Université Cadi Ayyad A.

U : 19-20
Ecole Supérieure de Technologie
Filière TIMQ
Safi
Techniques Chromatographiques & Spectroscopiques –TD-

Rappel de cours :

a- Rappeler les différents types de techniques chromatographiques ainsi que leurs

principes (le faire sous forme d’arborescence),
b- Rappeler les Grandeurs Fondamentales nécessaires lors d’une séparation en
chromatographie
c- Exercice d’application:
Le chromatogramme suivant montre la séparation de 2 solutés A et B :

Questions :
a- Déterminer, traduire et classer les paramètres suivants :
- Le nombre de plateaux théoriques « N ». Déterminer alors la hauteur
équivalente à un plateau théorique « HEPT »,
- Le facteur de sélectivité « α »,
- Le facteur de résolution « Rs ».
b- Que traduit le facteur de capacité « K’ » d’un soluté? Déterminer ce
facteur pour chaque soluté.

Exercice-1-
1 – L’allure d’un pic chromatographique suit une courbe de Gauss. Ce pic est
souvent caractérisé par les quatre paramètres tR, σ, δ et ω.
- Donner la signification de chacun de ces paramètres,
- Placer chacun d’entre-eux sur le pic ci-dessous en justifiant brièvement.

1
3 – Donner une formule permettant de calculer le facteur de résolution R entre deux
pics chromatographiques consécutifs. A partir de quelle valeur de R considère-
considère t’on que
ces deux pics sont bien séparés ?
4 – Un utilisateur inexpérimenté à injecté une quantité trop importante de composé
dans un chromatographe. Quelle sera l'allure du pic obtenu par rapport à un pic idéal qui
qu
serait parfaitement Gaussien ? Justifier en quelques lignes en expliquant de façon
qualitative ce qui se passe alors dans la colonne.

Exercice-2-
totalité des techniques chromatographiques fait appel à un phénomène de
1 – La quasi-totalité
partage entre 2 phases.
a- Définir ce qu'est ce coefficient de partage « K » et donner son expression.
b- Exemple : Le coefficient de partage de l'iode (I
( 2) entre les deux solvants non-
non
miscibles : tétrachlorométhane (CCl4) et eau (H2O),, est égal à 100 à 25 °C. À 10
mL de solution aqueuse d'iode à 10 g/L,
g/ on ajoute 10 mL de tétrachlorométhane.

Donnée : I2 est plus soluble dans le tétrachlorométhane que dans l'eau.

Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et
dans l'eau, après agitation et décantation.
2 – Donner une formule permettant de calculer le facteur de résolution entre deux pics
chromatographiques et l'appliquer au chromatogramme ci-après.
ci après. A votre avis, les deux
pics de ce chromatogramme sont-ils
sont bien résolus ? Pourquoi ?

2
Exercice-3- Une chromatographie d’une solution dans le THF (Tétrahydrofurane) d’un
mélange de polystyrènes de masses moléculaires connues sur une colonne (D.I=7.5mm,
(
L=300mm) dont le domaine de perméation s’étend de 400 à 30 000 daltons. La phase
éluante est
st du THF. Son débit est 1mL/min
c-1) Déterminer Vm
m (volume mort), Vrr (volume de rétention du dernier composé)
composé
et le volume de la phase stationnaire VS

c-2) Calculer la constante de partage K pour le composé à 3250 Da

3
Exercice- 4- Au laboratoire, un pilulier contient une poudre blanche. Ce pilulier se
trouve dans l’armoire où sont stockés deux médicaments tels que l’aspirine du Rhône, et
du Dafalgan (paracétamol). Comment identifier la poudre blanche ? Un élève propose de
faire une chromatographie sur couche mince.
Voir le résultat ci-dessous :
Poudre blanche : identification par CCM
* Dépôt P : paracétamol dans l’éluant
*Dépôt
Dépôt A : aspirine dans l’éluant
* Dépôt X : inconnu (poudre blanche dissoute dans l’éluant).
Chromatogramme sous UV

- Donner vos observations et conclure.

Exercice -5-:: chromatographie sur couche mince d’une huile essentielle

On effectue la chromatographie sur couche mince (CCM) de l’huile essentielle de peaux

d’oranges.

4
On réalise les dépôts suivants :
* Dépôt 1 : Limonène
* Dépôt 2 : Linalol
* Dépôt 3 : Citral
* Dépôt 4 : huile essentielle de peaux d’oranges.
La plaque est placée, verticalement, dans un fond d’éluant. Après élution et révélation,
on obtient le chromatogramme ci-dessous.
ci
1- Quelel est le rôle de l’éluant ?
2- Les espèces déposées sont incolores. Que doit faire l’expérimentateur pour révéler
le chromatogramme?
3-a- Quels sont les constituants de l’huile essentielle de peaux d’oranges ?
Justifier votre réponse.
3-b- Calculer le rapport
port frontal de chaque espèce chimique. Vérifier la réponse donnée
à la question 3-a-.

Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM)

( ) d'une protéine « p » par
chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et
400000 de MM.
L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons)
et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :

MM (Da) Ve (ml)

Dextran 2000000 45

Fibrinogène 340000 60

Catalase 230000 75

Lactoglobuline 19000 132

Questions :
1 - Rappeler la définition et l’expression littérale d’un volume mort.
mort Essayer de le
déterminer dans ce cas.

5
2 - La protéine « p » montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 mL.
m Déterminer
sa MM.

Exercice -7-: On détermine les temps de rétention (tr)

( ) au cours d'une
chromatographie d’exclusion,
d’exclusion, des protéines suivantes dont on connaît la masse
moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 mL / min) :

Protéine MM tr (min)

Aldolase 145000 10,4

Lactate déshydrogénase 135000 11,4

Phosphatase alcaline 80000 18,4

Ovalbumine 45000 26,2

Lactoglobuline 37100 28,6

1 – Rappeler le principe d’une chromatographie d’exclusion,

2- Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction
foncti
de Ve - Que remarquez-vous
vous ?
3 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du
graphique précédent. Existe-t-ilil une autre méthode pour déterminer la MM ?

Exercice-8- Sur une colonne HPLC (phase stationnaire : C18), 15cm x 4,6mm, remplie
de particules de 5mm, avec l’acétonitrile (CH3CN) comme phase mobile et à une
température de 30°C, on mesure un temps mort de 1,07 mn.

Dans ces conditions, on obtient la séparation ci-contre entre les 2 amphétamines :

Amphétamine (A): temps de rétention = 2,40 min, largeur du pic à mi-
mi hauteur d = 5 sec.

6
Methamphétamine (M):temps de rétention =2,85 min, largeur du pic à mi-hauteur d=6
sec.
1- Calculez le facteur de selectivité «α »
2- Calculez le facteur de résolution « Rs »
3- Évaluez le nombre de plateaux.

Exercice 9- On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-

lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des
-
groupements sulfonate (-SO3 ). Les pH isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-
leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C.

On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant

progressivement le pH à 7.
Questions :
1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les
interactions acide aminé-résine sont uniquement d'ordre électrostatiques).

Exercice 10 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de

cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements
carboxyméthyls (-CH2-COOH).
Questions :
1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement
aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des
radicaux carboxyméthyls est 4,76).

2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65)
et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ?
(On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre
électrostatiques).