SUJET B : Mtabolisme - Enzymologie

(44 points)

Des mdecins tudient les consquences dune dficience en une enzyme, lhexokinase, sur la physiologie de patients atteints dune maladie hrditaire. 1. (3 pts) Quelle est la raction catalyse par cette enzyme ? Ecrire tous les ractants et produits sous forme semi-dveloppe, pH7. Glucose + ATP Glucose-6-P + ADP

LATP doit tre reprsent galement sous forme dveloppe, sous sa forme 4- (3accept) et ADP sous sa forme 3- (2- accept) 2. (2 pts) Le principal produit de la raction est un carrefour mtabolique, dpart de plusieurs voies mtaboliques diffrentes. Citer le nom de deux de ces voies mtaboliques, leurs produits finaux et les types cellulaires dans lesquels elles ont lieu. Rponses acceptes : - glycolyse produit final : pyruvate (tous types cellulaires) - noglucogense produit final : glucose (pplment foie et aussi les reins) - biosynthse du glycogne produit final : glycogne (foie, muscles) 3. (12 pts) Les ractions ci-dessous, menant la synthse de 2,3-bisphosphoglycrate (2,3-BPG), correspondent un dtour dune des voies mtaboliques cites prcdemment.

3.1. Quelle est cette voie ? La dtailler en crivant la succession des ractions qui la compose (indiquer seulement les noms des ractants et des enzymes). Donner son bilan en ATP et en pouvoir rducteur. Sur 6 pts rponse : La glycolyse
1. Glucose + ATP 2. Glucose-6-P Glucose-6-P + ADP Fructose-6-P hexokinase Phosphoglucoisomerase

Fructose-1,6-bis-P + ADP Phosphofructokinase (PFK) Dihydroxyactone-P (DHAP) + Glycraldhyde-3-P aldolase 5. DHAP Glycraldhyde-3-P Triose phosphate isomrase 6. Glycraldhyde-3-P + NAD+ +Pi 1,3-bisphosphoglycrate + NADH,H+ Glycraldhyde-3-P dehydrognase 7. 1,3-bisphosphoglycrate + ADP 3-phosphoglycrate + ATP Phosphoglycrate kinase 8. 3-phosphoglycrate 2-phosphoglycrate phosphoglycrate mutase 9. 2-phosphoglycrate Phosphoenolpyruvate (PEP) Enolase 10. Phosphoenolpyruvate + ADP Pyruvate (Pyr) + ATP Pyruvate kinase

3. Fructose-6-P + ATP 4. Fructose-1,6-bis-P

bilan nergtique : 2 moles ATP et 2 moles de NADH,H+ formes / mole de glucose 3.2. Indiquer les tapes qui conduisent une phosphorylation lie au substrat. tapes 7 et 10 1 pt

3.3 Quelles sont les trois tapes cl de cette voie mtabolique ? Justifier votre rponse 2 pts tapes 1, 3 et 10. Etapes pour lesquelles le G est trs ngatif et qui sont donc considres comme irrversibles dans les conditions cellulaires. Ces tapes constituent la force motrice de la glycolyse et elles seront les points cls de la rgulation de la glycolyse. 3.4. Quels sont les deux principaux destins du produit final chez lhomme, et dans quelles conditions ? 2 pts - oxydation complte du pyruvate en CO2, dans la mitochondrie (CK), en conditions arobies - fermentation du pyruvate en lactate en condition anarobie (ex : muscle en exercice intense) 3.6. Quen est-il dans les hmaties ? (1 pt) uniquement fermentation lactique car absence de mitochondrie dans les GR

4. (4 pts) Pour lucider lorigine de la dficience en hexokinase chez ces patients, des biologistes effectuent une purification de lhexokinase de cellules dun sujet normal et de cellules dun sujet malade, associe un dosage de protines, dont les rsultats sont rassembls dans le tableau 1, ci-dessous : Tableau 1 : dosage des protines Extrait cytoplasmique de cellules de sujet normal 30 mg de protines 1,2g de protines Extrait cytoplasmique de cellules de sujet malade 30 mg de protines 1,2g de protines

Avant purification Aprs purification (enzyme pure)

4.1. Proposer une stratgie de purification de lhexokinase (2 pts)

on attend des tudiants quils ressortent des exemples vus en TD ou TP qqs exemples qui pourront tre cits: prcipitation au sulfate dammonium (mme si pas trs appropri) filtration sur gel chromatographie dchange dions chromatographie daffinit en dtaillant le principe 4.2. Commenter les rsultats du tableau. Que pourront en conclure les mdecins ? (2 pts) pas de diffrence entre le sujet sain et le sujet malade. La dficience enzymatique nest pas attribuable une variation de la quantit denzyme prsente dans les tissus examins. 5. (10 pts) Les mdecins entreprennent une tude enzymatique sur les prparations purifies dhexokinase. Le tableau 2, ci-dessous, donne les vitesses initiales de la raction enzymatique catalyse par lhexokinase pour diffrentes concentrations de substrat [S], dans le cas dun sujet sain et dun sujet malade. Le test enzymatique a t effectu dans 2 ml de volume ractionnel, avec 100 l de la solution denzyme purifie, dilue 10 fois. Tableau 2 : dosage enzymatique de lhexokinase [S] (mM) Sujet sain V0 (mM.mn-1) Sujet malade V0 (mM.mn-1) 0,5 0,45 0,1 1 0,75 0,15 1,5 0,9 0,22 2 1,2 0,3 3 1,7 0,45 4 2,1 0,5 8 2,4 0,6 16 2,4 0,6

5.1. Donner la dfinition et la signification des paramtres Vmax et Km. (2 pts) Km = [S] pour laquelle la raction atteint la moiti de sa vitesse maximale. La valeur de Km traduit laffinit de lenzyme pour le substrat (plus la valeur de Km est faible, meilleure est laffinit) Vm = vitesse maximale. Cette valeur est atteinte lorsque toute lenzyme est sature en substrat et donc quand [ET] = [ES] Vm =Kcat x [ET] pour une concentration donne en enzyme, la Vm traduit lefficacit cintique de lenzyme (kcat= la constante catalytique) La dtermination des paramtres Km et Vm permet de calculer le rapport Kcat/Km qui traduit lefficacit catalytique dune enzyme pour un substrat donn 5.2. Sans construire la courbe, dterminer les valeurs de Vmax et Km, dans le cas dune hexokinase de sujet sain et de sujet malade. (2 pts) Sujet sain : Sujet malade : Vm = 2,4 mM.mn-1 Vm = 0,6 mM.mn-1 Km = 2 mM Km = 2 mM

5.3. Que pouvez-vous en conclure ? (2 pts)

Les rsultats montrent que lhexokinase du sujet malade prsente une efficacit catalytique (ou cintique) nettement infrieure (facteur 4) celle du sujet sain. Le Km ntant pas modifi, laffinit de lenzyme nest pas modifie. Le petit plus : La dficience enzymatique est vraisemblablement le rsultat dune mutation gntique affectant un acide amin du site actif de lenzyme qui intervient dans la catalyse. Cette mutation naffecte pas la liaison au substrat. 5.4. Donner la dfinition de lactivit enzymatique (AE) dune enzyme. Calculer lactivit enzymatique de 1 ml de la solution dhexokinase, non dilue, du sujet malade (dtailler vos calculs). 4 pts Activit enzymatique : caractrise le pouvoir catalytique dune solution enzymatique, elle est exprime en nanokatal. Un nanokatal correspond lactivit dune solution enzymatique qui catalyse la transformation dune nanomole de substrat en une seconde (dans les conditions optimales de T et pH, conc des substrats) Calcul : AE = 0,6 10-3 x 2x10-3 x 109 / 60 10 fois AE = 20 x 10 / 0,1 = 2000 nkatals 1 pt pour la dfinition, 3 pts pour le calcul 6. (2 pts) Sachant que la voie de synthse du 2,3-BPG (cf. parag. 3) a lieu uniquement dans les hmaties, quelles sont les consquences physiologiques prvisibles dune dficience en hexokinase ? Ils doivent tre capables de faire le lien avec lhmoglobine Sachant que le 2,3-BPG est un inhibiteur allostrique de lhmoglobine, une dficience en hexokinase aura des rpercussions sur la synthse du 2,3-BPG, et donc sur la courbe de saturation de Hb. La consquence possible sera une libration moindre de lO2 dans les tissus consommateurs (dplacement de la courbe vers la gauche, diminution de la P50, augmentation de laffinit Hb pour O2). 2pt = 20 nmol.sec-1 pour 100 l denzyme dilue

(suite du sujet B) Exercice dapplication

1. (5 pts) Quelle quantit dATP, exprime en moles, une cellule musculaire peut-elle produire : 1.1. en condition arobie partir : a- dune mole de glucose 38 moles ATP 1Glc 2 Pyr (2ATP + 2NADH,H+) 2 pyr 2 acetyl-CoA (2 NADH,H+) (6NADH,H+ + 2GTP (=2ATP) + 2FADH2) 2 acetyl-CoA 2CO2 2 pts au total Rq : dans le cours, je leur ai donn une fourchette de valeurs : 30 36 et 38 ATP, donc si pas de dtail fourni, vous pouvez accepter ces valeurs et donner 0,5 pt par ex) b- dune mole dacide gras palmitique (C16) (donner seulement lordre de grandeur)
environ 130 moles ATP

1 pt

1.2. en condition anarobie prolonge partir : a- dune mole de glucose 2 moles ATP 1 Glc 2 Pyr 2 ATP + 2 NADH,H+ 2 pyr 2 lactate - 2 NADH, H+ 1 pt b- dune mole dacide gras palmitique (C16) 0 moles ATP car la b-oxydation des AG est exclusivement arobie 1 pt Vous justifierez vos rponses, uniquement pour le calcul partir dune mole de glucose, en indiquant notamment le nombre de moles de coenzyme rduit formes. Vous utiliserez les valeurs P/O suivantes : 2 moles ATP formes par mole de FADH2 re-oxyd et 3 moles ATP formes par mole de NADH,H+ re-oxyd (quelle que soit son origine cytosolique ou mitochondriale) 2. (6 pts) Un fragment de muscle squelettique humain dans lequel une lectrode a t implante est plong dans une solution physiologique contenant du glucose. Lorsquil est stimul par un courant lectrique, le fragment de muscle consomme 76 moles dATP par minute. La concentration initiale en glucose de la solution physiologique est de 3,6 g/L. Le volume total est de 10 ml. Dans ces conditions exprimentales, tout lATP consomm par le fragment de muscle provient uniquement de loxydation du glucose prsent dans la solution physiologique, en condition arobie. En vous aidant des rsultats des questions prcdentes, dterminer le temps ncessaire pour que la quantit de glucose prsente dans la solution initialement soit totalement puise. Dtailler votre raisonnement et vos calculs.

Donne fournie : la masse molaire du glucose est de 180 g/mol Quantit de glucose prsente dans la solution physiologique : 3,6 x 10-2 g Nombres de moles de glucose dans la solution physiologique : 3,6x10-2 g/180 = 2 x 10-4 moles Nombre dATP produit partir du glucose (en condition arobie 1 mole de glucose va permettre la synthse de 38 moles dATP) : 2x10-4 x 38 = 76 x 10-4 moles Temps dpuisement du glucose : 76 x 10-4 moles / 76x 10-6 moles = 100 min soit 1h 40 min

6 pts (ajuster les points en fonction du raisonnement)