UNIVERSITE HASSAN II – CASABLANCA Année Universitaire 2019-2020

FACULTE DES SCIENCES BEN M’SIK

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
CASABLANCA

TD D’ENZYMOLOGIE (S4)

Exercice 1
L’étude de la cinétique d’une réaction enzymatique montre que pour une concentration de
substrat égale à 50µg/mL, la vitesse de la réaction est la moitié de la vitesse maximum. Est-il
possible à partir de ces données de déterminer la constante de Michaelis ? On donne le
PMsubstrat = 200

Exercice 2
Vous trouverez ci-dessous les résultats de l’analyse de l'activité d'une enzyme :

[S] (mol/L) v (mM/min)

5 x 10-2 0,25

5 x 10-3 0,25

5 x 10-4 0,25

5 x 10-5 0,2

5 x 10-6 0,07

5 x 10-7 0,01

Sans faire de graphe, déterminez :

a) la constante Vmax;
b) la constante Km;
c) la vitesse initiale à [S] de 1 x 10-1 M;
d) la quantité de produit formé au cours des 5 premières minutes à une [S] de 2 x 10-3M.
À une [S] de 2 x 10-6M?
e) Km et Vmax quand on augmente la [E] d'un facteur 4?

Exercice 3
Soit une enzyme à cinétique michaélienne. Les vitesses initiales (exprimées en µmoles de
produit formées par minute et par millilitre de milieu réactionnel) en fonction de
concentrations variables en substrat sont données dans le tableau suivant :
 [S] (10-2M) Vi (µmoles/min.mL)

1,25 33,5

1,80 41,5

2,50 50

4 62,5

8 77

- Déterminer avec une méthode graphique précise les constantes cinétiques de cette
enzyme. Exprimer-les en molarité.
- A concentration saturante en substrat :
- Quelles seraient les valeurs de ces constantes cinétiques si on doublait la quantité de
l’enzyme ? Expliquer.
- Quelle serait la concentration de l’enzyme libre ? Expliquer.
- Donner la concentration du produit après 3min de réaction ?
- Les réactions enzymatiques sont effectuées dans un tube dont la concentration en
protéines est de 0,2mg/mL. Calculer l’activité spécifique.
- Sachant que le taux de pureté de l’enzyme est de 40%, déterminer la constante
catalytique de l’enzyme.
- On donne PME = 40 000

Exercice 4
L’invertase catalyse la réaction d’hydrolyse du saccharose en glucose et fructose. On veut
déterminer l’influence de la concentration en enzyme sur la vitesse de réaction : on ajoute à
un mélange comprenant 1 mL de tampon pH 7,0 et 1 mL de substrat à concentration saturante
1 mL de solution d’invertase pure de concentration variable. On mesure la quantité de produit
apparu en fonction du temps :

Glucose apparu (µmole/ml)

[E] Temps (min)

10-6M
2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20

1 0,8 1,5 2,5 3,3 4,1 5,0 5,8 6,6

3 2,9 5,8 8,7 11,5 14,4 16,8 18,4 19,5

5,6 5,0 10,0 15,0 17,8 19,5 21,0 21,7 22,0

1. Tracer les courbes P = f (temps) et commenter

2
 2. Calculer la vitesse initiale vi exprimée en µmoles/ml de glucose apparues par min pour
chaque concentration d’enzyme. Tracer la courbe vi = f([E]) et donner vos
interprétations des résultats.
3. Calculer la constante Kcat (k+2) de l’invertase ainsi que son activité spécifique sachant
que sa masse molaire est de 250 000.

Exercice 5
La lactate déshydrogénase (E.C.1.1.1.27) catalyse la déshydrogénation du lactate. Son activité
peut être appréciée par spectrophotométrie à 340 nm.
1. Ecrire l’équation de la réaction catalysée par la LDH. Donner le nom de la substance
dosée à 340 nm et préciser l’évolution de l’absorbance à cette longueur d’onde lorsque
le substrat de la réaction est le lactate. Justifier.
2. L’activité de la LDH peut être modifiée par action de l’oxalate. Des expériences
effectuées en présence d’une même quantité de LDH, mais avec des concentrations
croissantes de lactate, donnent les résultats suivants :

Concentration en lactate vi en absence d’oxalate vi en présence d’oxalate

dans le milieu réactionnel (unité arbitraire) (unité arbitraire)
(mol/L)

2,5 x 10-3 0,0166 0,0100

5,0 x 10-3 0,0250 0,0166

7,5 x 10-3 0,0298 0,0215

10,0 x 10-3 0,0333 0,0250

Tracer, sur papier millimétré, les courbes 1/ v0i = f(1/[S])

En déduire le mode d’action de l’oxalate sur la LDH. Justifier la réponse

Exercice 6
Le foie du rat contient deux enzymes, l’hexokinase (HK) et la glucokinase (GK), capables de
phosphoryler le glucose en présence de Mg2+ suivant la réaction :
Glucose + ATP  Glucose-6-phosphate + ADP

On mesure la vitesse initiale (V1 pour HK, V2 pour la GK et V représente l’activité

Phosphorylante totale en fonction de la concentration en glucose. Les résultats, exprimés en
UI par g de foie, sont reportés dans le tableau ci-dessous.

Glucose 0,05 0,1 0,5 1 5 10 15 150 500 1500

mM
V1 (HK) 0,10 0,15 0,23 0,29 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30
V2 (GK) 0,01 0,01 0,03 0,06 0,25 0,50 0,60 1,00 1,00 1,00
V = V1 + V2 0,11 0,16 0,26 0,35 0,55 0,80 0,90 1,30 1,30 1,30

- Déduire de ce tableau les constantes cinétiques Km et Vmax des deux enzymes.

3
 - Sachant que la concentration intracellulaire hépatique de glucose est de 5 mM,
calculer en pourcentage de Vmax, les vitesses initiales des réactions catalysées par les deux
enzymes.
- On mesure l’activité phosphorylante totale V en présence de glucose-6-phosphate
(G-6-P) à la concentration de 5 mM. On obtient les résultats suivants :
- pour [glucose] = 0,5 mM, V = 0,03 UI/g
- pour [glucose] = 150 mM, V = 1,00 UI/g
Qu’en déduisez-vous ?
- La cinétique de l’HK en absence ou en présence de G-6-P donne les résultats suivants
en représentation de Lineweaver-Burk :

Qu’en déduisez-vous ?

4
 Vous trouverez ci-dessous la correction de la fin du TD d’enzymologie. J’ai repris en
correction également l’exercice 4 pour bien préciser certaines notions importantes. J’ai
également joint à la correction certains rappels de cours à chaque fois que c’est
nécessaire.
Bon travail et faites attention à vous.
Mme Souhaili

5
 CORRECTION

Exercice 4

1- Les courbes [P] = f(temps) représentent les cinétiques d’apparition du produit.

Rappel cours

Dans la courbe de cinétique [P] = f(temps) on observe trois parties :

• Une première partie qui peut être assimilée à une droite. La quantité de produit formé est proportionnelle au
temps donc la vitesse de la réaction est constante parce que la concentration en substrat est très grande par
rapport à la concentration en enzyme. Cette partie correspond à la phase stationnaire.
• Une deuxième partie qui correspond à un ralentissement de la formation du produit dans le temps
• Un plateau correspondant à l’arrêt de la production de produit car la réaction a atteint l’équilibre

Ce type de graphique permet de calculer la vitesse initiale de la réaction, exprimée en µmol/min.litre. Elle est
calculée en prenant la tangente à l’origine qui est une droite et dont la pente donne la vitesse initiale. (Pour rappel :
pente = (YB – YA)/(XB – XA).

Remarque : La courbe de cinétique [P] =f(temps) présente en générale la même allure que la courbe de saturation
vi = f([S]). Donc il faut faire attention à ne pas les confondre

Les 3 courbes suivantes représentent la cinétique d’apparition du glucose en fonction du temps sous l’effet de l’invertase :

• Pour la courbe 1, à la [E] = 10-6 l’apparition du glucose est proportionnelle au temps pendant toute la durée de la
mesure de l’activité enzymatique. A cette concentration en enzyme la phase stationnaire dure au moins 20 min.

• Pour la courbe 2 à la [E] = 3 10-6, on observe 2 parties :

o Une partie qui correspond à une droite où l’apparition du glucose est proportionnelle au temps : c’est la
phase stationnaire qui dure 12,5 min

o A partir de 12,5 min, on note un infléchissement de la courbe qui correspond à un ralentissement de la

formation du glucose dans le temps

• Pour la courbe 3, à la [E] = 5,6 10-6, on observe également 2 parties :

6
 o Une partie qui correspond à une droite où l’apparition du glucose est proportionnelle au temps : c’est la
phase stationnaire qui dure 7,5 min

o A partir de 7,5 min, on note un infléchissement de la courbe qui correspond à un ralentissement de

la formation du glucose dans le temps. A la fin de la réaction (entre 17,5 min et 20 min) on observe
un grand ralentissement de la formation du glucose qui montre que la réaction a presque atteint
l’équilibre.

• On note que plus la [E] augmente, plus la durée de la phase stationnaire est courte ; quand on augmente la [E], le
substrat est transformé plus rapidement et on arrive plus rapidement à une phase où la concentration en glucose
n’est plus très grande par rapport à la [E].

7
 2- Calcul des vitesses initiales

[E] = 10-6

YB1 −YA1
vi = YB1 = 5,8 µmoles/ml YA1 = 5 µmoles/ml XB1 = 17,5 min XA1 = 15 min
XB1 −XA1

5,8 − 5
𝑣𝑣𝑖𝑖 =
17,5 − 15

vi = 0,32 µmoles/min.ml

- [E] = 3.10-6
YB2 −YA2
vi = YB2 = 14,4 µmoles/ml YA2 = 11,5 µmoles/ml XB2 = 12,5 min XA2 = 10 min
XB2 −XA2

14,4 − 11,5
𝑣𝑣𝑖𝑖 =
12,5 − 10

vi = 1,16 µmoles/min.ml

- [E] = 5,6.10-6
YB3 −YA3
vi = YB3 = 10 µmoles/ml YA3 = 8 µmoles/ml XB3 = 5 min XA3 = 4 min
XB3 −XA3

10 − 8
𝑣𝑣𝑖𝑖 =
5−4

vi = 2 µmoles/min.ml

Remarque : Il est indiqué dans l’énoncé que les mesures des activités enzymatiques sont effectuées dans des conditions de
concentration saturante en substrat ; donc les vitesses initiales mesurées correspondent à des vitesses maximales.

Tracé de la courbe vi = f([E]

[E] (10-6M) 1 3 5,6

Activités enzymatiques 0,32 1,16 2

(µmoles/min.ml)

8
La courbe obtenue est une droite donc l’activité enzymatique (Vmax) est proportionnelle à la [E]. Il existe une relation
entre la Vmax et la [E] :

Vmax = k+2 [E]

qui montre bien la proportionnalité entre la Vmax et la [E]. Mais cette relation n’est vraie que si les mesures des activités
enzymatiques sont faites à concentration saturante en substrat (ce qui est bien précisé dans l’énoncé)

- Calcul de la constante catalytique

Vmax
Vmax = k+2 [E] donc k +2 =
[E]

Si on prend Vmax = 2 µmoles/min.ml et [E] =5,6.10-6M

Il faut effectuer une conversion pour utiliser les mêmes unités :

9
 Vmax = 2000 µmoles/min. litre

= 2000 µM/min

= 2.10-3M/min

2.10−3 M/min
Donc k +2 = = 357 min-1
5,6.10−6 M

k+2 = kcat= 357 min-1

Remarque : k+2 ou kcat correspond à l’activité moléculaire spécifique c'est-à-dire le nombre de molécules de
substrat transformé ou de produit formé par une molécule enzymatique. k+2 constitue une caractéristique d’une
enzyme dans des conditions expérimentales déterminées (température, pH, tampon…). Elle peut être calculée à
partir de la Vmax et de [E]totale comme l’exemple de cet exercice ou bien à partir de l’activité spécifique, du poids
moléculaire de l’enzyme et de degré de pureté de l’enzyme (Exemple de l’exercice 3).
En utilisant k+2 et la constante d’affinité KM (constante de Michaelis) on peut déterminer l’efficacité d’une
enzyme par le rapport k+2 / KM.

Exercice 5

1- La réaction catalysée par la lactate déshydrogénase (LDH) est la suivante :

Lactate Pyruvate

La substance dosée à 340nm correspond au NADH. L’enzyme transforme le lactate en pyruvate en utilisant le NAD+ qui
se transforme en NADH qui absorbe la lumière à 340nm.

Remarque : Dans cette réaction une molécule de lactate est transformée en une molécule de pyruvate et en même temps
une molécule de NADH est formée. Donc en mesurant la concentration de NADH, nous pourrons mesurer en même temps
la concentration du substrat transformé ou du produit formé. Il suffit d’utiliser la loi de Beer-Lambert

2- Pour trouver le mode d’action de l’oxalate sur la LDH, on doit tracer sur le même graphe les courbes 1/vi =
f(1/S) en absence et en présence d’oxalate pour déterminer les valeurs de KM et Vmax et pouvoir en déduire l’effet
de l’oxalate sur l’enzyme.

10
Rappel cours : Détermination graphique des paramètres cinétiques KM et Vmax

Une première méthode consiste à tracer le graphique représentant les vi en fonction des concentrations en
substrat [S] utilisé. D’après l’équation de Michaelis, on peut en effet déduire que vi se rapproche asymptotiquement
de Vmax lorsque [S] augmente.

Vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat

La détermination graphique de l’asymptote, et donc de KM et Vmax est peu précise.

Par ailleurs, lorsque [S] = KM, vi est égale à Vmax/2. On peut donc déterminer graphiquement Vmax, puis KM (voir graphique).
La difficulté vient du fait que la détermination graphique d’une asymptote est une nécessairement imprécise, entrainant
des erreurs dans la détermination de KM et Vmax.
Pour améliorer la précision de la détermination graphique de ces deux constantes, il existe des représentations graphiques
qui linéarisent les résultats, permettant des extrapolations plus précises.
La méthode la plus connue est celle de Lineweaver et Burk dans laquelle on représente 1/vi=f(1/[S]).
𝑣𝑣𝑖𝑖 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆]
=
𝐾𝐾𝑀𝑀 +[𝑆𝑆]

1 𝐾𝐾𝑀𝑀 + [𝑆𝑆]
↔ =
𝑣𝑣𝑖𝑖 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆]
1 𝐾𝐾𝑀𝑀 [𝑆𝑆]
↔ = +
𝑣𝑣𝑖𝑖 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆] 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆]
1 𝐾𝐾𝑀𝑀 1 1
↔ = +
𝑣𝑣𝑖𝑖 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 [𝑆𝑆] 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
1 1 𝐾𝐾𝑀𝑀
On reconnaît une équation de droite de type = 𝑎𝑎 + b avec 𝑎𝑎 = ce qui correspond à la pente de la droite et
𝑣𝑣𝑖𝑖 [𝑆𝑆] 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
1
𝑏𝑏 = ce qui correspond à l’ordonnée à l’origine :
𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚

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 Représentation de Lineweaver et Burk
e point correspond à une mesure de vi pour une concentration en substrat [S] donnée. Les intersections avec les axes permettent de
déterminer graphiquement KM et V .

Cette représentation permet donc, à partir des mêmes données que précédemment, de déterminer graphiquement les
valeurs de Vmax et de KM plus précisément qu’avec la représentation précédente.

- Tableau des valeurs de vi en fonction des concentrations de substrat

[S] 1/[S] vi en absence 1/vi en absence vi en présence 1/vi en présence

(10-3M) (10+3M-1) d’oxalate (unités d’oxalate (unités d’oxalate (unités d’oxalate (unités
arbitraires) arbitraires) arbitraires) arbitraires)

2,5 0,40 0,0166 60,24 0,0100 100

5,0 0,20 0,0250 40 0,0166 60,24

7,5 0,133 0,029 34,48 0,0215 46,51

10 0,100 0,0333 30,03 0,0250 40

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Les courbes 1/vi = f(1/[S] se rencontrent en un point qui correspond à 1/Vmax. L’enzyme garde la même vitesse maximale
en présence d’oxalate

1/Vmax = 20(unités arbitraires)-1

Vmax = 0,5 unité arbitraire

En absence d’oxalate :

-1/KM = -0,2.10+3M-1

1/ KM = 0,2.10+3M-1

KM = 5.10-3

En présence d’oxalate :

-1/KM = -0,1.10+3M-1

1/ KM = 0,1.10+3M-1

KM = 10-2

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 La valeur du KM est multipliée par 2, donc l’affinité est diminuée de moitié. On peut conclure que l’oxalate exerce un
effet inhibiteur sur l’activité de la LDH ; c’est un inhibiteur compétitif (Vmax constante, KM augmente).

Rappel cours :

Les inhibiteurs enzymatiques soit sur le KM seul (inhibiteur compétitif), soit sur la Vmax (inhibiteur non compétitif) ou
bien sur le KM et la Vmax en même temps (inhibiteur incompétitif). Les effets des inhibiteurs augmentent en fonction de
leur concentration

- Dans le cas d’un inhibiteur compétitif, plus la [I] augmente, plus la valeur du KM augmente.

- Dans le cas d’un inhibiteur non compétitif, plus la [I] augmente, plus la valeur de Vmax diminue

- Dans le cas d’un inhibiteur incompétitif, plus la [I] augmente, plus les valeurs de Vmax et de KM diminuent
(affinité augmente et l’activité diminue)

Pour un inhibiteur compétitif, le KI correspond à la [I] qui entraine une augmentation du KM d’un facteur de 2. Dans
l’exercice ci-dessus la [oxalate] utilisée correspond au KI car cette concentration a provoqué la diminution de l’affinité
(K’M = 2 KM)

Pour un inhibiteur non compétitif, le KI correspond à la [I] qui diminue de moitié la valeur de Vmax (V’max= Vmax /2).

Pour un inhibiteur incompétitif, le KI est égal à la [I] qui diminue la valeur de KM et de moitié la valeur de Vmax.

Par ailleurs les valeurs de KI peuvent être calculées à partir des équations suivantes :

- Inhibition compétitive

𝐼𝐼
𝐾𝐾 ′ 𝑀𝑀= 𝐾𝐾𝑀𝑀 (1 + ) K’M étant la constante de Michaelis en présence de l’inhibiteur.
𝐾𝐾𝐼𝐼

- Inhibition non compétitive

𝑉𝑉 ′ max = 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 V’max étant la vitesse maximale en présence de I

𝐼𝐼
1+
𝐾𝐾𝐼𝐼

- Inhibition incompétitive

𝐾𝐾𝑀𝑀 𝑉𝑉𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
𝐾𝐾𝑀𝑀′ = 𝐼𝐼 et 𝑉𝑉′𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 = 𝐼𝐼
1+ 𝐾𝐾 1+ 𝐾𝐾
𝐼𝐼 𝐼𝐼

Exercice 6

1) D’après le tableau, les vitesses initiales augmentent avec l’augmentation de la [Glucose] pour se stabiliser à une valeur
fixe qui correspond la Vmax :

- Pour l’hexokinase Vmax = 0,3UI/g

La valeur de KM correspond à la concentration en substrat qui donne une vi = Vmax/2

Vmax/2 = 0,15 UI/g de foie

On obtient vi = 0,15UI/g à la [Glucose] = 0,1mM donc KM = 0,1mM

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 - Pour la glucokinase Vmax = 1UI/g de foie

Vmax/2 = 0,5UI/g de foie donc KM = 10mM

2) La concentration intracellulaire du glucose est de 5mM :

- Pour l’hexokinase : à 5mM l’enzyme possède, d’après le tableau, une vi = 0,3UI/g de foie ; cela représente 100%
de son activité maximale

- Pour la glucokinase : à 5mM l’enzyme possède, d’après le tableau, une vi = 0,25UI/g de foie ; cela représente
25% de son activité maximale.

o On mesure l’activité phosphorylante totale mais en présence de glucose-6-phosphate qui est le produit
de la réaction. A la de glucose de 0,5mM, on obtient une vitesse de 0,03UI/g. D’après le tableau cette
valeur correspond uniquement à l’activité de la glucokinase. A concentration saturante en substrat c’est-
à dire [glucose]= 150mM la vi = 1UI/g. Là aussi on ne mesure que l’activité de la glucokinase. Tout se
passe comme si en présence de G-6-P (le produit de la réaction) seule l’activité de la glucokinase est
détectée et que le G-6-P agirait comme un inhibiteur de l’activité de l’hexokinase.

o La représentation de lineweaver-Burk de la cinétique de l’hexokinase en présence du G-6-P montre bien

que ce dernier exerce un effet inhibiteur sur cette enzyme en diminuant la Vmax mais n’a pas d’effet sur
le KM. Donc le G-6-P est bien un inhibiteur de type compétitif.

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