Symbiose rhizobium-légumineuses

Historique
L’effet bénéfique des légumineuses sur le sol est connu depuis
le temps des romains, qui les ont utilisées dans les rotations de
cultures.
Theophrastus (370-285 A.J.C.) disait que la culture de la fève
n'appauvrit pas le sol mais au contraire elle le fertilise.
Les peuples de Macédoine et Thessalie retournaient la terre
quand la fève était en fleurs.
Boussignault vers 1840: le pois et le trèfle sont capables d'utiliser
l'azote de l'air.
Hellriegel et Wilfart sur le pois en 1886-88, des bactéries (les
rhizobiums aujourd'hui), vivant en symbiose avec les plantes
dans des nodosités racinaires fixait l'azote atmosphérique.
Beijerink en 1888 a isolé ces bactéries et a montré qu'elles étaient
capables de réinfecter la plante hôte et reformer des nodules.
 Rhizobium

Racine de légumineuse nodulée

Soybean nodules PHOTO: KEN GILLER
1- Partenaires de la symbiose
- Légumineuses troisième famille par ordre d'importance chez les
angiospermes.
• plantes herbacées ou ligneuses, à valeur alimentaire ou fourragère
et avec une large répartition géographique
• 20 000 espèces répertoriées, la nodulation examinée pour environ
3 000: cas positifs > 90%.
- Les premières bactéries décrites sous le terme de "Rhizobium"
constituaient un seul genre bactérien appartenant à la famille des
Rhizobiaceae (comprenait aussi le genre Agrobacterium).
Propriété commune: formation de tumeurs chez les plantes,
- nodosités structurées produites par rhizobium chez les légumineuses
- tumeurs désorganisées provoquées par Agrobacterium chez
différentes plantes.
Aujourd’hui plusieurs genres bactériens sont connus sous le terme de
rhizobium: Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium,
Bradyrhizobium, …. (voir TD diversité et classification)
* Caractéristiques culturales des rhizobia
- milieu de culture: YEM (yeast extract mannitol)
- colonies formées sur milieu gélosé incolores, blanchâtres ou crèmes.
- température optimale de croissance 28 - 30°C.
* Au microscope
- bâtonnet Gram négatif, 0,5 et 0,8 µ de diamètre et 1,2 à 3 µ
de longueur.
- généralement cellules mobiles à l'état jeune, flagellation péritriche
ou polaire, non sporogène et organotrophe.
 2. Infection et mécanismes de nodulation

La symbiose est le résultat d'une interaction hautement spécifique

entre la bactérie et la plante hôte.

Ainsi, Sinorhizobium meliloti ne forme des nodules que chez

les genres Medicago, Melilotus et Trigonella.

Tandis que R. leguminosarum bv viceae n'infecte que Pisum et Vicia

Mais des exceptions à cette règle existent:

- souches à large spectre d'hôte, ex. souche NGR 234 nodule
environ 110 espèces de légumineuses
- plantes très permissives, Ex. le haricot qui est nodulé par
plusieurs espèces de rhizobium.
 2.1. Rhizobium dans la rhizosphère
Les exsudats racinaires :
- stimulent la multiplication des microorganismes du sol,
c'est le cas aussi pour rhizobium
- certaines substances attirent les rhizobiums : Chimiotactisme

Pour une bonne nodulation : le nombre > 104 rhizobiums / gramme

de sol rhizosphèrique.

Pour avoir un nodule il faut au minimum entre 5 et 20 bactéries.

Le chimiotactisme et la mobilité des rhizobia ne sont pas requis
pour la nodulation mais rendent les rhizobia plus compétitifs,
probablement en leur permettant un meilleur établissement dans
la rhizosphère à proximité des racines de la plante hôte.
Cellule de Rhizobium leguminosarum bv. trifolii à l’état libre
entourée d’une capsule protectrice d’exopolysaccharides
Après la multiplication, il y a attachement ferme des bactéries sur
les poils absorbants racinaires, souvent polaire. Il nécessite des
signaux moléculaires émis par la plante et se fait grâce aux :
- pilis,
- probablement aussi des lectines et/ou des molécules appelées
adhésines

Rhizobia attachés par des

Microfibrilles cellulosiques
à un poil absorbant
2.2. Reconnaissance entre le rhizobium et la plante hôte
L'hypothèse la plus ancienne est celle faisant intervenir des
glycoprotéines appelées lectines secrétées par la plante,
qui peuvent se fixer sélectivement sur les exopolysaccharides
ou les lipopolysaccharides de la paroi du rhizobium spécifique.

proposé en 1975 par Dazzo and Hubbell

Cependant
Dans certaines associations rhizobium-légumineuses l'attachement
spécifique n'a pas pu être démontré.
Hypothèse actuelle :

L'attachement initial ne serait pas spécifique, il serait arbitraire,

mais des échanges de signaux spécifiques ont lieu par la suite entre
la bactérie et la plante.
La reconnaissance n'est pas un processus d'une seule étape, mais
plutôt l'effet cumulé d'une série d'interactions signal-réponse.
Ainsi après attachement arbitraire d'une bactérie sur une cellule hôte,
la plante hôte sécrète, au même moment, des substances
particulières, qui ont été identifiées: substances flavonoïdes.
Ex: Luteoline
OH
OH

HO O

OH O

Ces flavonoides induisent certains gènes de nodulation chez le

rhizobium spécifique.
Le rhizobium spécifique répond par la sécrétion de molécules
appelées facteurs Nod, qui entraînent des modifications
anatomiques des cellules réceptrices de la racine de la plante.

Mais
- Certaines étapes dans la succession d'échanges de signaux et de
réponses ne sont pas encore complètement élucidées.
Facteurs Nod : molécules de PM faible produites en très faibles
quantités, appelés lipo-oligosacharides ou lipochitines (constitués
d'un acide gras lié à un glucide).
Chez S. meliloti par les gènes communs nodABC et les gènes
spécifiques nodH et nodPQ

Même structure générale quelque soit l'espèce de rhizobium

 Ce squelette est formé par des oligomères de chitine :
- constitué chacun de 3 à
5 résidus N-
acetylglucosaminosyl liés
par des liaisons 1,4-ß,
acétylé au niveau du
résidu glucosaminosyl
terminal non réducteur
(d’autres substitutions
sont possibles).
- Il a été montré que le gène nodC spécifie une protéine qui est
l'homologue d'enzymes nécessaires à la synthèse de la chitine chez
les champignons, la chitine synthase. Cette protéine est impliquée
dans la production de l'ossature des facteurs Nod.
- Les décorations du squelette des facteurs Nod sont gouvernées
par les gènes hsn, notamment le groupent sulfate et l’AG.
2.3. Infection des racines
Chez les légumineuses tempérées comme le pois et la luzerne,
le premier indice visible de l'infection des racines par rhizobium
est la courbure des poils absorbants qui se recourbent "en crosse
de berger" induite par les facteurs Nod secrétés par les
bactéries à la surface des racines.

Seules les jeunes poils absorbants peuvent être courbés

suffisamment pour entourer les cellules bactériennes
La courbure des poils absorbants apparaît chez le soja dans les 12
heures après l'attachement des rhizobium.
Rhizobia sur la pointe Cellules de rhizobium retenues
d’un poil absorbant dans la courbure du poil absorbant
D'autres mécanismes
d'infection sont décrits chez
certaines espèces de
légumineuses,
Ex: chez la légumineuse
fourragère Stylosanthes
l'infection se fait entre les
cellules de l'épiderme
racinaire ou
les sites d'émergence des
racines latérales.
Après courbure il y a pénétration des bactéries dans les racines
par l'extrémité des poils absorbants dont la paroi s'invagine.

La pénétration serait facilitée par une enzyme: la polygalactorunase,

synthétisée par la plante sous l'induction de rhizobium
paroi deviendrait plus plastique.

Certains travaux montrent que c'est le rhizobium attrapé dans la

courbure qui dégrade la paroi du poil absorbant

Cette opération a lieu dans les 20 heures qui suivent l’attachement.

 2.4. Initiation de la nodosité

L'invagination de la paroi va donner naissance à un filament appelé

cordon d'infection, structure tubulaire contenant des rhizobia
alignés et qui se divisent activement au fur et à mesure que le cordon
progresse, jusqu'à atteindre les cellules du cortex.

Ce phénomène a lieu dans les 24 heures suivant l'attachement.

 Cordon d’infection
formé par des cellules
de rhizobium dans le
poil absorbant
Lorsque le cordon a pénétré 3 à
6 couches de cellules corticales,
on constate en face des
ramifications du cordon la
différentiation de certaines
cellules corticales et leur
transformation en zone
méristématique
 va donner les différents tissus de la future
nodosité
va déterminer sa morphologie qui est une
caractéristique de l'espèce (gouvernée par la
plante hôte) :
1- les nodules à croissance déterminée, comme
ceux du soja et du haricot sont ronds et n'ont
pas de zone méristématique prononcée,

Etapes de formation des

nodules chez la luzerne

Soja (Glycine max) Lotier (Lotus corniculatus) Arachide (Arachis hypogaea)

2- par contre ceux à croissance indéterminée, comme ceux du pois,
des trèfles et des luzernes sont allongés avec une zone
méristématique importante et croissent en longueur le long de la
saison de croissance.

Sainfoin (Onobrychis viciifolia) Pois chiche (Cicer arietinum) Trèfle blanc (Trifolium repens)

L'initiation a lieu dans les 48 heures suivant l'attachement.

Après 4 jours, un méristème nodulaire c'est bien développé dans le
cortex immédiatement contigu au cordon d'infection.
 2.5. Maturation de la nodosité:
L'extrémité du cordon d'infection
forme des renflements, qui sous
l'action d'une cellulase végétale
et d'une pectinase bactérienne,
libèrent les rhizobia :

Envahissent
par milliers les cellules corticales.
 Les rhizobia sont enveloppés dans
une enveloppe d'origine végétale
appelée membrane de
séquestration, qui protège la
bactérie contre les mécanismes de
défense de la plante hôte.

A l'intérieur de cette membrane les

bactéries vont progressivement
changer de morphologie pour
donner des bactéroïdes

ne se divisent pas, sont volumineux, possèdent une quantité

d'ADN supérieure à celle de la forme bactérie.
 SYMBIOSOME
bactéroïde

membrane de
séquestration
Espace péribactériodal:
leghémoglobine

Photos prises au microscope électronique d’une section fine de

cellules végétales de nodule remplie de bactéroïdes de rhizobium
La taille des cellules
végétales hôtes augmente
aussi, de même que
le nombre de
mitochondries et de plastes

Les plastes se
trouvent rejetés à la
périphérie contre la
membrane
cytoplasmique.

Le noyau très gonflé se trouve quant à lui pris entre les bactéroïdes
et la vacuole centrale.
A leur maturité ces cellules vont former le tissu central de la nodosité.
Un pigment rouge la leghémoglobine est synthétisé par les 2
symbiotes. La partie protéique est synthétisée par la plante alors
que la partie hémique est produite par la bactérie.
Elle est localisée entre la paroi des bactéroïdes et la membrane de
séquestration.
Cette hémoprotéine joue un rôle très important dans la nodosité:
elle transporte l'oxygène vers le bactéroïde, tout en protégeant la
nitrogénase (sensible aux fortes teneurs en oxygène)
inefficients

efficients

Sections de nodules de soja. Nodules de Coronilla varia

 4. Contrôle génétique de la symbiose et de la fixation
Gènes de nodulation :gènes nod
 gènes communs
gènes hsn
(gènes de spécificité de l’hôte)
- Chez Sinorhizobium meliloti
et la plus part des espèces de Rhizobium, la majorité de ces gènes
sont situés sur un mégaplasmide, le pSym, de 1200-1400kb.
Contient aussi des gènes de fixation de l'azote (nif et fix).

- Chez Mesorhizobium loti, Bradyrhizobium et Azorhizobium, les

gènes en relation avec la symbiose sont localisés sur le chromosome
bactérien.
Remarques:
- D’autres gènes impliqués dans la nodulation ont été identifiés: nol et noe
- La plus part des gènes de nodulation sont inductibles par les substances
flavonoïdes de la plante hôte.
 4.1. Fonction des gènes Nod

La fonction majeure des gènes nod est d’assurer l’échange de

signaux entre les deux partenaires de la symbiose :

- Etape 1: les flavonoïdes excrétés par la plante induisent, en

conjugaison avec la protéine Nod D, la transcription des gènes nod
bactériens.
- Etape 2: la bactérie produit par l’intermédiaire des gènes de
structure nod, des signaux moléculaires (facteurs Nod) qui
induisent différentes réponses au niveau des racines, dont la
déformation des poils absorbants de la plante hôte.
4.2. Contrôle génétique de la spécificité
La spécificité est contrôlée par les gènes hsn
Exemple: présence d'un groupe sulfate sur l'extrémité
réductrice de la molécule est due aux gènes de spécificité d'hôte
nodH et nod PQ.
En 1991, le rôle des groupements sulfates dans le déterminisme de
la spécificité d'hôte chez S. meliloti a été démontré: Les facteurs
Nod non sulfatés ne déforment pas les poils absorbants de la
luzerne, mais ceux de la vesce.
Donc les fact Nod déterminent la spécificité d'infection et de
nodulation d'une espèce de Rhizobium pour une légumineuse donnée.

Les gènes nodFE codent pour des enzymes impliquées dans la

synthèse de l'acide gras lié au squelette oligosaccharidique: la
structure de l’AG, notamment le nombre et la position des
doubles liaisons, joue également un rôle dans la spécificité d'hôte.
 4.3. Activation des gènes végétaux par les facteurs Nod
L'addition de facteurs Nod purifiés provoque chez les légumineuses
cultivées aseptiquement des réactions analogues à celles induites par
les Rhizobium :
- A des concentrations de l'ordre de 10-9 à 10-12 M: stimulation de
la formation de poils absorbants chez leur plantes hôtes à partir de
cellules épidermiques racinaires, ainsi que la déformation des poils.

- A des concentrations plus fortes (10-7 à 10-9 M) : induction de la

division des cellules du cortex interne des racines et la formation
d'ébauches de filaments d'infection.

A ces concentrations, les facteurs sulfatés de S. meliloti provoquent

également, chez la luzerne, la formation de véritables nodules qui
ne fixent pas l'azote mais dont l'origine, l'anatomie et l'histologie
sont identiques à celles des nodules induits par Rhizobium
Donc la plante possèderait, à elle seule, tout le programme
génétique nécessaire au développement du nodule. Le rôle de la
bactérie semble donc d'induire l'activation de ce programme grâce
aux facteurs Nod.

- A une très faible concentration (10-11 à 10-13 M): induction de la

transcription des gènes symbiotiques végétaux (gènes ENOD):
exprimés spécifiquement pendant les premières étapes de la
nodulation (quelques jours après l'exposition à Rhizobium), ils
spécifient des protéines appelées nodulines précoces.
D'autres nodulines tardives apparaissent ultérieurement dans
les nodules. Elles sont spécifiques aux nodosités et ont été isolées
des nodules du petit pois, de la luzerne et du soja. Deux types :
Les C-nodulines: nodulines communes présentes dans tous les nodules, donc
impliquées dans la fixation biologique de l'azote. Ex la leghémoglobine

Les S-nodulines: nodulines spécifiques impliquées dans le métabolisme du C et

de l‘N des nodules. Ex: uricase, glutamine synthétase, sucrose synthase, choline
kinase.
4.4 - Organisation des gènes de fixation chez les rhizobia
Chez les fixateurs symbiotiques, les gènes de la fixation de l'azote sont
appelés nif ou fix selon qu'ils ont ou non leur équivalent chez K.
pneumoniae.
Gènes fix : gènes nécessaires à la fixation en symbiose avec la plante
Les expériences d'hybridation des gènes nif de K. pneumoniae et de S.
meliloti chez S. meliloti les gènes nif sont localisés sur le
mégaplasmide pSym.
Cluster 1 (nif-fix)
Cluster 2

fix nod nif fix nif nif fix

F E K D H A B C X A B G H I Y

ADN symbiotique non ADN non symbiotique 200 kb

essentiel de 1,9 kb
Hautement conservée chez les Rhizobium à
Régulé par nifA croissance rapide. Les 4 protéines FixG,
fonctionnellement en relation FixH, FixI et FixY seraient des protéines
avec le cluster nif-fix. transmembranaires impliquées dans un
processus d'oxydo-réduction
Chez les Bradyrhizobium:
- Les gènes nif et fix localisés sur le chromosome.
- Leur organisation diffère de celle décrite chez S. meliloti.
Par Exemple: les gènes nif HDK sont séparés en deux opérons
non liés, nif H et nif DK, alors qu’ils forment un seul opéron
chez S. meliloti et Rhizobium leguminosarum,
4.5 - Régulation des gènes de fixation de l'azote
- l'effet de NO3- et NH4+ se manifeste dès les premiers stades de
l'établissement de la symbiose: avortement des nodosités,
diminution de taille…..
- mais contrairement à K. pneumoniae, pas d’effet sur la synthèse
de la nitrogénase
- Au niveau génétique: l'expression des gènes de fixation chez les
Rhizobium est contrôlée par la protéine NifA. Cependant la
régulation de l'expression du gène nifA diffère de celle observée
chez K. p. et diffère aussi selon l'espèce.
3. Assimilation de l'azote fixé

L'utilisation du N15 a montré que

la réduction de l'azote
moléculaire en NH4+ était suivie
par la synthèse de glutamine et
de glutamate, puis de l'acide
aspartique.
 - Chez les bactéries libres la GDH a un rôle catabolique (sens
de la formation d'oxoglutarate) car cette enzyme a peu
d'affinité pour le NH4+. Seule la voie GS/GOGAT intervient
donc dans l'assimilation de l'azote fixé.

- Dans les bactéroïdes la GS et la GOGAT se trouvent en

faibles quantités, par contre leur synthèse augmente dans les
cellules végétales au moment de la synthèse de la
nitrogénase. Donc dans les systèmes symbiotiques le NH4+
est assimilé essentiellement dans les cellules végétales (de la
nodosité). Ensuite il est déplacé vers les parties aériennes de
la plante sous forme d'aspartate et d'asparagine.
C'est le cas essentiellement des nodules à croissance indéterminée.
Par contre les nodules à croissance déterminée exportent des
produits très différents: le glutamate et l'aspartate sont utilisés
pour la synthèse de purines comme la xanthine. Les purines sont
converties dans les cellules non infectées voisines en uréides:
allantoine et acide allantoique.

Etant donné que la concentration de ces substances est souvent

corrélée avec la fixation d'azote récente, l'analyse de la quantité
d'ureides dans le xylème peut être utilisée pour estimer la fixation
de l'azote.

Donc grosso modo les rhizobiums fixent l'azote

atmosphérique et excrètent l'ammonium formé vers la
nodosité.
Chez les bactéries non symbiotiques la fixation de l'azote et
l'assimilation de l'ammonium fonctionnent simultanément et de
façon coordonnée.