Vitro cultures

SAGGAÏ Mohamed Mounir

 Programme
CHAPITRE I : METHODOLOGIES GENERALES
1.1. Description d'un laboratoire des CIV
1.2. Récipients et instruments
1.3. Conditions d'asepsie
CHAPITRE II : MILIEUX DE CULTURE
2.1. Support
2.2. Milieu minéral
2.2.1. Macro éléments
2.2.2. Micro éléments
2.3. Composés organiques
2.3.1. Sucres
2.3.2. Vitamines
2.3.3. Autres
2.4. Régulateurs de croissance et leurs rôles
2.4.1. Auxines et antiauxines
2.4.2. Cytokinines
2.4.3. Gibbérellines
2.4.4. Autres
2.4.5. Choix de la balance hormonale
2.5. Facteurs physiques de l'environnement
2.5.1. pH du milieu
2.5.2. Température
2.5.3. Lumière
2.5.4. Récipients
CHAPITRE III -: APPLICATION DES CULTURES IN VITRO
 3.1. Assainissement
 3.1.1 Culture de méristèmes
 3.1.2. Microgreffage
 3.1.3. Thermothérapie
 3.2. Etapes de développement in vitro et leurs exigences particulières
 3.2.1. Multiplication
 3.2.2. Elongation
 3.2.3. Enracinement
 3.2.4. Acclimatation

CHAPITRE IV. HAPLOMETHODES

 4.1. Haploïdes spontanés
 4.2. Haploïdes induits in situ
 4.3. Haploïdes induits in vitro
 4.4. Intérêts, Application et perspectives
Définition
La culture in vitro (aussi appelé micropropagation) est une
technique visant à régénérer une plante entière à partir de
cellules ou de tissus végétaux en milieu nutritif, en utilisant des
techniques modernes de culture cellulaires.
Elle permet de garder des plants stériles, exempts de virus et
autres infections en plus de pouvoir produire rapidement une
grande quantité de plantules. Elle est utilisée pour la création
de nouvelles plantes (par exemple des plants génétiquement
modifiés) ; pour la multiplication de plantes commerciales
produisant peu ou pas de graines ; ou encore pour la
conservation et la multiplication d’espèces rares.
En général, les plantes (en fait une seule ou quelques cellules
suffisent) sont placées sur un milieu de croissance stérile (qui
comprend du saccharose comme source d’énergie, des
vitamines et des nutriments) et dans un environnement à
température, taux d'humidité et luminosité contrôlés.
La culture in vitro ou culture de tissus se définit comme l'ensemble
des techniques qui permettent de faire croître en milieu artificiel
(en éprouvette) des cellules spécialisés, par
exemple des cellules animales comme la peau humaine ou des
cellules végétales, ce qui représente une grande variété de tissus.
Par opposition à la culture en terre ou dans des substrats imbibés
de solution nutritive, la culture in vitro se fait en laboratoire à l’abri
de toute contamination cryptogamique, dans des récipients qui
peuvent être tant des tubes à essai que des bocaux à conserve.
Ces récipients sont placés dans un endroit où l'intensité de la
lumière, la durée de l'illumination, la température et l'hygrométrie
sont constamment contrôlées.
Afin de mieux comprendre la culture in vitro des tissus végétaux, il
faut posséder quelques notions sur la reproduction des végétaux.
La reproduction chez les végétaux peut se faire de 2 manières :
- la multiplication sexuée, à l'aide d'échanges
génétiques :
gamètes mâles X gamètes femelles = graine
- la multiplication asexuée comme par bouturage
où un seul petit fragment de tige ou
de feuille peut redonner après développement,
une plante entière. C'est précisément
ce type de multiplication végétative qui est mis en
pratique dans la culture in vitro de
manière accéléré à l'abri de toutes
contaminations par des bactéries ou par des
champignons.
 La culture in vitro végétale est possible parce
que les cellules végétales présentent la potentialité de
reproduire des individus complets identiques à la
plante sur laquelle les cellules ont été prélevées. Cette
propriété a été baptisée «totipotence cellulaire». La
cellule animale présente aussi cette capacité mais à
un degré moindre. Toutes les cellules d'un même
organisme renferment dans leur noyau exactement les
mêmes chromosomes, l’information génétique pour
reconstruire l’organisme entier. Ce message héréditaire
représente toutes les potentialités de l'individu.
Cependant, à un moment donné de la vie
embryonnaire, un choix va se faire, dans un groupe de
cellules données, destiné à former un organe ayant
une forme et une fonction précise. Une grande partie
du message héréditaire va être mise en sommeil, dans
un autre groupe, destiné à une autre fonction,
c'est une autre partie du message qui sera occultée.
 Le développement à partir d'une
cellule simple va se faire par de
nombreuses divisions cellulaires (mitose) et
par le blocage ou le déblocage de
certains gènes, les cellules orienteront leur
développement vers une voie particulière
qui formera soit un tissu, soit un organe ou
autres éléments nécessaires à la future
plante.
Ce sont des inhibitions sélectives qui provoquent la
différenciation entre les cellules et leur spécialisation.
Toutes les cellules contiennent en puissance la
totalité de l'organisme, mais elles n'en expriment
qu'une partie. Cependant, contrairement aux
cellules humaines ou animales, certaines cellules
végétales ont le don de se déspécialiser et de
redevenir capables d'engendrer un organisme
entier. C'est précisément cette faculté que l'on
exploite dans la propagation in vitro de plusieurs
plantes. Les cellules végétales appartiennent à des
tissus très spécialisés qui possèdent la possibilité de se
déspécialiser, formation d'un CAL, et redevenir
capables d'engendrer une plante entière en
recommençant tout le processus de spécialisation
(blocage et déblocage).
 Afin de réaliser la culture in vitro de
tissus végétaux, il est important de respecter
les étapes de mêmes que les différentes
conditions nécessaires, le choix de l’explant
et le milieu de culture.
 Les explants
 L’explant est une petite partie ou fragment du
plante-mère, qui est mis en culture dans
l’éprouvette. L'état sanitaire de cette plante
conditionne la nature de l'explant.
- Si le plant-mère est malade, virosée, alors
il faudra prélever un explant constitué de
cellules méristématiques. Ce type d'explant est
appelé indifférencier.
- Si le plant-mère est en santé, alors
d'autres types d'explant pourront être prélevés,
c’est explants sont appelés différenciés.
 Cependant, il est important de noter que d'autres
facteurs vont conditionner les réactions de l'explant, l'âge
ou le stade physiologique du plant-mère, la structure, la
taille et l'emplacement de l'explant lui-même. En effet, des
explants différents prélevés sur une même plante donnent
des résultats différents sur un milieu identique.

L’explant peut être prélevé sur n'importe quelle partie du

plant-mère à condition de renfermer des tissus vivants et
de tenir compte de l’état du plant. Il y a plusieurs sortes
d'explants,

- Les explants indifférenciés sont prélevés à l’apex

de tige, de racine, de bourgeons, de nœuds

- Les explants différenciés sont prélevés sur la tige,

la feuille, la racine. Ces explants sont des structures
constituées de cellules très spécialisées qui devront se
déspécialiser avant de pouvoir régénérer la plante entière.
Le milieu de culture
Le milieu de culture est important pour la
croissance. Il est le plus souvent une solution
aqueuse rendue semi-solide ou moyen de
gélose (agar). Remplaçant le sol et suppléant la
plante, il doit contenir différents éléments. Très
généralement il est composé d’une base
comprenant des sucres (énergie), des éléments
minéraux divers, des régulateurs de croissance,
des vitamines (complexe B), des composés
organiques (acides aminés, polypeptides, …).
La concentration de ces composés peut varier
d'une espèce à l'autre, mais ces variations n'ont
qu'une incidence faible sur les réactions des
cellules. Les facteurs essentiels sont les
régulateurs de croissance qui stimuleront la
multiplication cellulaire et orienteront la
morphogenèse.
Dans le milieu de culture, on retrouve des
substances qui sont :
- soit endogènes, c’est-à-dire qu’elles sont
produits par la plante
- soit exogènes, c’est-à-dire des substances
de synthèse ou artificiel mais dont l'effet est similaire.

Les principales substances (régulateur de

croissance) utilisées pour la culture in vitro sont les
auxines, les cytokinines et les gibbérellines. Leurs
effets varient avec les concentrations utilisées et le
dosage, à doses élevés, ils peuvent se montrer
inhibiteurs ou toxiques.
 Dans la famille des auxines, on
retrouve l’acide indolyocétique (AIA) et les
substances de synthèse à action analogue
comme l'acide naphtylacétique (ANA),
l'acide indolybutyrique (AIB) ou l'acide 2,4
dichlorophénoxyacétique (2,4D). Ces
substances possèdent de nombreuses
propriétés.
- Activent la multiplication cellulaire
(mitose)
- Amènent la formation de racines
(rhizogénèse)
- Stimulent le métabolisme
Dans la famille des cytokinines, certaines sont
des composés endogènes comme la zéatine et
l'isopentényladénine (IPA), ou de synthèse
comme la benzyladénine (BA) ou la kinétine.
- Agissent en synergie avec les auxines
avec un effet stimulant sur le métabolisme
et sur la division cellulaire. Si de fortes
concentrations de cytokinines sont
combinées à des concentrations plus faibles
d'auxines, les cytokinines
- Agissent en synergie avec les auxines
- Activent la multiplication cellulaire
(mitose) avec la formation d'un cal
Dans la famille des Gibbérellines on
retrouve que des substances endogènes.
La plus utilisée est l'acide gibbérellique
(GA3). Les gibbérellines seront utiles dans les
cas ou seule la croissance est souhaitée.
- Stimulent l'élongation cellulaire et la
multiplication cellulaire
- Elles peuvent rendre les cellules plus
sensibles à l'action des auxines
 Labo de culture in vitro
Le laboratoire de culture in vitro est utilisé par les
chercheurs et les étudiants qui, pour leurs travaux,
ont besoin de mettre en culture du matériel
végétal en conditions aseptiques dans un
environnement contrôlé. On y retrouve donc
l’équipement nécessaire pour réaliser toutes les
étapes de la culture in vitro des végétaux:

 une salle de préparation des milieux de culture

(verrerie, récipients de culture, produits
chimiques, balances, pHmètre, four micro-
ondes, distributeur de milieux, plaques
chauffantes et agitatrices, etc.);
 une salle de transfert (hottes à flux laminaire,
loupes binoculaires, agitateur orbital, etc.);
 une salle de transfert (hottes à flux laminaire,
loupes binoculaires, agitateur orbital, etc.);
 cinq salles de culture avec étagères (avec
contrôle de la température et de la
photopériode).
Salle de culture
Salle d'inoculation et transfert
1 Le flaconnage
Plusieurs types de flaconnages peuvent être
utilisés pour les mises en culture.
Cependant, nous vous conseillons d’utiliser des
flacons avec bouchons à vis en bakélite. Ces
flacons sont troués en leur centre afin de
permettre la circulation d’air entre l’intérieur et
l’extérieur du flacon. Cette ouverture est
comblée de coton cardé dont le rôle est de
filtrer les contaminants de l’air qui pénètre dans
le flacon.

Si vous utilisez des flacons de 90 mL, la quantité

de gel par flacon sera d’environ 15 à 20 mL. Si
vous utilisez des flacons de 125 mL, la quantité
de gel sera d’environ 30 à 40 mL.
2 Les milieux
Les milieux de culture sont commercialisés sous
forme de poudres déshydratées prêtes à
l’emploi et sont proposés selon les quantités
suivantes :
􀀹 500 mL, permettent de préparer 25 flacons
de 90 mL (ou 12 flacons de 125 mL)
􀀹 1500 mL, permettent de préparer 75 flacons
de 90 mL (ou 37 flacons de 125 mL)
Ils sont conditionnés en flacons polypropylène
totalement étanches à l’eau et à l’air. Ils sont à
utiliser dans un délai de 4 mois suivant
réception. Conservés au réfrigérateur (ou
éventuellement au congélateur), cette durée
de conservation est prolongée de 4 autres mois.
Les doses doivent être utilisées en une seule fois
et ne peuvent pas être fractionnées.
La base du milieu est une base de MURASHIGE
et SKOOG (agar-agar et sels minéraux) enrichie
de phythormones. La composition des milieux
pour multiplication et enracinement diffère
principalement sur les concentrations des
phythormones et en particulier sur le rapport
des concentrations auxines/ cytokinines :
􀀹 Si ce rapport est inférieur à 1, le mode de
développement favorisé sera la multiplication
avec formation de nouveaux bourgeons
􀀹 Si ce rapport est proche de 1, le mode de
développement favorisé sera la callogénèse
􀀹 Si ce rapport est supérieur à 1, le mode de
développement favorisé sera la rhizogénèse et
donc l’enracinement.
Il est important de respecter les temps de
stérilisation préconisés ci après : en effet certaines
auxines étant d’origine végétale, elles se
détruisent progressivement avec les températures
élevées.
3 Stérilisation des milieux de culture
La stérilisation des produits qui contiennent de
l’eau ne peut être obtenue qu’en chaleur humide
et sous pression. La simple ébullition ne suffit pas :
les spores des bactéries et des moisissures résistent
à 100° C.

L’utilisation d’un autoclave permet d’obtenir en

atmosphère de vapeur d’eau des températures
de 120° C sous pression (0,5 à 1 bar). La stérilité est
obtenue en maintenant ces conditions pendant
20 minutes. C’est la vapeur d’eau sous pression
qui stérilise et l’eau à ébullition. Le flacon
contenant le gel nutritif à stériliser est placé dans
un panier au dessus de l’eau.
PREPARATION DES MILIEUX DE CULTURE
􀀹 Ouvrir le flacon contenant la poudre déshydratée.

􀀹 Verser le contenu du tube dans un récipient de taille suffisante pour obtenir une
bonne ébullition (1,5 litre pour une dose de 1200 mL, 1 litre pour une dose pour 400
mL, etc…)

􀀹 Faire dissoudre dans un bain-marie bouillant le milieu de culture jusqu’à fusion

complète en agitant de temps en temps.

􀀹 Répartir dans les flacons (en homogénéisant la solution régulièrement entre les
remplissages successifs) à raison de 15 à 40 mL de culture par flacon.

􀀹 Stériliser pendant 20 minutes à l’autoclave à 120° C ou 30 min à la marmite à

pression (à partir du sifflement de la soupape).

􀀹 A la fin de la stérilisation, laisser tomber la pression sans retirer la soupape (ce qui
ferait sauter les bouchons).

􀀹 Poser les flacons en position inclinée ou verticale selon les milieux à préparer et
attendre environ 3 heures afin qu’ils se gélifient (ne pas les toucher pendant qu’ils
refroidissent).
 4 Préparation du plan de travail
Précautions à prendre pour éviter les contaminations :
􀀹 Avant toute manipulation se laver les mains et les avant-bras ;

􀀹 Au moment de la manipulation, toutes les précautions sont prises pour

ne pas introduire de bactéries ou de moisissures dans le flacon ;

􀀹 Le plan de travail sera désinfecté à l’eau de javel ;

􀀹 Les manipulations se feront toujours près d’une flamme (bec Bunsen ou

lampe à alcool ou bec électrique adapté à la microbiologie) qui crée une
atmosphère stérile dans un rayon d’environ 15 cm ;

􀀹 Les plantes à cultiver doivent être désinfectées et manipulées avec des

instruments stériles ;

􀀹 Les flacons doivent être placés le plus près possible de la flamme (ou du
courant d’air chaud) et leur encolure doit être passée à la flamme (ou dans
le courant d’air très chaud d’un bec électrique) chaque fois qu’ils sont
ouverts ou fermés ;

􀀹 L’opérateur doit éviter les courants d’air et ne doit pas parler.

L’utilisation d’une hotte à flux laminaire, non indispensable,
facilite ces conditions.

Mise en place du matériel :

􀀹 Etendre sur le plan de travail du papier imbibé d’eau
de Javel.

􀀹 Placer au centre du plan de travail désinfecté le bec

Bunsen ou le bec électrique (avec si nécessaire
l’accessoire rehausseur adapté pour la microbiologie).

􀀹 A proximité du bec chauffant, placer une soucoupe ou

une boîte de Pétri stérile.

􀀹 Placer un verre ou une éprouvette contenant de l’eau

de Javel qui servira à mettre les instruments (pince, scalpel,
ciseaux…).
 5 Désinfection des plantes
Si vous ne disposez pas de plant désinfecté prêt à être
re-multiplié, il est indispensable de désinfecter la plante
que vous voulez repiquer.

Matériel nécessaire
􀀹 Liquide vaisselle
􀀹 Un bocal contenant une solution d’eau de Javel (1)
􀀹 4 bocaux d’eau distillée stérile(2)
􀀹 Une boîte de Pétri stérile (facultatif)
􀀹 Une spatule ou une pince stérile
􀀹 Un scalpel stérile ou une paire de ciseaux stériles
􀀹 Un flacon contenant de l’eau de Javel pour la
stérilisation des instruments
􀀹 Du papier de laboratoire, d’essuyage ou des
mouchoirs en papier.
Désinfection
􀀹 Prélever la partie de la plante que vous désirez mettre en culture (feuille pour le Saint-
Paulia).

􀀹 Rincer à l’eau du robinet afin d’ôter la terre et la poussière.

􀀹 Faire tremper dans l’eau de Javel, sur les trois-quarts de leur longueur, les instruments
pendant dix minutes et les placer sur le plan de travail en les couvrant de papier imbibé
d’eau de Javel, par exemple en retournant le bord du papier installé sur le plan de travail.

􀀹 Plonger l’explant environ 5 minutes dans un mouillant composé d’une goutte de liquide
vaisselle dans de l’eau.

􀀹 Désinfecter dans une solution de Javel (1) pendant 10 minutes.

􀀹 Le plan de travail aura été désinfecté au préalable (voir paragraphe précédent).

􀀹 Allumer le bec chauffant et à partir de ce moment, manipuler en conditions stériles, près

de la flamme ou du flux d’air chaud.

􀀹 Rincer par 4 bains successifs de 5 minutes chacun dans de l’eau distillée stérile.

􀀹 Sortir l’explant et le placer dans une boîte de Pétri stérile afin de le découper stérilement
à l’aide d’un scalpel.
(1) Préparation de la solution de « Javel » :
Diluer le berlingot de « Javel Plus » selon les
indications du fabricant et utiliser la solution telle
quelle. Si vous achetez une bouteille prête à
l’emploi, il n’est pas nécessaire de diluer le
contenu.
(2) Préparation des bocaux d’eau distillée stérile :
Dans des bocaux ou des flacons fermant
hermétiquement et résistant à la chaleur, verser
environ 100 mL d’eau distillée. Fermer le couvercle
sur les bocaux et les stériliser 45 minutes à
l’autoclave.
Remarque
Si vous partez d’un explant très sale et
qu’après cette méthode de désinfection il
reste contaminé, vous pouvez, avant de
désinfecter dans l’eau de Javel, le placer
environ 15 à 20 secondes dans une solution
d’alcool à 70° (préparée en ajoutant 31 mL
d’eau dans 100 mL d’alcool à 90°).
 6 Mise en culture
premières mises en culture sur gel de multiplication ainsi
que pour les repiquages sur gel d’enracinement des explants.

􀀹 Désinfecter le bouchon du flacon avec la solution d’eau de

Javel.

􀀹 Ouvrir le flacon encolure vers la flamme du bec Bunsen ou

dans le courant d’air très chaud d’un bec électrique et poser le
bouchon face extérieure vers le haut. (Il est pratiquement
impossible de contaminer l’intérieur du bouchon, la cavité
formée étant close).

􀀹 Avec des gestes lents, prendre l’explant et introduire celui-ci

dans le flacon en le posant sur le gel avec une légère pression
sur ce dernier pour le stabiliser.

􀀹 Refermer le flacon en ayant au préalable passé à la flamme

(ou dans le flux d’air chaud) l’encolure en verre.
7 Conservation des mises en culture
Chaque variation de température à l’intérieur
du flacon induit une circulation d’air entre l’intérieur
et l’extérieur du flacon. Il est donc conseillé, pour
éviter des infections ultérieures des mises en culture,
de les conserver à une température la plus
constante possible, l’idéal pour la plupart des
expérimentations in vitro se situant vers 22 – 23° C.
La lumière est également indispensable,
cependant évitez d’exposer les flacons
directement au soleil ; 16 à 18 heures de lumière
par jour seront nécessaires. Des éclairages
d’appoint type lampes horticoles ou lumière du jour
pourront être utilisés afin de donner aux cultures
l’énergie lumineuse suffisante.
Matériel nécessaire
 Pincesdroites grand modèle
 Scalpel Papier joseph
 Autoclave
 Bain-marie 100°C
 Bec bunsen
 Ou Bec électrique Serenit® microbio
 Ou Bec Lab microbio
 Biocub®10
 Ou Enceinte éclairante horticole

Complément
Hotte à flux laminaire