Module : Techniques d’analyse

Chapitre I

Chromatographie
S’exprimer en couleur

Mr. MORSLI Amine

Mr. HADJ YOUCEF Mohamed

Important : veuillez ramener une copie de ce document lors des séances de cours

1 Année Universitaire : 2020-2021

 Définition
Généralités
Plan du cours
Principe
Mécanismes
Types de chromatographie
- Chromatographie CCM
- Chromatographie CC
- Chromatographie CPG
-Chromatographie HPLC

Exploitation d’un chromatogramme

2 2
 Définition
 La chromatographie est une technique puissante
de séparation et de fractionnement des
constituants d’un mélange liquide ou gazeux.
 Il existe plusieurs types de chromatographie. Nous
nous limiterons à quatre types seulement dans ce
chapitre :
• Chromatographie sur couche mince CCM
• Chromatographie sur colonne CC
• Chromatographie en phase gazeuse CPG
• Chromatographie en phase liquide haute performance HPLC
3 3
Généralités

4
4
Principe
La chromatographie nécessite la présence de trois conditions :
- Phase fixe : souvent une silice déposée sur une plaque ou
remplie dans une colonne, appelée aussi phase stationnaire ou
immobile.
- Phase mobile : un solvant qui se déplace sur ou à travers la
phase fixe, entrainant avec elle l’analyte. La phase mobile peut
être une liquide ou un gaz.
- Échantillon : constitué d’un ou plusieurs composants, sujets
de séparation.
5 5
Mécanismes
La chromatographie repose sur différents mécanismes:
 Mécanisme d’adsorption: s’articule sur la différence de
polarité entre les différents constituants. Le composant le plus
polaire est retenu plus longtemps par la phase fixe (polaire), le
moins polaire sortira en premier.
 Mécanisme de solubilisation: se base sur la solubilité
différentielle des constituants du mélange dans la phase
stationnaire et la phase mobile.

6 6
  Mécanisme d’exclusion : appelé aussi tamisage
moléculaire ou perméation de gel et sert à séparer les
molécules de grandes tailles telles que les protéines ou
polymères. Les grandes particules sont exclues de la
phase fixe, les petites particules incluses diffusent dans
les pores du gel et sont donc retardées

7 7
Types de chromatographie
Chromatographie CCM
La chromatographie planaire, également connue sous le nom
de chromatographie sur couche mince (CCM), ayant sa
propre spécificité. La chromatographie CCM repose sur le
dépôt d’un échantillon sur une silice déposée sur une plaque de
verre (phase fixe) et l’immerger dans un solvant apolaire
(phase mobile). La séparation des constituants se fait par
différence de polarité. La référence frontale Rf donne un indice
spécifique de chaque constituant.

8 8
 Séparation de constituants d’un mélange par chromatographie CCM

La séparation entre les constituants se fait par différence de

polarité. Le composant plus polaire sera retenu plus longtemps
par la phase fixe (en bas de la plaque), le moins polaire sera
élué en premier (haut de la plaque).
9 9
 Séparation de constituants de deux mélanges par chromatographie CCM

La CCM peut être utilisée, à titre qualitatif, pour séparer les

constituants de plusieurs mélanges.
La révélation des tâches se fait sous lampe UV ou par la
pulvérisation des produits fluorescents tels que HI ou H2SO4

10 10
 La phase fixe est souvent une silice, polaire, déposée sur une
plaque de verre ou de papier.
- Le solvant est appelé éluant.
- Le constituant élué est appelé éluât
- Le processus est appelé élution 11
11
Chromatographie sur colonne
La phase fixe, généralement silice
polaire, est remplie dans une colonne
(a), l’échantillon est déposé en haut
de colonne (b), la phase mobile,
solvant, élue les constituants du
mélange le long de la colonne (c), les
composants sont départagés par ordre
de polarité et sont recueillis à la sortie
dans des tubes et regroupés par même
nature (d).
12 12
 Différentes
phases séparées
sur colonne

Illustration d’une séparation par chromatographie sur colonne

13 13
 Chromatographie en phase gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse CPG est composé de :

- La phase stationnaire : souvent une silice, remplie dans une

colonne en forme spirale.
- La phase mobile : un gaz inerte chimiquement tels He, N2.
- L’échantillon : injecté en petite quantité (via un injecteur
thermostaté.
- L’injecteur : sert à injecter l’échantillon, liquide ou vapeur, dans
la colonne.
- Les échantillons liquides sont vaporisés dans l’injecteur avant
qu’ils soient entrainés par la phase mobile à travers la colonne.
- Le four : sert à régler la température et travailler dans un climat
programmable.
- Le détecteur : détecte et quantifie les constituants du mélange.
14 14
Chromatographie en phase gazeuse

15
15
 Schéma d’une chromatographie en phase gazeuse CPG

16 16
Colonnes

17
17
Détecteurs

Lorsqu’un soluté est élué, le

Le courant gazeux issu de la colonne changement de composition de la
pénètre dans la flamme d’un petit phase gazeuse modifie sa
bruleur alimenté par un mélange d’H2 et conductibilité. L’équilibre
d’air. Ce détecteur détruit l’échantillon thermique est rompu, d’où il
dont la combustion produit des ions résulté une variation de
responsables du passage d’un courant résistance du filament,
électrique faible amplifié et mesuré par proportionnelle à la
un électromètre concentration du composé dans
le gaz vecteur.
18 18
Chromatographie Liquide Haute Performance HPLC

La chromatographie HPLC repose sur le même principe de

séparation que la CPG, sauf qu’elle dispose d’une colonne de 15 à
30 cm et utilise une phase mobile liquide pour l’entrainement
des constituants du mélange.
19 19
 La colonne est un tube inerte aux
produits chimiques, souvent en
inox ou en verre, de diamètre
compris entre 4 et 20mm et de
longueur généralement de 15 à
30cm.

Schéma de fonctionnement d’une chromatographie type HPLC

20 20
Exploitation d’un chromatogramme

Un chromatogramme est composé d’une ligne de base et

d’un certain nombre de pics. La superficie d’un pic permet
des interprétations quantitatives.

21 21
 A : point de départ = moment d’injection de l’échantillon
t0 : temps mort = temps de séjour de la phase mobile dans la
colonne
tr: temps de rétention = intervalle de temps entre le pic i et
le point d’injection.
tr’: temps de rétention réduit = temps d’immobilisation du
soluté dans la phase stationnaire tr’ = tr – t0
22 22
23 23
 ω : Largeur à la base mesurée à 13.5% de la hauteur du pic.
δ : Largeur du pic à la mi hauteur, mesuré à 50%.
σ: Ecart type, la demi largeur mesurée à 60.6% de la hauteur
du pic.
Aire: L’aire du pic peut être utilisée pour l’analyse
quantitative.
24 24
 Le facteur de rétention peut s’écrire aussi sous la forme :

Ki’ = tri’ / t0

25 25
26 26
 Rs : Facteur de résolution, donne un indice fiable de la
résolution entre les pics. Généralement une bonne résolution
est considérée pour un facteur Rs supérieur ou égale à1.5

27 27
 L’efficacité de la colonne est déterminée par le calcul de
Nth, nombre des plateaux théoriques ainsi que la HEPT,
hauteur d’un plateau théorique

Nth = (tr/σ)2 , Nth = 16.(tr/w)2, Nth = 5.54 (tr/ω)2

28 28