TD Biochimie/Peptides et protéines

UMBB BIOCHIMIE
FS_Dept BIO TD n°3 : PEPTIDES et PROTEINES (2 ème
année SNV)

Exercice n°1
On propose un mélange de 3 peptides que l’on veut séparer par électrophorèse et par
chromatographie d’échange d’ions.
1- 2HN-Lys-Val-Gln-Lys-COOH
2- 2HN-Gly-Asp-Pro-Ala-Gln-COOH
3- 2HN-Ile-Trp-Met-Gly-Leu-COOH
Comment vont-ils migrer en électrophorèse a pH6 ?
Lequel de ces 3 peptides sera retenu par une résine anionique a pH8 ?
On donne pKNH2 = 9,5 pKCOOH = 2,5.
Exercice n°2
La séquence en acides aminés d’une hormone polypeptidique est :
2 HN-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-
Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Ala-Gly-Asp-Gln-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe-
COOH,
Quelles est la charge globale approximative a pH7 de l’hormone sachant que les valeurs de
pK des chaînes latérale (R) sont :
Ac. Amines : Arg Lys Tyr Cys His Glu Asp
pK : 12,48 10,53 10,9 8,3 6,0 4,25 4,2
+
Les pK des groupes terminaux NH3 et COOH sont de 7,8 et de 3,6 respectivement.
Exercice n°3
On obtient 3 amino-acide après hydrolyse acide d’un tétrapeptide forme d’acides
aminés différents. Que déduisez-vous ? La Lys obtenue après action de la carboxypeptidase.
Deux dipeptides A et B sont obtenus après action de la trypsine.
L4Asp et la Lys sont obtenus après hydrolyse acide de B.
Donner la séquence et la formule développe de ce peptide.
Exercice n°4
a) l’hydrolyse par la trypsine d’un peptide de 16 acides aminés donne les fragments suivants :
Ile-Met-Arg + Leu-His-Phe-Leu-Leu-Lys + Val-Met-Arg + Leu-Ile-Trp-Met
b) l’hydrolyse par la chymotrypsine de ce même peptide donne les fragments :
Leu-Leu-Lys-Ile-Met-Arg-Leu-Ile-Trp + Val-Met-Arg-Leu-His-Phe + Met libre.
Parmi les séquences ci-dessous laquelle est compatible avec les données précédentes.
1 Leu-Ile-Trp-Met-Val-Met-Arg-Leu-His-Phe-Leu-Leu-Lys-Ile-Met-Arg
2 Val-Met-Arg-Leu-His-Phe-Leu-Leu-Lys-Ile-Met-Arg-Leu-Ile-Trp-Met
3 Ile-Met-Arg-Leu-Leu-Lys-Val-Met-Arg-Leu-His-Phe-Leu-Ile-Trp-Met
4 Leu-His-Phe-Leu-Leu-Lys-Val-Met-Arg-Ile-Met-Arg-Leu-Ile-Trp-Met
5 Leu-Leu-Lys-Ile-Met-Arg-Leu-His-Phe-Val-Met-Arg-Leu-Ile-Trp-Met
Exercice n°5
L’analyse d’un peptide P révèle qu’il est formé de 6 acides aminés différents. La
carboxypeptidase détache de P l’acide aminé n°6 puis la Val. L’action de la trypsine sur P
libère un tétrapeptide A et un dipeptide B.
Le tétrapeptide A se termine par un acide aminé à groupement guanidique. Le dipeptide B
présente à son extrémité C terminale un acide aminé qui ne possède pas de carbone
asymétrique. Soumis à l’action du DNFB le peptide P libère DNP-acide aminé à fonction

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thiol, cet acide aminé joue un rôle important dans la stabilité de la structure tertiaire des
protéines. En présence de chymotrypsine, P donne un dipeptide C et un tétrapeptide D. O

La réduction de C par NaBH4, suivie d’hydrolyse libère ce Produit OH

NH2
HO
Le tétrapeptide D libère en présence de l’aminopeptidase de Glu. Donner la séquence de P
après justification de chaque résultat. Ecrire sa formule développée
Exercice n°6
Après broyage d’un tissu cellulaire, on a obtenu un mélange de 4 protéines de PM et
de pHi différents, dont les caractéristiques sont les suivantes :
P1 : PM1 = 20000 PHi = 3,5 P2 : PM2 = 35000 PHi = 5,7
P3 : PM3 = 18000 PHi = 4,2 P4 : PM4 = 22000 PHi = 4,8
1) on veut séparer ces protéines par chromatographie d’échange d’ions par ordre décroissant
des pHi. Choisir le type de résine qui convient à cette séparation, ainsi que le pH du milieu
nécessaire à cette élution. Donner l’ordre d’élution de ces protéines.
2) comment déterminer le nombre de chaîne(s) peptidique(s) qui compose(nt) une protéine ?
Exercice n°7
L’analyse d’une protéine complexe X montre qu’elle est formée de 3 chaînes
peptidiques différentes A, B, C ayant les caractéristiques suivantes :
A PM : 35000 pHi : 4,5
B PM : 40000 pHi : 6
C PM : 22000 pHi : 7
Les 3 chaînes peptidiques sont reliées entre elles par des ponts disulfures. Donner 2 procédés
de séparation et 2 techniques de purification adaptés à ces peptides. Donner leur principe et
les résultats obtenus.
Exercice n°8
Une protéine est étudiée en électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de
SDS avant et après oxydation performique. On calcule ainsi les masses moléculaires par
comparaison avec des protéines de masse moléculaire connue :
180000 pour la protéine avant oxydation ; après oxydation 2 composantes de masses
respectives 57000 et 33000 sont mises en évidence. Quelle est la constitution de cette
protéine en chaînes peptidiques ?
Exercice n°9
Un mélange de 3 hormones extraites de la glande pituitaire postérieure est déposé sur
une colonne échangeuse d’ions type carboxylate. Le chromatogramme obtenu après élution
par un tampon borate pH9 est donné ci-dessous :

(1) (2) (3)

ml ml

ml
25 50 75 Volume d’élution
a) la colonne est-elle échangeuse d’anions ou de cations ?
b) justifier l’ordre des pics d’élution obtenus à partir des formules des 3 peptides :
1) Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH2
S S
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2) Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-GlyNH2
S S
3) Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-GlyNH2
S S
Exercice n°10
a) Estimer la masse moléculaire d’une protéines dont l’image en microscope électronique
apparaître relativement sphérique avec un diamètre moyen de 63 Å, sachant que le volume
massique moyen est de 0,74 cm3/g.
b) on fait subir à cette protéine une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu SDS ;
le résultat obtenu est présenté ci-dessous.
Dépôt
SAB 67 kD

Chymo 27 kD
Protéine
Cyt c 12,5 kD
Dans la 1ère colonne, des marqueurs de poids moléculaire ont été déposés : sérum albumine
bovine (SAB), chymotrypsine (chymo) et cytochrome c oxydase (Cyt c).
Dans la 2ème colonne, on a déposé la protéine étudiée.
Que peut-on en conclure quant à la structure de la protéine ?
Tracer la courbe log d = f(log M), d et M représentant respectivement les distances de
migration et les masses moléculaires.
Exercice n°11
Afin de déterminer la masse moléculaire d’une protéine nouvellement isolée et
purifiée, celle-ci est déposée au sommet d’une colonne de gel séphadexe ainsi que 3
protéines, destinées à servir d’étalons, de masses moléculaires connues : la sérum albumine
bovine (SAB 67 kD), la β galactosidase (β gal 116 kD) et l’alcool déshydrogénase (ADH 150
kD). Après élution du mélange déposé, on obtient le diagramme ci-joint.
h

20 ml 29 ml
7,7 ml
16,7 ml

Volume d’élution
a) rappeler le principe de la chromatographie d’exclusion de gel.
b) sachant que le volume d’exclusion (volume d’élution d’une molécule non retardée) est Vo
= 5 ml, attribuer les pics à chacune des protéines du mélange et estimer la masse moléculaire
de la protéine inconnue.
On rappelle qu’en chromatographie d’exclusion de gel, le volume d’élution Ve et la masse
moléculaire M de la protéine sont reliés linéairement selon : Ve/Vo = a – b M
Exercice n°12
Une étude de solubilité de 2 protéines A et B dans différentes solutions de sulfate
d’ammonium de concentration croissante a conduit au graphique ci-après :
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Solubilité
(mg/ml)

A B [sulfate d’ammonium]
(M)
a) expliquer pourquoi une concentration important en sulfate d’ammonium entraîne la
précipitation des protéines.
b) comment peut-on exploiter les résultats du graphique ci-dessus pour séparer les 2
protéines A et B ?
Exercice n°13
Dans le but de déterminer la structure primaire d’un peptide A, on réalise les
expériences suivantes :
a) l’action du DNFB suivie d’hydrolyse acide totale permet d’obtenir un mélange
équimoléculaire de Arg, DNP-Asp, Cystine, Gly, Glu, DNP-Leu, Lys, Met, Tyr et Val.
b) après action du β mercaptoéthanol on obtient 2 peptides B et C.
c) l’action de la chymotrypsine sur B libère de la valine.
d) l’action de la trypsine :
- sur B donne 2 tripeptides dans lesquels on identifie après séparation, action du DNFB et
hydrolyse totale DNP-Leu pour l’un et DNP-Cys pour l’autre.
- sur C donne un dipeptide et un tripeptide dans lequel on identifie DNP-Asp après action du
DNFB et hydrolyse acide.
e) l’action du bromure de cyanogène (BrCN) sur C permet d’isoler du glutamate.
Donner les structures de B, C et A
Exercice n°14
La corticotropine (ACTH) extraite du lobe antérieur de l’hypophyse est un peptide
dont la séquence primaire est :
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Lys-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-
Lys-Val-Tyr-Pro-Asp-Gly-Ala-Glu-Asp-Gln-Leu-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe.
a) indiquer quels seront les produits obtenus par action de la trypsine sur l’ACTH et préciser
quel sera l’ordre de migration des peptides obtenus lors d’une chromatographie d’élution
avec gradient de pH croissant sur colonne de type carboxylate.
b) on marque l’ACTH par action d’iodure marqué 125I. Indiquer le mode d’action de ce
réactif.
Après action de la trypsine sur le peptide marqué, on sépare les produits obtenus par
chromatographie ; un comptage de la radioactivité permet de mettre en évidence 2 fractions
radioactives B et C ; à quels peptides correspondent-elles ?
c) ces 2 peptides B et C sont ensuite analysés par électrofocalisation sur gel de
polyacrylamide suivie d’autoradiographie ; 2 expériences sont réalisées sur chaque peptide,
l’une (1) avant, l’autre (2) après action de la carboxypeptidase B. les résultats obtenus sont
les suivants : (+)
C1 C2

Donner les structures de B et C. B2

B1
Déduire du résultat obtenu le rôle de la carboxypeptidase B

(-)
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