromatographie dont la phase mobile est un liquide et pour les colonnes dont le
remplissage est formé de particules sphériques, on rencontre assez souvent la hauteur de
plateau réduite, h, qui tient compte du diamètre moyen dm des particules. On élimine en
quelque sorte l’effet de la taille des particules.
Des colonnes présentant le même rapport (longueur de la colonne) / (diamètre des particules)
conduisent à des performances semblables.

III. Les grandeurs fondamentales de la chromatographie
1. Le chromatogramme :
Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps de la
concentration instantanée du soluté en sortie de colonne. Le temps (ou très rarement le
volume d’élution) est porté en abscisse et l’intensité du signal de détection en ordonnée.
La ligne de base correspond au tracé obtenu en l’absence de composé élué. La séparation
est complète quand le chromatogramme présente autant de pics chromatographiques qu’il y
a de composés dans le mélange à analyser.
Figure 6 : Dispersion d’un soluté dans une colonne et traduction sur le chromatogramme.
Le chromatogramme est utilisé à la fois en analyse quantitative et qualitative. Les positions

des pics sur l’axe des temps permettent d’identifier les constituants de l’échantillon tandis
que les aires sous les pics mesurent leurs quantités.
1.1. Pics d’élution gaussiens :
Un pic d’élution idéal, sur un chromatogramme, a le même aspect
que la représentation graphique de la courbe de Gauss (loi Normale
de distribution des erreurs aléatoires), avec la fonction suivante :
Figure 7 : Comparaison entre un

chromatogramme réel et des pics
gaussiens
Cette fonction caractérise une courbe paire (maximum pour x = 0, y = 0,399) qui possède
deux points d’inflexion pour x = ±1 (figure 8), dont l’ordonnée est de 0,242 (soit 60,6 % de
la valeur du maximum) et dont la largeur aux points d’inflexion est égale à 2σ, (σ = 1) :

Figure 8 : Caractéristiques d’un chromatogramme idéal (allure d’un pic gaussien)
En chromatographie, δ désigne la largeur à mi-hauteur (δ = 2,35 σ) et σ2 la variance du pic.

La largeur « à la base » du pic, appelée ω est mesurée à 13,5 % de la hauteur, point où, la
courbe étant gaussienne, on a ω = 4σ par définition.
Largeur ω : on trace les tangentes aux points
d’inflexion des deux flans du pic. Le triangle formé
avec la ligne de base est environ égal à 96% de
l’aire totale du pic (2 σ (écarts‐types)). La largeur
ω à la base du pic est mesurée à la base du triangle.
1.2. Asymétrie des pics chromatographiques :
Les chromatogrammes réels sont quelquefois loin de présenter des pics d’aspect gaussien.
Il y a plusieurs raisons à cela (figure 9).
✓ En particulier il se produit une irrégularité de concentration dans la zone de dépôt de
la substance en tête de colonne.
✓ De plus, la vitesse de la phase mobile est nulle au niveau de la paroi et maximum au
centre de la colonne.
L’asymétrie observée d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur d’asymétrie
(Fa) et facteur de traînée (Ft ), mesurés à 10 % de sa hauteur :
Figure 9 : isothermes de distribution

2. Grandeurs de rétention :
2.1. Temps de rétention :
Un constituant est caractérisé par son temps de rétention tR, temps écoulé entre l’instant de
l’injection et celui déterminé au maximum du pic lui correspondant sur le chromatogramme.
Le temps de rétention est indépendant :
✓ De la quantité injectée,
✓ De la nature et de l’abondance des autres constituants dans le mélange.
Par contre il dépend :
✓ De la masse de phase stationnaire dans la colonne,
✓ Du débit de la phase mobile,
✓ Du volume mort du chromatographe (injecteur, détecteur, canalisations...),
✓ De la nature de la phase stationnaire.
2.2. Temps mort :
Un constituant non retenu sort de la colonne au temps tM, appelé temps mort (désigné
également par t0).
2.3. Le temps de rétention corrigé ou réduit t’R :
Il est obtenu par différence entre le temps de rétention réel et le temps
mort. Il est lié uniquement au phénomène de rétention proprement dit.
Figure 10 : temps de rétention d’un composé élué
A partir des temps de rétentions on peut calculer :

2.4. La vitesse linéaire moyenne de déplacement du soluté :
2.5. La vitesse linéaire moyenne des molécules de la phase mobile :
2.6. Le volume de rétention :

Le volume de rétention de chaque soluté représente le volume de la phase mobile nécessaire
pour le faire migrer d’une extrémité à l’autre de la colonne. Ce volume correspond sur le
chromatogramme au volume de la phase mobile qui s’est écoulé entre

l’instant de l’injection et celui correspondant au maximum du pic. Si D est
le débit alors :
On peut également calculer le volume mort correspondant au volume de
la phase mobile dans la colonne (volume interstitiel) :
Il peut être calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non
retenu par la phase stationnaire.
2.7. Volume de la phase stationnaire :
Ce volume désigné par VS n’apparaît pas sur le chromatogramme. Dans les cas simples on
le calcule en retranchant du volume total interne de la colonne vide le volume de la phase
mobile.
2.8. Facteur de rétention ou facteur de capacité k’ :
Quand on introduit un composé dans la colonne, sa masse totale m T se répartit en deux
quantités mM dans la phase mobile et mS dans la phase stationnaire. Ces quantités restent
constantes au cours de sa migration dans la colonne. Leur rapport est fixe et est appelé
facteur de rétention :
Avec Vs : volume de la phase stationnaire qui est calculé

par différence entre le volume total de la colonne et le
volume de la phase mobile (VM).
k’ n’est pas une constante mais varie avec les conditions
opératoires (température, composition de la phase
mobile…). C’est le paramètre le plus important en
chromatographie pour définir le comportement d’une
colonne. On évite d’avoir des valeurs de k’ trop élevées
pour ne pas allonger le temps d’analyse (entre 2 et 10).
Figure 11 : volumes des
phases stationnaire et mobile.
Détermination expérimentale de k’ :
k’ peut se déterminer directement à partir du chromatogramme. On montre que :
tR : temps de retention du solute

tM : temps mort

La vitesse de déplacement du soluté dans la phase

mobile est liée à la vitesse de la phase mobile que
multiplie un facteur de rétention (fraction de temps
passé dans la phase mobile) :
Cette relation est également souvent rencontrée

sous la forme :
3. Facteur de sélectivité
Le facteur de sélectivité α décrit la position de deux pics adjacents 1 et 2 situés sur un
chromatogramme. Il correspond au rapport des facteurs de rétention de la colonne pour les
deux composés. Il définit si la séparation est chimiquement possible :
ou
α est toujours supérieur à 1
4. La résolution (RS ou R) :
La résolution R d’une colonne donne la mesure quantitative de son aptitude à séparer deux
solutés. Elle est définie par :
[𝑡𝑅(2) − 𝑡𝑅(1)] [𝑡𝑅(2) − 𝑡𝑅(1) ]

𝑅𝑆 = 2 𝑅𝑆 = 1,18
𝜔1 + 𝜔2 𝛿1 + 𝛿2
Pour une résolution de 1, le pic du soluté 1 contient environ 4% du soluté 2 et le pic de 2

environ 4% de 1. Pour une résolution de 1,5 le chevauchement est d’environ 0.3%.

Figure 12 : Résolution de
deux solutés.
On établit facilement l’équation qui lie la résolution d’une colonne et le nombre de ces
plateaux théoriques ainsi que les facteurs de capacité et de sélectivité de deux solutés sur la
colonne :
Equation de PURNELL
Et aussi :
On peut aussi faire sortir le nombre de plateau théorique et le temps de rétention du composé
B (le plus retenu) :
5. Efficacité d’une colonne

L’efficacité d’une colonne chromatographique s’évalue généralement soit à partir de la
HEPT soit à partir du nombre de plateaux théoriques N.
L’efficacité d’une colonne est liée à la largeur des pics et on définit cette efficacité comme
étant la variance par unité de longueur de colonne soit :
On peut déterminer la H ou N graphiquement :

Démonstration :
5.1.1 Efficacité réelle d’une colonne (N efficace) :

N et H sont deux paramètres utilisés dans la littérature et par les fabricants d’appareils pour
évaluer les performances d’une colonne. Ils sont donnés pour un soluté défini dans les
conditions définies.
Lorsque l’on veut comparer les performances de deux colonnes de conception différentes,
il est préférable de remplacer tR par le temps réduit t’R qui ne tient pas compte du temps mort
tM passé pour tout composé dans la phase mobile. Les expressions deviennent :

IV. Optimisation de la séparation
Pour améliorer la résolution, il faut soit allonger la longueur de la colonne pour avoir un
nombre de plateaux théoriques plus grand, soit changer les conditions opératoires de
l’analyse (phase stationnaire, température, phase mobile…).
Si on allonge la longueur de la colonne, le temps d’analyse va augmenter, ce qui constitue
un inconvénient dans certains cas d’analyse.
Exemple pratique :
Figure 13 : Effet de la longueur

de la colonne sur la résolution.
Toute séparation est donc un compromis entre une bonne résolution et un temps de
séparation raisonnable :
1 = Partie cinétique
2 = Partie thermodynamique (Sélectivité)
3 = Partie thermodynamique (rétention)
Ces deux équations guident le choix des conditions qui conduisent au degré de résolution
souhaité en un minimum de temps. Chacune d’entre elles contient trois termes : le premier
lie l’efficacité de la colonne à √𝑁 ou H. le deuxième, le quotient qui contient α, est un terme
de séparation qui dépend des propriétés des deux solutés. Le troisième, le terme de capacité,
est un quotient qui contient 𝑘𝐵′ : ce paramètre dépend à la fois des propriétés du soluté et de
la colonne.

1. Rôle du facteur de capacité k’(3)

Le facteur de capacité doit être compris entre 1 et 10 pour que son influence soit importante
sur la résolution.
Figure 14 : Effet du facteur de capacité k’ sur la

résolution RS et sur le temps de rétention tr
On sait que :
✓ k’ faible: composés peu retenu.
✓ k’ fort: composés très retenu.
kB’ :
✓ Optimal entre 1 et 5 (≈2)
✓ Très important (surtout en CPL)
✓ CPL : variations de la phase mobile
✓ CPG : variations de la T de la phase mobile.
2. Rôle de la sélectivité (2)

➢ La sélectivité doit être supérieure à 1.
➢ Très grande influence sur la qualité de la séparation.
➢ Si α ≈ 1, on n’aura jamais de séparation efficace, même avec un grand N et une valeur
optimale de k'.
Il faut donc augmenter α, tout en gardant k' entre 1 et 5 :
✓ Modification de la phase mobile (y compris des modifications de pH)
✓ Modification de la température (CG, CL [échange ionique])
✓ Modification de la composition de la phase stationnaire :
• Plusieurs colonnes
• Modifications chimiques de la phase stationnaire.
• Augmentation de la polarité de la phase mobile (phase stationnaire = apolaire)

Exemple pratique :
Figure 15 : Effet de modification

de solvant sur le chromatogramme
3. Rôle de l'efficacité de la colonne N (ou H) (1)

Il faut examiner le rôle de la cinétique des échanges à travers H (hauteur équivalent d’un
plateau théorique ; van Deemter).
➢ Pour réduire la largeur du chromatogramme w (H) :
Tous les phénomènes précédents entraînent ainsi des retards pour l’établissement des
équilibres et ceci d’une manière d’autant plus accentuée que le débit de la phase mobile
est plus rapide.
Pour atténuer ces facteurs de résistance, il y a lieu de diminuer les distances à parcourir dans
chaque phase en réduisant le diamètre des particules, l’épaisseur de la phase stationnaire et
en utilisant une colonne régulièrement remplie et bien tassée.
De même, en CG on peut diminuer la température afin de réduire le coefficient de diffusion
(pas très utile en CL puisque DM est déjà trop petit).
Figure 16 : Effet du diamètre des

particules sur la hauteur équivalente
à un plateau théorique

Aspects Théoriques de La Chromatographie BSSH

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Aspects Théoriques de La Chromatographie BSSH

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

ASPECTS THEORIQUES DE LA

UNIVERSITE MOULOUD MAMMERI DE TIZIOUZOU

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 1 sur 24

4. Classification des méthodes chromatographiques :

4.1. Classifications selon les procédés utilisés : (classification générale)

La combinaison de ces possibilités conduit à diverses possibilités :

➢ Chromatographie gaz—solide (GSC ou GC)

❖ Chromatographie en phase supercritique (SFC)

La variation de la concentration de soluté adsorbé en fonction de sa concentration dans

Cads = concentration du soluté par gramme d’adsorbant

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 3 sur 24

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 4 sur 24

5. Principe de la séparation en chromatographique :

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 5 sur 24

6. Mise en œuvre pratique de la chromatographie sur colonne :

Figure 1 : L’expérience de base en chromatographie.

Figure 2 : schéma d’un système chromatographique

Chaque séparation effectuée donne lieu à un enregistrement particulier appelé

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 6 sur 24

II. Etude théorique de la chromatographie.

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 7 sur 24

2.1. Théorie des plateaux :

Figure 3 : illustration de la théorie des plateaux

K est le coefficient de partition d’une substance entre la phase stationnaire et la phase

2.1.1 Hauteur équivalente à un plateau théorique :

La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT ou H) vaut donc :

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 9 sur 24

Quand au chromatogramme (figure 4),

2.1.3 Avantages et inconvénients de la théorie des plateaux :

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 10 sur 24

2.2. Théorie cinétique :

2.2.2 Termes d’équation de Van Deemter :

2ème terme B : diffusion longitudinale :

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 12 sur 24

Pour que f’(u) = 0 il faut que :

Dans ce cas, la hauteur efficace d’un plateau théorique est :

Figure 5 : courbe de Van Deemter

✓ Pour u > uo l’augmentation du débit provoque une augmentation de la HEPT. Les

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 13 sur 24

✓ Hauteur de plateau réduite :

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 14 sur 24

III. Les grandeurs fondamentales de la chromatographie

Le chromatogramme est utilisé à la fois en analyse quantitative et qualitative. Les positions

Figure 7 : Comparaison entre un

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 15 sur 24

Figure 8 : Caractéristiques d’un chromatogramme idéal (allure d’un pic gaussien)

En chromatographie, δ désigne la largeur à mi-hauteur (δ = 2,35 σ) et σ2 la variance du pic.

Figure 9 : isothermes de distribution

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 16 sur 24

Figure 10 : temps de rétention d’un composé élué

A partir des temps de rétentions on peut calculer :

2.5. La vitesse linéaire moyenne des molécules de la phase mobile :

2.6. Le volume de rétention :

chromatogramme au volume de la phase mobile qui s’est écoulé entre

Avec Vs : volume de la phase stationnaire qui est calculé

tR : temps de retention du solute

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 18 sur 24

La vitesse de déplacement du soluté dans la phase

Cette relation est également souvent rencontrée

α est toujours supérieur à 1

[𝑡𝑅(2) − 𝑡𝑅(1)] [𝑡𝑅(2) − 𝑡𝑅(1) ]

Pour une résolution de 1, le pic du soluté 1 contient environ 4% du soluté 2 et le pic de 2

UMM Tiziouzou-Faculté de Médecine-Département de Pharmacie-Laboratoire de Chimie analytique Page 19 sur 24

5. Efficacité d’une colonne