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Faculté de médecine

Département de pharmacie d’Alger


Laboratoire de biophysique pharmaceutique

Analyse quantitative en chromatographie

Plan :
- Relations de base en analyse quantitative.
- Mesure de l'aire des pics.
- Principales méthodes de dosage chromatographie : étalonnage externe
interne et par ajouts dosés.

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Dr S.LANSARI
Chromatographie :
C’est une méthode analytique de séparation, identification et de dosage des constituants
chimiques présent dans des mélanges. Elle était découverte par le Botaniste Russe Mikhaïl
TSWETT en séparant les pigments végétaux de chlorophylle et des xanthophylles. La
chromatographie vient du mot grec chroma=couleur et graphie= écrire
L’expérience de base en chromatographie
peut être décrite comme suit (fig. 1.1) :
 On immobilise dans une colonne un
solide finement divisé appelé phase
stationnaire.
 On place au sommet de cette colonne
un petit volume de l’échantillon à
séparer.
 On force cet échantillon à traverser la
colonne de haut en bas au moyen de la phase mobile afin d’entraîner ses divers
constituants. Si les composés présents migrent à des vitesses différentes, ils pourront
être recueillis séparément, chacun en solution dans la phase mobile.

Principe de séparation :
On contact avec la phase stationnaire, le déplacement de la phase mobile entraine avec lui les
différents constituants de l’échantillon avec des vitesses de déplacements différentes pour
chaque constituant.
des équilibres de concentrations apparaissent lorsqu’un composé est mis en présence des
deux phases phase stationnaire et mobile .
Principe d’identification et de dosage :
On place à la sortie de la colonne un détecteur pour repérer les changements de composition
de la phase mobile. L’identification se fait par la comparaissent des temps de migration
(temps de rétention) des composés dans la colonne avec leur témoins dans les mêmes
conditions opératoires sans changement de l’appareil. Le dosage se fait par calcule des aires
des pics de chaque composé sur le chromatogramme.

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Définition et grandeur fondamental :
-phase stationnaire (phase solide): c’est une phase statique qui reste fixe sur un plan ou une
colonne
-phase mobile (éluent) : c’est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire
en entrainant l’analyte avec elle.
-élution : est un processus au cour duquel des solutions sont entrainés à travers une phase
stationnaire par le mouvement d’une phase
mobile.
-chromatogramme : est un graphique d’une
fonction de la concentration en soluté en
fonction du temps ou volume de phase
mobile, il est utilisé à la fois en analyse
qualitative et quantitative
-temps mort( tM ): temps nécessaire pour
qu’une espèce non retenu traverse la colonne
.
-temps de rétention (tR) : temps qui s’écoule entre l’injection de l’échantillon et l’apparition
du pic de soluté.

Remarque :

-Un pic d’élution idéal a le même aspect que la représentation graphique de la loi Normale
de distribution des erreurs aléatoires courbe de Gauss

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-Les chromatogrammes réels sont quelquefois loin de présenter des pics d’aspect gaussien.
L’asymétrie observée d’un pic est traduite par deux paramètres appelés facteur d’asymétrie
(Fa) et facteur de traînée (Ft ), mesurés à 10 %de sa hauteur (pour la signification de a et b,
voir figure 1.4) :Fa = Ft =

-Coefficient de distribution en chromatographie (K ou D) :


Il représente la constante d’équilibre de la séparation K=

Cs concentration de soluté dans la phase stationnaire, CM : concentration du soluté dans la


phase mobile

-vitesse de déplacement du soluté : le pouvoir séparateur d’une colonne dépend de la


vitesse d’élution V =
-vitesse linéaire des molécules de phase mobile :

-Volume de la phase mobile dans la colonne (volume mort VM)


Il peut être calculé d’après le chromatogramme, à condition d’introduire un soluté non
retenu par la phase stationnaire. VM = t M .D avec D=débit
- Volume de la phase stationnaire ( Vs)
n’apparaît pas sur le chromatogramme. Dans les cas simples on le calcule en retranchant du
volume total interne de la colonne vide le volume de la phase mobile.

Efficacité d’une colonne :


L'efficacité d'une colonne chromatographique dépend du degré d'élargissement du pic qui
se produit à mesure que l'analyse parcourt la colonne, elle s’évalue généralement part l’un
des deux termes H (la hauteur équivalente d’un plateau théorique) et N (nombre de plateau
théorique ) liées par : N= ⁄ L’efficacité augmente lors que N et H

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Efficacité théorique (nombre de plateaux théoriques) :

Les pics chromatographiques sont d'allure gaussienne et que l'efficacité d'une colonne est
liée à la largeur des pics, on utilise la variance par unité de longueur L de colonne comme
mesure de son efficacité.

⁄ Ou ⁄ ⁄

Donc pour toute chromatogramme qu’on peut déterminer on peut détermine H et N

- Les pics d’élution étant assez souvent déformé à la bas en utilise l’équation
suivante :

Et

- N est un paramètre relatif, puisqu’il dépend à la fois du soluté et des conditions


opératoires .

Efficacité réelle (nombre de plateaux théoriques effectifs) :

on remplace tR par t’R : ⁄ , ,

Facteur de Capacité K’ :

Il représente le rapport de quantité (ou de masse) de A présentes à l’équilibre dans les deux
volumes des phases stationnaire et mobile adjacentes ; c’est un nombre expérimental
important qui permet de décrire la vitesse de progression des solutés dans les colonnes

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Pour une séparation optimal il faut que : 1<K’<5

K’<1 élution très rapide

K’>20 ou 30 la durée d’élution devient exagèrent longues

En CPG K’ est modifié pas action sur la température et la composition de phase stationnaire

En CPL K’ est modifié en en ajustant la composition des phases stationnaire et mobile

Facteur de sélectivité (de séparation) α :

α des solutés A et B est défini pas le rapport du coefficient de distribution du soluté le plus
retenu (B) au coefficient de distribution de l’autre( A) , il permet d’estimer jusqu’à quel point
la colonne peut les séparer .est toujours α>1

Résolution d’une colonne :

C’est une mesure quantitative de son


aptitude à séparer les analytes A et B

[ ]

*Une résolution de 1,5 permet de


séparer 2 pics

* la résolution en fonction de la
sélectivité et facteur de capacité


( )( ) ( ) ( )
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*K’B facteur de capacité de l’espèce la plus lente

*temps de rétention en fonction de la résolution :

( ) ( )

est la vitesse linéaire d’écoulement de la phase mobile

Les paramètres qui permettent de réduire l’élargissement des pics sont :


- la réduction de la granulométrie du remplissage et le diamètre de la colonne.
-En CPG la diminution de la T° provoque une diminution H, l’impact est moins sur CPL car
diffusion longitudinal influence peu H
Lorsqu’on utilise des phases stationnaires liquides, l’épaisseur de la couche liquide de la
phase stationnaire doit être faible

Méthode d’optimisation :

L’Objective est d’avoir une résolution complète en un peu temps d’élution, les deux
équations guident les choix des conditions opératoires


( ) ( ) ( )( )

α dépend des propriétés des 2 soluté ; K’ dépend des propriétés du soluté et de la


colonne/phase mobile

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1/ modification de H :

R N soit par H (ça permet de diminué temps) ou par L (ça augmente temps
d’élution)
Pour H  diamètre des particules de remplissage, diamètre de la colonne ou
température (CPG ), épaisseur du filme liquide ( CPL ) ,aussi optimisé la vitesse
d’écoulement de la phase mobile
2/ Modification de K’ : K’  R

On détermine la valeur idéal de K’ par

( ) ( )

*On admet que Q et Q’ reste constant lorsque varie

Si K’> 10 on a une faible de R contre une importante du temps de séparation

La valeur optimale de K’ est entre 1 et 5 pour avoir une meilleure résolution avec peu de
temps d’élution

En CPG l’amélioration de R par modification de K’ se fait par action sur T° et en CPL en


modifiant la composition de la phase mobile

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3 /Modification du facteur de sélectivité :

On ne peut avoir une bonne résolution si , Dans ce cas, on doit rechercher un moyen
d'augmenter α tout en maintenant K’
entre 1 et 10. Plusieurs options sont possibles, on peut :

(l) -modifier la composition de la phase mobile (chromatographie en phase liquide)

(2) -modifier la température de la colonne(CEI)

(3) -modifier la composition de la phase stationnaire

Résolution des mélanges complexes :

Dans un mélange ou Les K’ sont différent, on peut modifier les conditions opératoires pour
optimiser la séparation des constituants d’une façon continue ou discontinue

En CPL l’optimisation s’obtiennent en changeant la composition de la phase mobile pendant


l’élution (gradient de composition ou programmation de solvant)

Analyse quantitative par chromatographie :

-l’analyse quantitative c’est une méthode comparative et non pas absolue, elle nécessite un
échantillon authentique du composé à dosé .En règle générale, les déterminations
quantitatives se font de la même manière en chromatographie liquide qu'en
chromatographie gazeuse. Les systèmes les plus simples sont entièrement tributaires des
enregistreurs ; les plus sophistiqués peuvent faire intervenir un ensemble complexe de
dispositifs de comptage, d'intégration et de calcul.

Nature de l'information :

Elle est bidimensionnelle car elle fournit en abscisse, une information qualitative : le temps
de rétention mesuré au sommet des pics (caractéristique des solutés) et en ordonnée une

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information à caractère quantitatif : l'intensité du signal. L’intégration du signal émis par le
détecteur fournit l'aire des pics, qui sont généralement d’allures gaussiennes.
On se place dans des conditions de fonctionnement telles que chaque aire soit
proportionnelle à la quantité de soluté :
mi= Ki * Ai
Ai = Aire du pic du composé i,
Ki = Facteur de proportionnalité du composé i appelé aussi facteur de réponse ou coefficient
de réponse,
m = Masse du composé i ayant traversé le détecteur

Ceci n'est vérifié que dans une zone limitée de concentration dite zone de linéarité.
*Le signal chromatographique obtenu n'est toutefois pas pur. Il peut être pollué, par la
réponse :
- des impuretés de la phase mobile
- de la phase stationnaire entraînée
-par la superposition de tensions parasites, de fréquences variables, récupérées tout au
long de la chaîne chromatographique
*Pour effectuer une quantification, il faudra :
- se situer dans la zone de linéarité du détecteur,
- déterminer les coefficients de réponse (K,) des produits à doser,
- filtrer le signal par étude du rapport signal sur bruit et lissage.
*La qualité de l'analyse dépendra donc des choix que l'on aura réalisés au niveau :
- du matériel,
- des paramètres d'acquisition et de traitement du signal,
- des conditions retenues pour l'analyse.

Hauteur du pic :

La mesure de la hauteur d'un pic permet de déterminer la quantité de substance de chaque


pic , elle est plus aisée et rapide à calculer que l’aire du pics et pour les pics étroits sa
détermination est plus exacte, Ceci a largement été utilisé par le passé ,Mais d'une part, les
pics ne sont pas parfaitement gaussiens et susceptibles de déformation

Mesure de l’aire de pic :

L'utilisation de l'aire (A) des pics, pour les mesures quantitatives est basée sur le fait que sa
valeur est proportionnelle à la concentration (C) du composant donnant le pic considéré :

C= k * A
La mesure de l’aire du pic est indépendante des effets d’élargissements donc, c’est un
paramètre plus satisfaisant que la hauteur du pic

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On pratique les pics n’ont pas toujours une forme parfaitement gaussienne, ce qui rond le
calcule manuel des aires des pics approximatifs. L’utilisation d’intégrateur électronique
améliore considérablement la qualité des calcules

1/ intégration manuel :
Ce sont des méthodes approximatives et leurs procédures de mesures sont très longues.
L’aire du pic peut être estimée par :
A/Découpe et pesée :

La méthode consiste à découper et à peser la surface de papier délimitée par le pic sur le
tracé (en remplaçant l'aire du pic par son poids). L’homogénéité de la qualité du papier est
d'une importance capital. La méthode a pour inconvénient de détruire le chromatogramme

B/Planimétrie :

Le planimètre polaire comporte deux bras articulés : le bras


polaire pivote autour d'un point fixe et le bras traceur est
muni à son extrémité d'une loupe comportant une alidade
permettant de suivre le tracé de la surface fermée à
intégrer. Le bras traceur comporte, au voisinage de
l'articulation, une roulette et un cadran de mesure.
il offre une précision comparable à celle des méthodes
géométriques, mais la méthode de travail est longue et
fastidieuse, son utilisation correcte nécessite une habileté et
une expérience considérables
On ne peut obtenir de résultats justes qu'en effectuant des mesures répétées et en prenant
leur valeur moyenne

C/Triangulation :

La méthode consiste à :

1/ mesurer l'aire du triangle isocèle construis à partir :

 des 2 tangentes aux points d'inflexion et la ligne de base, l’aire calculée


représente 96,9% de l’aire réelle

 des 2 droites qui joignant les extrémités de la base au sommet du pic, l’aire
calculée représente 79,9 % de l’aire réelle A=

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2/ produit de la hauteur du pic hmax à la largeur à mi-hauteur, l’aire calculée représente
93,9% de l’aire réelle A= , Cette méthode est la plus couramment utilisée et la
plus précise du point de vu de la justesse des manières de mesures des longueurs

3/ Méthode de Candal-Bosch recommandée pour les pics asymétriques, C'est le produit de


la hauteur par la moyenne des largeurs à 15% et 85% de la hauteur du pic, l’aire calculée
représente ~ 100, 5 % de l'aire réelle A=

Ces méthodes supposent que les pics sont des pics gaussiens et ils ne peuvent pas donner
les aires réelles des pics (aires inferieurs aux valeurs réelles) cependant la présence de ce
facteur constant n’est pas gênant tant que la méthode de mesure est la même pour tous les
pics et que les pics ont des formes symétriques

L'obtention des résultats précis avec une quelconque de ces méthodes de mesure nécessite
une grande habileté de l’opérateur

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TABLEAU : Comparaison entre différentes méthodes de mesure de l'aire des pics.

Méthode de mesure Temps nécessaire pour les Précision


mesures et les calculs* (en %)

Planimètre 15 mn 4,06
Triangulation basée sur la 12 mn 4,06
largeur a la base du pic
Hauteur maximale du pic x 10 mn 2,58
largeur à mi-hauteur
Découpe et pesée 20 mn 1,74
Intégrateur à disque 5 mn 1,29
Intégrateur numérique Instantané 0,44

*Temps typique pour trois pics

2/ L'intégration mécanique ou électromécanique :

Ce sont les plus simples et les moins chers, ils n'ont eu qu'une durée de vie assez brève à la
suite de l'apparition des premiers intégrateurs électroniques. Ils ne donnent pas une mesure
directe de l'aire, il convertie l’aire en oscillations (dent de scie) sur la marge gauche de
l'enregistreur dont le nombre est proportionnel à l'aire.

Les intégrateurs à disque et à bille

Ils utilisent une bande d'enregistrement spéciale portant, sur un côté, une échelle sur
laquelle se déplace une seconde plume qui trace une ligne droite lorsque la plume
principale est sur la ligne de base, et des dents de scie quand elle s'en éloigne. Le
mouvement de la plume de l'intégrateur s'accélère avec l'intensité du signal, donnant des
dents de scie de plus en plus rapprochées. Le décompte du nombre de dents de scies en
regard d’un pic donne un nombre proportionnel â son aire.

L'inconvénient principal d'un intégrateur électromécanique est sa lenteur, qui ne lui permet
pas de suivre tracé de pics très rapides. D'autre part, les résultats n'ont plus de sens en cas
de dépassement d'échelle et est difficile de déterminer le nombre de dents de scie
provoquées par la dérive de la ligne de base. Tous ces inconvénients sont éliminés par les
intégrateurs numériques

3/L'intégration électronique :
L’intégration électronique a supplanté tous les autres modes d'intégration par les facilités,
la précision, la vitesse et le coût réduit de cette opération.
Généralement la dispersion des résultats est essentiellement due :

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- à l'échantillon lui-même par sa représentativité, son homogénéité ou son traite-
ment avant analyse
- à l'ensemble du système chromatographique et en particulier à tout
ce qui concerne l'injection (volume d’injection inégale)

Les logiciels d'intégration sont supportés soit par des calculateurs dédiés, soit par des
ordinateurs de toutes tailles associés à des logiciels. Comme tous les constructeurs
n'utilisent pas exactement les mêmes algorithmes Cependant quelques (fonctions de base
sont réalisées par tous les intégrateurs :

A/la conversion analogique/digital (A/D) : Les calculateurs ne savent traiter que des valeurs
numériques et il convient donc de transformer le signal continu fourni par le détecteur en
une série de valeurs discrètes, il revient à prélever des points du signal à une fréquence
déterminée, généralement quelques millisecondes, et à les moyenner par tranche de temps,
de façon à assimiler les aires des pics à la somme des aires de rectangles ( fig. XV-3) auxquels
il faudra soustraire l'aire comprise entre le zéro et la ligne de base.

Le nombre de points conserves sera suffisant pour une bonne définition des pics mais limité
pour ne pas encombrer ou saturer les unités de stockage; on considère que 10 .à 20 points
par déviation standard sont suffisants .Le nombre de tranches est souvent défini par le
paramètre de largeur de pic ( Peak Width )et est programmable en fonction du temps.

B/le filtrage du bruit : Le signal chromatographique est pollué par des tensions parasites de
fréquences variables. Ces perturbations sont de trois ordres : à court terme, à long terme et
la dérive.
Le bruit de fond à court terme est généralement d'origine électronique provenant du
système de capteur du détecteur ou de l'amplificateur. Sa fréquence est supérieure à celle
d'un pic élué.
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Le bruit de fond à long terme est composé de perturbation de ligne de base de fréquence
similaire à celle d'un pic élué. Son origine se situe habituellement dans des changements de
température ou de pression.
La dérive est due habituellement à des changements de température du détecteur ou du
relargage de colonne en chromatographie gazeuse ou à une modification de la composition
de la phase mobile en HPLC.

Le filtrage du bruit peut s'effectuer avant ou mieux, après conversion A/D, il consiste à lisser
le signal et à le moyenner; le seuil de détection de pic sera fréquemment un multiple du
bruit résiduel.

C/tracés le chromatogramme

D/ la détection des pics :(début, fin, point d’inflexion et maximum en les marquant par des
trais)

la détection de début et de fin de pic est réalisée à partir de l'étude de la pente et d'un seuil
de filtrage (enveloppe de ligne de base) c'est-à-dire que tant que la valeur de la dérivée du
signal reste comprise entre les bornes du seuil (paramètre «Threshold»), nous sommes en
présence de la ligne de base. Au début d'un pic. La valeur de la dérivée devient supérieure à
la valeur du seuil maximum et à la fin du pic, cette valeur, alors négative, devient supérieure
au seuil minimum

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Ce principe conduit à une détection de début de pic trop tardive et de fin de pic trop
précoce, mais pour le calcul de l'aire du pic la bande est élargie de part et d'autre de
quelques points d'acquisition. La localisation des points d'inflexions et du maximum d'un pic
est déterminée à
l'aide des dérivées du signal.

E/ la localisation de la ligne de base : sur tout le chromatogramme et en particulier sous les


pics par interpolation. La ligne de base est détectée lorsque le signal (ou sa dérivée) reste
entre les deux valeurs du seuil de détection. Toutefois, les points ne seront assimilés à la
ligne de base que si un certain nombre (paramétrable) de points consécutifs est inclus entre
ces deux limites.
La ligne de base sous les pics est obtenue par interpolation entre deux détections de celle-ci
avant et après le pic ou le groupe de pics considéré.

F/le calcul de l’aire de chaque pic : L'intégration consiste à mesurer en continu l'amplitude
du signal de détection et à déterminer l'aire entre le tracé de ce signal en fonction du temps
et la ligne de base du tracé.

G/l’ identification des constituants :par temps de rétention, en conjonction avec


une table des pics préalablement renseignée, Les temps de rétention des constituants sont
déterminés pour les maximums d'intensité des pics, ce qui est une approximation pour les
pics asymétriques .

H/le calcul des résultats : à partir de la méthode sélectionnée et des informations fournies
au système.

I/l'édition d'un rapport d'analyse : avec éventuellement le tracé du chromatogramme.

J /stockage en mémoire des données chromatographiques en vue de leurs sauvegardes et


retraitements éventuels

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Différents modes d'intégration:

L’aire que l’intégrateur calcule pendant l’intégration est déterminée de la manière suivante :

•pour des pics parfaitement résolu, de ligne de base à ligne de base (BB), l’aire est au-
dessus de la ligne de base entre les graduations, comme sur la Figure 24
•pour les pics à résolutions incomplètes, de vallée à vallée (VV), l'aire au-dessus de la
ligne de base est découpée au niveau des graduations selon des lignes verticales,
comme sur la Figure 25, cette manière d'opérer est à peu près acceptable lorsque les
pics sont symétriques et de tailles comparables, cependant elle peut conduire à des
erreurs importantes pour des pics asymétriques et/ou de tailles très inégales.

•pour les pics sur la trainé d’un pic parent, intégration tangentiels (T), l'aire est au-
dessus de la ligne de base réinitialisée, figure 27
•les pics négatifs (au-dessous de la ligne de base) ont une aire positive comme le
montre la Figure 26.

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LES MÉTHODES DE QUANTIFICATION

La mesure précise de l'aire des pics est une condition nécessaire mais pas suffisante pour
déterminer la composition quantitative d'un mélange. Il convient de relier ces aires à la
quantité de substance introduite dans le système analytique.
C= k * A
la connaissance des facteurs de réponse absolus de chaque composé et la quantité totale
d'échantillon injecté ne sont pas suffisantes, car :
- la qualité de l'injection est rarement parfaite,
-les transferts des solutés vers les détecteurs ne sont pas toujours quantitatifs
(piégeages sur le septum, interactions avec les matériaux du système, micro fuites,
décompositions, adsorptions irréversibles, etc.),

- la réponse du détecteur évolue avec le temps.

Ce qui signifie que Ki est le coefficient de réponse de l'ensemble de l'appareillage dans les
conditions utilisées .

K, sera estimé par des mesures absolues en effectuant des injections de quantités
croissantes de soluté ou mieux par des mesures relatives, plus fiables, en prenant un tiers
corps, ayant des comportements physico-chimiques voisins des composés à analyser,
comme référence.

Etalonnage externe :

-il permet de calculer la teneur en terme de concentration ou pourcentage massique. La


méthode consiste a comparé deux chromatogrammes obtenus successivement sans
changement des conditions opératoires le 1er de l’échantillon et 2ème de la substance de
référence

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-On peut utiliser 1 seul point de mesure de l’échantillon de référence (droite passe par
l’origine) mais il est préférable de procéder à un étalonnage multipoint (gamme
d’étalonnage) et de répéter l’étalonnage pour obtenir plus d’exactitude
-la précision et meilleur si Cech =Créfé
-la source d’erreur la plus importante est liée à l’incertitude sur le volume d’échantillon et la
vitesse d’injection, en CPG c’est la seule méthode adaptée, et l’erreur importante est
réduite en 1% à2% avec une boucle d’échantillon réduite.

Méthode d’étalonnage interne :

-l’utilisation du coefficient de réponse relatif de chaque composé à doser vis-à-vis d’un


marqueur non présent dans l’échantillon introduit comme référence dans l’échantillon et
l’étalon , cela permet une meilleur précision et de diminuer l’incertitude liée à l’injection (
peut conduire à des précision relative de 0,5% à 1%).
-il faut 2 chromatogrammes, l’un pour calculer les coefficients de réponse relatif et l’autre
pour analyser de l’échantillon
-Le pic de l’étalon interne est bien séparé aux autres pics, mais proche du pic de l’analyse
-pour plus de précision on fait plusieurs injections

-le choix de l’étalon interne :


-substance pure et ne se trouve pas initialement dans l’échantillon
-pic d’élution doit être bien résolu par rapport à tous ceux qui forment le
chromatogramme de l’échantillon
-tR proche du ou des solutés à doser
- la concentration est proche ou supérieur des autres solutés
-inerte vis-à-vis les composés de l’échantillon

⁄ ⁄

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⁄ ⁄ ⁄ ⁄

Méthode par normalisation interne :

- On choisit l'un des composés comme substance de normalisation interne, le composé 3 par
exemple, afin de déterminer les coefficients de réponse relatifs K1/3 et K2/3 des composés 1
et 2 par rapport à 3.

-il faut 2 chromatogrammes, l’un pour calculer les coefficients de réponse relatif et l’autre
pour analyser

1/Calcul des coefficients de réponse relatifs

Etant donné que m = C V, on aboutit, pour K1/3 et K2/3, aux expressions suivantes :

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2/ Chromatographie de l'échantillon - Calcul des concentrations

La condition de normalisation étant que x1 + x2 + x3 = 100

■ En extrapolant à n solutés normalisés par rapport à un soluté j, l'expression générale des


facteurs de réponse est la suivante (pour un composé choisi i;) :

Pour l'échantillon contenant n solutés, si A’j désigne l’aire du pic d'élution du composé i le
composé servant de référence interne étant j, la teneur en composé i obéira à la relation :

Méthode par Les ajouts dosés :

On utilise l'échantillon lui-même comme matrice pour l'étalonnage. Après avoir réalisé
quelques analyses à l'aide d'injections aussi reproductibles que possible de l'échantillon, on
effectue des ajouts dosés des constituants à déterminer dans des quantités voisines de
celles initialement présentes. Une nouvelle série d'injections de cette nouvelle solution est
faite. L'accroissement de l'aire de chaque composé entre les deux analyses est lié à l'ajout et
permet de déterminer la quantité initiale de chaque soluté.

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Comme l'ajout de la surcharge modifie les concentrations des solutés (élargissement des
pics), on corrige ce phénomène en travaillant en relatif par rapport à un autre pic, non
surchargé, du chromatogramme, ce qui a pour effet secondaire de minimiser les défauts de
reproductibilité des injections .Le résultat est obtenu en appliquant la relation :

Soit :

Ai : l'aire du pic du soluté i mesurée sur le chromatogramme de l'échantillon.


At : l'aire du pic du traceur mesurée sur le chromatogramme de l'échantillon.
A’i : l'aire du pic du soluté i mesurée sur le chromatogramme de l'échantillon après ajout de
mi gramme.
A’t : l'aire du pic du traceur mesurée sur le chromatogramme de l'échantillon après
ajout de mi gramme.
m :la masse de l'échantillon.

Toutefois, si la sensibilité de détection est suffisante, si les injections sont reproductibles et


qu'il est possible d'introduire l'ajout en solution, La formule de calcul est :

Cette méthode présente un intérêt considérable pour l'analyse des traces avec des
chromatogrammes très encombrés, ou les effets de matrice sont importants

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