2.

Matériaux and méthodes

2.1. Matériaux

2.2 Préparation des solutions (comprimés, cachets, pilules)

2.2.1 Étalons de l’ibuprofène

Peser avec précision une prise de l’ibuprofène de standard voisine de 100 mg, transférer dans une fiole jaugée de 50
mL et compléter au volume avec de l’eau. La concentration de cette solution est 2 mg/mL, qui est ensuite diluée 10
fois avec de l’eau en prenant 5 mL de solution pour un volume de 50 mL (fiole jaugée), pour obtenir une solution de
mère de 0,2 mg/mL (200 μg/mL). Les étalons de l’ibuprofène obtenues dans les fioles jaugée de 10 mL ont été
préparée en mélangeant différentes quantités de solutions mères (0,25 mL, 0,5 mL, 0,75 mL, 1,0 mL, 1,25 mL, 1,5
mL) et compléter au volume avec de l’eau.

2.2.1 Solutions des échantillons

A l'aide d'une balance, on a pesé la masse de deux comprimés (cachet 1 : 0,6114 g, cachet 2 : 0,6965 g).

Dans un mortier, les deux comprimés ont été broyé finement, et une prise d’essai exactement mesurée voisine à 100
mg (cachet 1 : 103,3 mg, cachet 2 : 100,2 mg) est transférer dans deux fioles jaugées de 50 mL respectivement, et
complété la fiole avec de l'eau distillée jusqu'au trait de jauge et homogénéisé les solutions. La concentration de deux
solutions est 2 mg/mL. Par introduisant à la pipette 0,5 mL de la solution dans une fiole jaugée de 50 mL et
complétant avec de l'eau, on a obtenu une solution de 0,02 mg/mL pour l’analyse quantitative.

2.3 Sélection d'absorption maximum du spectre UV

Avant de commencer la mesure, le spectrophotomètre était allumé et laissé chauffer pendant une période appropriée
pour stabiliser les lampes. On a préparé un blanc en remplissant une cuvette propre avec le solvant de l’échantillon et
puis essuyé l’extérieur avec du papier non pelucheux pour enlever les traces de doigts. Après avoir fermé le couvercle
pour empêcher la lumière ambiante de pénétrer dans le système, le spectre de blanc sur une plage de longueur d’onde
(200 ~ 400 nm) était mesuré et enregistré, comme elle doit être soustraite de l’absorbance de l’échantillon. Ensuite, on
a jeté le blanc et rincé la cuvette deux fois avec l’échantillon. Puis, nous avons rempli la cuvette sur 3/4 pleine avec
l’échantillon et essuyé l’extérieur de la cuve, encore une fois, pour s’assurer qu’il est propre et exempt de traces de
doigts. La cuve a été placée dans le spectrophotomètre dans le bon sens avant fixer le couvercle. Le spectre de
l’échantillon a été enregistré sur la même plage de longueur d’onde comme le blanc. L’absorbance maximum (λ max) a
été déterminée à partir du spectre d’absorbance collectées.

2.4 Séparation par HPLC

La séparation a été réalisée sur un système automatisé Thermo Scientific ™ UltiMate ™ 3000 avec une colonne
Thermo ScientificTM Colonnes HypersilTM ODS C18 (150 × 4,6 mm ; 5 µm). Le volume de la boucle d'injection est 20
µL. Une élution a été exécutée avec 70% phase mobile A (l'eau acidifiée, 0,1% d'acide formique, pH 2,5) et 30%
phase mobile B (méthanol) à un débit de 1 mL/min. Tous les chromatogrammes ont été enregistrés à λ = 220 nm à 25
°C.
3. Résultats et discussions

D'une façon générale la chromatographie a pour but de séparer des composés présents dans une même solution en se
basant sur le fait que les composés n'ont pas la même affinité avec la phase stationnaire de la colonne (particules de
silice greffées ou non). Le produit ayant le moins d'affinité avec la colonne sortira en premier alors que celui qui en a
le plus sortira en dernier.

3.1 Comparaison de la solubilité des comprimés dans l'eau

L’absorption du médicament dépend de son état de dissolution, et les essais de dissolution permettent l'évaluation in
vitro de la vitesse et l'étendue de la libération du principe actif.

Dans notre TP, nous avons remarqué que le comprimé #2 a une meilleure solubilité dans l'eau, qui est lié à la
formulation des comprimés (les excipients : diluants, désintégrants, agglutinants…) ou aux processus de fabrication.
Pour évaluation de la dissolution d’un comprimé in vivo, les essais de dissolution devraient imiter autant que possible
les conditions physiologiques.

3.2 Sélection d'absorption maximum du spectre ultraviolet

L'intérêt de mesurer au maximum d'absorption est dans un premier temps que si les composés sont en très faible
quantité, et si l'absorption n'est pas prise à son maximum il y a un risque de ne pas voir un pic car la concentration est
basse et que la molécule absorbe peu à cette longueur d'onde, le pic peut donc être comparable au bruit de fond. Dans
un deuxième temps, plus le pic est grand (intensité est grande), plus les paramètres qui le caractérisent sont fiables.

La courbe ci-dessous (Figure 1) donne le spectre d’absorption d’une solution de l’ibuprofène de concentration 0.02
mg/mL (dans l'eau) en fonction de la longueur d’onde de 200~400 nm, et le maximum d’absorption du l’ibuprofène se
situe autour de λ = 220 nm, et l’absorbance est 0.87.

Figure 1. Le spectre UV de l’ibuprofène (0.02 mg/mL)

3.3 Optimisions de système HPLC

Selon la pharmacopée il y’a plusieurs méthodes d’analyse physicochimique spécifique au dosage et identification du
principe actif, parmi ces méthodes, la chromatographie liquide à haut performance (HPLC) est une technique de
séparation chromatographique reposant sur la distribution différentielle des espèces entre deux phases non miscibles,
une phase stationnaire contenue dans une colonne et une phase mobile liquide qui traverse cette phase stationnaire.
3.3.1 Appareillage

L’appareillage se compose typiquement d’un système de pompage, d’un injecteur, d’une colonne chromatographique,
d’un détecteur et d’un système d’acquisition des données (Figure 2). La phase mobile, délivrée à partir d’un ou
plusieurs réservoirs, circule à travers la colonne, généralement à débit constant, puis passe à travers le détecteur.

Figure 2. Schéma de principe d’une chaine d’HPLC.

3.3.2 Sélection de la phase mobile

La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire. La sélection
de la phase mobile pour la séparation de matrices complexes est une étape qui peut s’avérer compliquée et nécessite
dans certains cas l’application d’une méthodologie rigoureuse. Les solvants utilisés en chromatographie ont une
double fonction : éluer l’échantillon et séparer les composés.

Pour la chromatographie en phase normale, les solvants organiques utilisés sont généralement de faible polarité. Pour
la chromatographie en phase inversée, on utilise des phases mobiles aqueuses, avec ou sans solvants organiques.
Certains appareils permettent de modifier l'éluant au cours du temps en diminuant la polarité, ce qui a pour effet
d'accélérer la sortie des composés les plus apolaires, c'est le mode gradient.

Dans ce TP nous utiliseront une colonne inverse, et donc un éluant polaire a été appliqué, dans notre cas il s'agira d'un
mélange d'eau et de méthanol. Nous avons comparé les chromatogrammes de l’ibuprofène sous forme moléculaire
dans cette phase mobile avec sa forme protonée à pH=2,5 dans une phase mobile acidifiée en ajoutant 0.1 % acide
acétique, lorsque l’ibuprofène a un pKa=4,5, et pH=pKa-2. Nous avons remarqué que le temps de rétention a diminué
légèrement à pH=2,5 que à pH 7,0 (Figure 3). Donc nous avons fait toutes les expériences à pH 7.0.
 Figure 3. Chromatogrammes de l’ibuprofène dans la phase mobile de A) 70% l’eau + 30% méthanol et de B) 70%
l’eau + 30% méthanol + 0.1% l’acide acétique.

Ensuite, nous avons changé le rapport de la phase mobile à 80-20 d'eau et de méthanol. Comparer les deux rapports de
la phase mobile (Figure 4), on voit que le temps de rétention a augmenté de 3,17 min à 4,64 min, et la forme de pic et
la largeur à mi-hauteur ont été bien améliorées. Il y a aussi d’autre explication pour ces différences, c’est que le
système chromatographique (pompage de la phase mobile, colonne) ne s'était pas encore stabilisé lorsqu'on modifiait
les rapports des phases mobiles. Nous avons effectué nos expériences avec la phase mobile de 80% l’eau + 20%
méthanol.

Figure 4. Chromatogrammes de l’ibuprofène dans la phase mobile de A) 70% l’eau + 30% méthanol et de B) 80%
l’eau + 20% méthanol.

3.4 Évaluation des performances de colonne

Les performances des colonnes sont exprimées en fonction de deux paramètres fondamentaux :

• le nombre de plateaux théoriques N = efficacité (il exprime la finesse des pics des composés sortant des colonnes)
• la sélectivité α = l'aptitude du système utilisé à distinguer, donc à séparer les composés injectés.
Pour qu'une séparation soit efficace (= résolution élevée), il faut bien sûr optimiser simultanément les deux paramètres
précédents.
Le chromatogramme de l’Ibuprofène a été obtenu dans les conditions suivante : La dimension de la colonne est 150
mm x 4,6 mm ID x 5 μm et le débit de la phase mobile est 1 mL/min.

Si le temps de rétention de l’ibuprofène 4,6 min, et le pic a une largeur à mi-hauteur de 10 secondes, l’efficacité de
cette colonne (les plateaux théoriques) est :

N th =5.54 ×
( )
tr 2
w 1/2
=5.54 × (
4.6 min ×60 2
10 s
=4220 )
et la hauteur équivalente à un plateau théorique HEPT :

L 150 mm
HEPT opt = = =0.0 36 mm
N th 4220

La vitesse linéaire optimal μopt (en cm/s) de la phase mobile dans la colonne
 0.5 0.5
μopt = = =0.1cm / s
d p 5 μm

Le temps mort de cette analyse :

L 15 cm
t m= = =150 s=2.5 min
μopt 0.1 cm/s

Le débit optimal Dopt (en mL/min)

2 2
π dc 3.14 × ( 0.46 cm )
D opt = × μopt × ε= × 0.1 cm/s × 0.65× 60=0.65 mL / min
4 4

3.5 Dosage de l’ibuprofène par étalonnage

Les étalons et deux solutions des échantillons ont été analysées par HPLC et les absorbances sont mesuré à 220 nm
(Tableau 1).

Tableau 1. Les concentrations, les absorbances et les temps de rétention des étalons

Solution No. 1 2 3 4 5 6 Cachet 1 Cachet 2

Les étalons (μg/mL) 5 10 15 20 25 30 14,41 6.2

Surface (mAU·min) 6,106 12,427 16,556 23,809 28,100 33,214 16,341 7,027

Temps de rét. (min) 4,62 4,61 4,61 4,61 4,60 5.17 4,64 4,62

On a tracé la courbe d'étalonnage des surfaces de pic en fonction des concentrations (Figure 5).

Figure 5 : Courbe d'étalonnage de l’ibuprofène à 220 nm

La relation entre A et C est linéaire du type :

A=k ×C
avec k = 1,1333. On remonte à la concentration de la solution en utilisant la courbe.
On trouve les concentrations des solutions des échantillons est :

A 16 , 341
C 1= = =14 , 41 μg/ mL
k 1 , 1333

A 7,027
C 2= = =6,2 μg/mL
k 1,1333
donc la masse de l’ibuprofène dans les deux cachets sont :

14 , 41 μg/mL ×50 mL × 100× 10−3

m 1= × 0 , 6114 g=0 , 426 g=426 mg
103 ,3 mg

−3
6.2 μg /mL ×50 mL ×100 × 10
m 2= × 0,6 965 g=0 , 215 g=215 mg
10 0 ,2 mg