Cours D'analyse Instrumentale

Cours de Chimie Analytique
Approfondie (Séparation)
Troisième Graduat en Pharmacie
2023-2024
Par Dr. Ph. Lucien MURHULA NAMEGABE
LMN Cours d'analyse 1

instrumentale
PLAN
CHAPITRE 1 • CHROMATOGRAPHIE, ASPECTS GÉNÉRAUX
CHAPITRE 2 • CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE
CHAPITRE 3 • CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
CHAPITRE 4 • CHROMATOGRAPHIE IONIQUE
CHAPITRE 5 • CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE
CHAPITRE 6 • CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE
CHAPITRE 7 • CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION STÉRIQUE
CHAPITRE 8 • ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE

instrumentale
CHAP I CHROMATOGRAPHIE, ASPECTS GÉNÉRAUX
Plan
q Généralités
q Classification des chromatographies
q Appareillage
q Grandeurs de rétention
q Facteurs de séparation
q Théories de la chromatographie

instrumentale
Généralités
Ø Technique de séparation de substances (solutions, gaz)
utilisée à des fins d’analyse qualitative et/ou quantitative.
Ø Supports variés (phases)
Ø 1906 : un chimiste russe, Mikhail Tswett, sépare des
pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de
carbonate de calcium pulvérulent, les pigments sont
entraînés avec de l'éther de pétrole

instrumentale
Généralités
Ø 1940 : Martin et Synge développent la pratique

et la théorie de la chromatographie, ils
obtiennent le prix Nobel en 1952
Ø 1952: mise au point de la Chromatographie en

Phase Gazeuse (CPG)
Ø 1968 : mise au point de la Chromatographie

Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en
anglais
Ø 1979 : première séparation chirale par HPLC

instrumentale
Généralités
Chiffres d’affaires mondial de l’instrumentation d’analyse moléculaire
chiffre d'affaire mondial de l'instrumentation

d'analyse moléculaire
autres méthodes chromatographie

18% liquide
LIMS 23%
4%
chromatographie
spectrométrie UV- gazeuse
VIS
18%
10%
spectrométrie de
infrarouge masse
12%
15%

instrumentale
Généralités
La chromatographie
q méthode de séparation des constituants présents des mélanges variés
q Elle sert en analyse pour identifier et quantifier des composés.
q Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui
q apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases
non miscibles.
q L’une, dite stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur
un support et l’autre, dite mobile, se déplace au contact de la première.

instrumentale
Généralités
q Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entrainés à
des vitesses différentes, provoquant leur séparation.
q Ce procédé́ hydrodynamique a donné naissance à une méthode
analytique instrumentale qui a un très grand domaine d’applicabilité
et par suite se trouve très répandue.
q Aucun laboratoire analysant des composés moléculaires ne peut
ignorer la chromatographie.

instrumentale
Généralités
Chromatographie d’élution sur colonne

instrumentale
Généralités

0
instrumentale
Généralités
éluant
Bande initiale avec

les composés A et
B
PS tassée dans la
colonne + PM
disque poreux
B A
éluat
Temps t
Séparation tr2-tr1
LMN
Largeur Cours
de pic Wb1,2 d'analyse 1
7
1
instrumentale
Généralités
q L’identification d’un composé par chromatographie correspond à

une méthode comparative.
q Pour identifier un composé, dont on ne sait s’il s’agit de A ou de
B, par la méthode chromatographique, on compare son temps de
migration à ceux des deux composés de référence A et B,
q ceci, sans changer d’appareillage et en se plaçant dans les
mêmes conditions expérimentales.

2
instrumentale
Généralités
Méthode de séparation des constituants d’un

mélange reposant sur les équilibres de
concentration qui apparaissent lorsqu’un composé
est mis en présence de deux phases non miscibles

3
instrumentale
Généralités
q Phase stationnaire (PS) : immobilisée

dans une colonne ou fixée sur un support
plan(ccm)
q Phase mobile (PM) : se déplaçant au

contact de la première
q Elution : processus par lequel un

composé est entraîné par le mouvement
de la phase mobile à travers la phase
stationnaire
4
instrumentale
Généralités
Vitesse de la PM dans la colonne exprimée :
Ø en débit,D : volume de solvant traversant la

colonne par unité de temps (mL/min)
Ø en vitesse linéaire,u : distance parcourue dans la

colonne par unité de temps (cm/min)

5
instrumentale
Généralités
Chromatogramme :
tracé des variations de composition de la phase
éluée au cours du temps
signal
Temps (min)

instrumentale
Chromatogramme
q Le temps (ou très rarement le

volume d’élution) est porté en
abscisse et l’intensité du signal de
détection en ordonnée.
q La ligne de base correspond au
tracé obtenu en l’absence de
composé élué.
q La séparation est complète quand le
chromatogramme présente autant
de pics chromatographiques
revenant à la ligne de base qu’il y a
de composés dans le mélange à
analyser.

instrumentale
Chromatogramme
q Un constituant est caractérisé par son temps de rétention tR,

qui représente le temps écoulé́ entre l’instant de l’injection
et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum
du pic qui lui est lié.
q Dans le cas idéal tR est indépendant de la quantité́ injectée.
q Un constituant non retenu sort de la colonne au temps tM,
appelé́ temps mort (1) (désigné également par t0).
q La différence entre le temps de rétention et le temps mort est
désignée par le temps de rétention réduit du composé tR′ .

instrumentale
Classification des chromatographies
ü Selon le phénomène physique responsable

des échanges entre PS et PM :
§ adsorption
§ partage
§ échange d’ions
§ exclusion
§ affinité
ü Selon la nature physique de la phase mobile
§ liquide
§ Gaz
§ supercritique
ü Selon l’objectif visé :
§ chromatographie analytique
§ chromatographie préparative

instrumentale
Classification des chromatographies

instrumentale
instrumentale
Appareillage
Éluant liquide ou
gazeux (PM)
régulateur
Sortie de
de pression injecteur colonne (PS) détecteur l’éluat
débimètres
Entrée de
l’échantillon traitement
Traitement
dusignal
du signal
signal
temps
temps

instrumentale
Grandeurs de rétention
q Temps de rétention
q Volume de rétention
q Coefficient de
distribution
q Facteur de rétention
instrumentale
Temps de rétention: tR
temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui
qui correspond sur le chromatogramme au
maximum du pic qui lui est lié

instrumentale
Temps de rétention réduit : tR’

tR’= tR – tM
tM ou t0 : temps mort : temps nécessaire pour
qu’un composé non retenu traverse la colonne
Volume de rétention VR ou volume d’élution :
Volume de phase mobile nécessaire pour faire

migrer un composé d’un bout à l’autre de la
colonne
VR = tR . D
D : débit de la phase mobile (constant)

6
instrumentale
Coefficient de distribution: KA
rétention
K = [A ]
PS
APM APS
élution
A
[A ]
PM
KA
ü rapport entre la concentration du composé
dans la phase stationnaire et la
concentration du composé dans la phase
mobile
ü traduit l’importance relative des forces
intermoléculaires qui existent entre le
composé et les LMN
2 phases
Cours d'analyse 2
7
instrumentale
Facteur de rétention k’ ou k (ou de capacité) :
Le facteur de rétention mesure le temps qu'un composant de l'échantillon
passe dans la phase stationnaire par rapport au temps qu'il passe dans la
phase mobile.
t '
k' = R
t M
ü Rend compte de la faculté +/- grande de la colonne à retenir un composé

ü Indépendant du débit de la PM et des dimensions de la colonne
ü k’ est accessible à partir du chromatogramme
Il est calculé en divisant le temps de rétention par le temps d'un pic non retenu
(t0).
Paramètres ayant un effet sur le facteur de rétention : PS; PM; Pente du gradient;
Volume résident du système*
*gradient d'élution uniquement

8
instrumentale
Grandeurs de rétention Grandeurs de rétention
tG × F
k =
`
S × DF ×Vm
L'équation montre l'influence du débit (F), de la durée du gradient (tG),

de la plage de gradient (ΔΦ) et du volume de la colonne (Vm) sur le facteur
de rétention.
Rappel : pour que le facteur de rétention reste constant, des

modifications apportées au dénominateur doivent être compensées par
des modifications proportionnelles du numérateur, et inversement.
*gradient d'élution uniquement

9
instrumentale
ü tR = tM + tR’
ü Si composé non retenu par la PS :
tR = tM= tPM : temps passé dans la PM
Þ tR’= tPS: temps passé dans la PS
si mT = mPM + mPS
k =
'
t
=
(m)
'
=R
[A] .V
A
=K .
PS
V PS PS PS
tA
(m ) [A] .V
M A PM
V PM PM
A
PM
ü k’ est indépendant de mT

0
instrumentale
β=V PM
V t '
V K
k' = = K.
PS
=
R PS
t M
V β PM
En chromatographie capillaire ( GC) :

ü β est très élevé ® tR réduits
ü on peut prévoir le comportement des colonnes grâce
à ce facteur β : pour un composé et une PS donnés,
k’ diminue quand β augmente

1
instrumentale
Facteur de rétention k’ et tR :
tR = tM ( 1 + k’ )
tR = tM( 1 + K / β)
⇒ permet de calculer le coefficient de distribution
En pratique, k’ ne peut pas dépasser 10

k’ < 1: le composé sort trop tôt
k’ ≈ 2-5 : correct

2
instrumentale
Facteurs de séparation
Sélectivité ou facteur de sélectivité

ü La sélectivité α correspond à une mesure du temps ou de la distance entre
les maxima de 2 pics. Elle se définit comme le rapport entre facteurs de
capacité et est l’aptitude d’un système chromatographique à séparer 2
composés, .
ü permet de préciser les positions relatives de 2 pics sur 1 chromatogramme :
α=
KB k'
α= B α = (t'R )B
KA k' A (t'R )A
ü α est toujours >1. Si α = 1, les 2 pics ont même Tr et co-éluent.
Paramètres ayant un effet sur le facteur de rétention :

• Phase stationnaire
• Phase mobile
• Température

3
instrumentale
Facteurs de séparation Facteurs de séparation
Résolution ou facteur de résolution
Aptitude d’un système chromatographique à séparer 2 produits
La résolution traduit la qualité de séparation de 2 pics voisins.
Deux facteurs contribuent à une bonne séparation par

chromatographie :
ü la différence entre les temps de rétention
ü la largeur des pics
La résolution indique s'il y a
eu séparation à la ligne de
base ou non.
Pour deux molécules A et B :
DtR
t (B) - t (A)
R = R R
signal
S
1
(w (B) + w (A))
2 b b
W b= 4 s
Wb (A) Wb (B)
tR(A) tR (B) temps

5
instrumentale

Normalement, des pics voisins ont des s pratiquement
identiques.
On trouve alors que :
Δ tR
RS =
4σ

6
instrumentale
RS = 1 si DtR = 4σ
Une résolution de 1.5 est nécessaire pour une analyse
quantitative (D tR = 6σ)
2σ
3σ
Résolution = 0.50 Résolution = 0.75
signal
4σ 6σ
Résolution = 1
Résolution = 1.5
signal
temps temps

7
instrumentale
Facteurs de séparation Facteurs de séparation
q La résolution intègre l'efficacité (N), la sélectivité (a) et la rétention

(k).
q Une valeur minimum de 1 est nécessaire pour permettre une séparation
q mesurable et une quantification adéquate.
q Une valeur de 0,6 est nécessaire pour distinguer une vallée entre deux
pics de hauteur égale.
q Des valeurs égales ou supérieures à 1,7 sont souhaitables pour des
méthodes
q robustes.
q Une valeur de 1,6 est considérée comme permettant la séparation de la
ligne de base et garantit les résultats quantitatifs les plus précis.

8
instrumentale
Capacité de pics
Analyses en gradient
h = f (w 2 ) La hauteur réduite d'un plateau théorique comme facteur de la

largeur de pic
q Analyse isocratique :
q La largeur de pic dépend uniquement des processus de diffusion.
q Analyse avec gradient :

q La largeur de pic dépend des processus de diffusion et de la focalisation
q du gradient à la tête de la colonne.

9
instrumentale
Capacité de pics
Définition
l La capacité de pics correspond au nombre de pics (n)

pouvant être séparés dans un temps donné avec une
résolution donnée.
l La capacité de pics dépend de différents facteurs tels que la
longueur de colonne et la granulométrie.

0
instrumentale
Capacité de pics
Formule de calcul
tG tG
P =1 =1 + wmoy Largeur de pic moyenne
1 n
w av
+ å
n 1
w n
tG
Nombre de pics
Durée du gradient
w Largeur de pic du pic sélectionné
tG
Forme simplifiée :
P =1 +
w

1
instrumentale
Capacité de pics
Largeur de pic
Largeur de pic à mi-hauteur
temps
Largeur de pic à 5 % de la
hauteur Largeur de pic à 4,4 %
de la hauteur (5σ)
LMN
Largeur de pic selon la méthode Cours d'analyse 4
des tangentes 2
instrumentale
Capacité de pics
Exemple
mAU
Colonne : 2,1 x 150 mm, 1,8 µm

Contrepression : 402 bars
60
Capacité de pics : 313
40
20
10 20 30 40 50 min
mAU
Colonne : 2,1 x 300 mm*, 1,8 µm
50 Contrepression : 598 bars
Capacité de pics : 406
40
*colonne de 300 mm par assemblage de deux colonnes de 150 mm

30
20
10
20 40 60 80 100 min
3
instrumentale
Théories de la chromatographie
Modèle des plateaux
Un plateau théorique est un stade hypothétique pendant lequel les deux phases d'une
substance (phases liquide
et vapeur) sont en équilibre.
l déplacement du soluté dans la colonne Instant I-1 Instant I
en une suite d’étapes distinctes
l à chaque étape: APM APS
l colonne de chromatographie = série de

compartiments distincts ou « plateaux
théoriques » dans lesquels s’établit
l’équilibre de répartition du soluté
l chromatographie = suite de temps

d’équilibration suivis de glissements de
la PM d’un plateau par rapport à la PS

4
instrumentale
Ø Un soluté se déplaçant
dans une colonne
donne un signal
d’allure gaussienne au
moment de sa sortie
au niveau du détecteur
q s : écart-type
q w1/2 ou d = 2.35 s :
largeur à mi-hauteur
q w ou wb : largeur à la
base = 4 s

5
instrumentale
La colonne de longueur L est découpée en N petits

disques fictifs ou « plateaux théoriques » de même
hauteur H :
L
N =
H
N = nombre de plateaux théoriques
Ø L en cm
→ H en cm

6
instrumentale
colonne
départ
Profil de concentration
sl 2 = H.l
H : coefficient de proportionnalité entre la variance de la bande et la longueur parcourue
H : HEPT = hauteur équivalente à un plateau théorique
2
σ l : longueur parcourue
H= l
l Temps t
Séparation tr2-tr1
LMNdeCours
Largeur pic Wb1,2d'analyse 4
43
7
instrumentale
Ø σ2 en cm2 σ
2
Ø l en cm H l
= l
→ H en cm
Valeurs de H:
§ 0.1 à 1 mm en GC
§ ~ 10 μm en HPLC

8
instrumentale
σ 2
H= L
2
L L L.L L t2
N = = = R
2 σ 2 σ2
= H σ
L L
Conc.dans la colonne
éluant chromatogramme
signal
L
l σl
détecteur tR temps

9
instrumentale
N = mesure de l’efficacité d’une colonne (plateaux théoriques)
si H ↓→ largeur de bande ↓ → séparation ↑
t
2
t 2
L t2 16 t 2 N= R
N = 5.55 R
N = R
= R
w
2
w 2
H 2 w2 16 b 1/2
= Car σ=W σ
b/4 b
N est mesurable sur un chromatogramme
ü Si N est constant, la largeur d’un pic chromatographique augmente quand le temps de

rétention augmente
q N utilisée pour comparer la performance de différentes colonnes.

q Les colonnes ayant un nombre élevé de plateaux sont + efficaces.
Une colonne ayant un nombre N élevé a un pic plus étroit à un temps
de rétention donné qu'une colonne ayant un nombre N inférieur.
q Paramètres ayant un effet sur l'efficacité de la colonne :
q Longueur de colonne (une colonne plus longue est plus efficace)
q Granulométrie (une baisse de la granulométrie accroît l'efficacité)
0
instrumentale
Modèle cinétique
A: diffusion turbulente ou diffusion de Eddy :

terme dû aux multiples veines d’écoulement :
A= λ.dp
λ : facteur de remplissage de la colonne (qualité du remplissage)

dp : diamètre des grains

1
instrumentale
Modèle cinétique
Diffusion de Eddy (diffusion turbulente)
wturb ~ λ dp temps
λ : Qualité du remplissage de colonne
Variation des trajectoires de diffusion due à la qualité du remplissage
Trajectoires différentes Mauvais remplissage Distribution large de la taille des

LMN Cours d'analyse
de la colonne particules 5
49
2
instrumentale
Optimisation d’une analyse chromatographique
But : obtenir le degré de résolution souhaité en un minimum de temps
1 α k' b
-1=
R Nb *
1+ k' b
*
4 α
æ a -1ö æ k ö
Rs = 1 N ç ÷ ç ÷
è a ø
• •
Equation fondamentale de l’(U) HPLC
4 è1+ k ø
Efficacité Sélectivité Rétention

q augmenter N
q modifier k’
q augmenter α
• Le paramètre qui a la plus + influence sur Rs est la sélectivité. De petites variations de la sélectivité ont
un gros impact sur Rs.
• L'influence de la rétention n'est significative qu'à des valeurs k faibles.
• L'efficacité décrit le pouvoir de séparation de la colonne.
3
instrumentale
4
instrumentale
5
instrumentale
AKSANTI

6
instrumentale

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CHAPITRE 1 • CHROMATOGRAPHIE, ASPECTS GÉNÉRAUX

CHAPITRE 2 • CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE

CHAPITRE 3 • CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

CHAPITRE 4 • CHROMATOGRAPHIE IONIQUE

CHAPITRE 5 • CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE

CHAPITRE 6 • CHROMATOGRAPHIE EN PHASE SUPERCRITIQUE

CHAPITRE 7 • CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION STÉRIQUE

CHAPITRE 8 • ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE

LMN Cours d'analyse 2

LMN Cours d'analyse 3

LMN Cours d'analyse 4

Ø 1940 : Martin et Synge développent la pratique

Ø 1952: mise au point de la Chromatographie en

Ø 1968 : mise au point de la Chromatographie

Ø 1979 : première séparation chirale par HPLC

LMN Cours d'analyse 5

chiffre d'affaire mondial de l'instrumentation

autres méthodes chromatographie

LMN Cours d'analyse 6

q méthode de séparation des constituants présents des mélanges variés

q Elle sert en analyse pour identifier et quantifier des composés.

q Le principe de base repose sur les équilibres de concentration qui

q apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence de deux phases

un support et l’autre, dite mobile, se déplace au contact de la première.

q Si plusieurs composés sont présents, ils se trouvent entrainés à

des vitesses différentes, provoquant leur séparation.

q Ce procédé́ hydrodynamique a donné naissance à une méthode

analytique instrumentale qui a un très grand domaine d’applicabilité

et par suite se trouve très répandue.

q Aucun laboratoire analysant des composés moléculaires ne peut

LMN Cours d'analyse 8

Chromatographie d’élution sur colonne

LMN Cours d'analyse 9

LMN Cours d'analyse 1

Bande initiale avec

q L’identification d’un composé par chromatographie correspond à

LMN Cours d'analyse 1

Méthode de séparation des constituants d’un

LMN Cours d'analyse 1

q Phase stationnaire (PS) : immobilisée

q Phase mobile (PM) : se déplaçant au

q Elution : processus par lequel un

Vitesse de la PM dans la colonne exprimée :

Ø en débit,D : volume de solvant traversant la

Ø en vitesse linéaire,u : distance parcourue dans la

LMN Cours d'analyse 1

LMN Cours d'analyse 16

q Le temps (ou très rarement le

LMN Cours d'analyse 17

q Un constituant est caractérisé par son temps de rétention tR,

LMN Cours d'analyse 18

ü Selon le phénomène physique responsable

LMN Cours d'analyse 19

LMN Cours d'analyse 20

LMN Cours d'analyse 22

LMN Cours d'analyse 24

Temps de rétention réduit : tR’

Volume de rétention VR ou volume d’élution :

Volume de phase mobile nécessaire pour faire

D : débit de la phase mobile (constant)