Licence 3

Biochimie, Génétique, Biologie Cellulaire

UE: Biochimie Métabolique, Métabolomique et Enzymologie

Travaux Dirigés de l’ECUE:

Enzymologie
Dr KOFFI Djary Michel
Dr KOUA Gisèle
Dr DOUE Ginette
Dr OTCHOUMOU Athanase
Dr CISSE Mariame

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Rappels
Activités enzymatiques
 Activité enzymatique : rapport de la quantité de substrat transformé ou de produit formé par unité de
temps.

 Exprimée en Unité Internationale (UI) c’est-à-dire µmol de substrat transformé ou de produit formé par
minute.

 Activité spécifique est alors exprimée en UI / mg de protéines soit µmol de substrat transformé ou de produit
formé par minute et par mg de protéines.

 Concentration d’activité catalytique qui est alors exprimée en UI / L d’enzyme c’est-à-dire µmol de substrat
transformé ou de produit formé par minute et par Litre (mL ou cm3) d’enzyme.

 Activité moléculaire ou molaire spécifique exprimée en UI / mol d’enzyme c’est-à-dire µmol de substrat
transformé ou de produit formé par minute et par µmol d’enzyme ou sec-1 (le plus souvent) ou min-1.

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 Exercice 1 Notion d’ordre d’une réaction chimique

Soit la réaction chimique, A + B C + D

La vitesse de la réaction est donnée par la relation:

v= = =

[A [B avec n1 et n2 ordres partiels de la réaction par rapport aux réactifs respectifs A et B

V=k.
et n = n1 + n2 Ordre global de la réaction

k: constante de vitesse de la réaction

NB: Pas de lien entre les coefficients stoechiométriques et les ordres partiels
L’ordre de réaction c’est le temps que met le réactif
exemple pour la réaction : 2 NO + 2 = 2 + à se transformer, donc l’ordre de réaction est en rapport
avec la vitesse

la vitesse s’exprime : V = k . [ NO [
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Exercice 1 Notion d’ordre d’une réaction chimique

a)- lorsqu’une réaction est d’ordre 0, comment varie la vitesse V en fonction de la concentration en substrat S ?

Soit la réaction: A B (1)

 La vitesse de la réaction est donnée par la relation : V = k . [ A = k (constante)

• Si la réaction est d’ordre 0 alors la V de la réaction est constante
[v
o On a la représentation En situation de concentration saturante en Substrat,
graphique suivante: k la v de la réaction est constante et indépendante du substrat

 Cas des réactions enzymatiques

temps

4
Exercice 1 Notion d’ordre d’une réaction chimique

b)- lorsqu’une réaction est d’ordre 0, comment varie la concentration en substrat en fonction du temps ?

𝐴𝑡
v= =k En intégrant on a: ∫ 𝑑 [ 𝐴=] K . [ At ] = =
A0

[s
S0
 Si la réaction est d’ordre 0 alors [S ] décroit linéairement en fonction du temps

temps

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Exercice 1 Notion d’ordre d’une réaction chimique

c)- lorsqu’une réaction est d’ordre 1, comment varie la vitesse V en fonction de la concentration en substrat S ?

Soit la réaction: A B

 La vitesse de la réaction est donnée par la relation : V = k . [ A = k . [ A]

Si la réaction est d’ordre 1 alors la V est proportionnelle à la [S] en substrat

(droite affine linéaire) [s

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 Exercice 1
Exercice 1 Notion d’ordre d’une réaction chimique

d)- lorsqu’une réaction est d’ordre 1, comment varie la concentration en substrat en fonction du temps ?

𝐴𝑡 𝑡
𝑑𝐴
V = k . [ A] = − = k dt En intégrant on a : ∫ 𝑑 [ 𝐴]/[ 𝐴 ] −𝑘 ∫ 𝑑[𝑡 ]
𝑑𝑡 A0 t=0
=
[s 
A0
ln (𝐴
𝐴𝑡
0)
𝑒 =𝑒 − kt soit
Temps
 =
Si la réaction est d’ordre 1 alors la [ S] varie (décroit) de façon
exponentielle en fonction du temps

7
Exercice 1 Notion d’ordre d’une réaction chimique

Différents cas de schémas

[v
[s

S0 n= 0 n= 0
n= 1
n= 1

S
temps
Concentration de substrat en fonction du tps Vitesse de la réaction en fonction de la concentration en S

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 Exercice 1
e)- Donner la loi de la vitesse pour une réaction catalysée par une enzyme de type Michaélien

C’est l’équation de Michaelis et Menten

V=

Rappel: établissement de l’équation de Michaelis et Menten

 On établit la cinétique enzymatique dans les conditions de S >>> (saturante) et de faible concentration de E

 La réaction enzymatique passe toujours par un complexe intermédiaire [ ES]

k1 K3 (kcat)
Soit la réaction E + S [E-S] E + P
k2 lente
rapide

La vitesse de formation du complexe Vf = k1 . [E] . [S]

La vitesse de dissociation du complexe Vd = k2 . [E-S] + k3 . [E-S] = (k2 + k3) [E-S]

Dans la phase initiale de la réaction, Vf = Vd donc = = Km (1) Km a une valeur de concentration (mol/L)

[E]T = [E-S] + [E] (2) [E]T (enzyme totale) est composée [E] complexée et de [E] encore libre
V=
En remplaçant (2) dans (1) on a: KM = En développant on a
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 Exercice 1
f) Que représente Km et Vmax ?

 KM est la constant de Michaelis et Menten (ou constante de dissociation de ES)

Correspond à la concentration de substrat pour laquelle l’on atteint la moitié de la Vmax (V = Vmax /2)
 KM traduit l’affinité de l’enzyme pour son substrat:

 si KM faible alors l’affinité ( 1/ KM) est élevée

 et inversement

 Vmax est la vitesse maximale de la réaction et correspond à la vitesse en situation où toute l’enzyme
est saturée par le substrat c-a-d donc sous forme complexée ES

g) Valeurs extrêmes de l’ordre de la réaction suivant les [S] , pour une réaction de type Michaélienne
V=
Equation de Michaelis et Menten

Si S ˃˃ Km alors V ‗ Vmax = constante Ordre 0

Si S ˂˂ Km alors V ‗ = k .
Ordre 1
10
 Exercice 2
Données Km = M kcat = 10 M 5. M
 1- Quelle est la vitesse initiale de la réaction?

Enzyme de type Michaélienne donc V=

En condition initiale saturante) Vmax = kcat .

V = = = 3,33 M/s
AN :

2- Quelle est l’activité moléculaire d’un site catalytique, sachant que l’enzyme de masse moléculaire 200000,
Comporte 4 protomères identiques et une activité spécifique (AS) de 25 U/mg de protéines

Données: MM = 200000 Da (dalton) ou g/mol

AS = 25 UI/mg = 25 µmol / min / mg = mol/min/g = 25.. mol/min/g = 25. mol/min/g

Kcat = AS x MM donc kcat = 25xx 2x = pour 4 protomères (soit 4 sites catalytiques)
Déterminer kcat pour un site catalytique 11
 Exercice 2

Kcat = AS x MM donc kcat = 25xx 2x = pour 4 protomères (soit 4 sites catalytiques)

Déterminer kcat pour un site catalytique

Kcat = / 4 (pour 1 site catalytique)

Kcat = (pour 1 site catalytique)

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Exercice 3: Etude cinétique de l’invertase
Partie A- Influence de la concentration en enzyme
a) Commentaires des courbes
5,6.10-6  Concentration saturante = excès de substrat
pour rester en vitesse initiale et ne pas sous-
3.10-6 estimer l’activité de l’enzyme.

 Sur ces courbes la vitesse initiale est représentée

par la partie rectiligne

10-6  Les conditions de Vi sont de plus en plus

courtes lorsque la concentration d’enzyme
augmente

 La partie curviligne traduit l’épuisement du

substrat dans le milieu

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Exercice 3: Suite
b) Les vitesses initiales de réaction pour chacune des concentrations d’enzyme

Vi = pente dans la partie rectiligne des courbes

Vi (10-6 M) = 0,33 µmol/min

Remarque: la vitesse initiale Vi varie avec la concentration
Vi (3,6.10-6 M) = 1,15 µmol/min d’enzyme; lorsque la concentration d’enzyme est élevée la Vi est
aussi élevée et inversement
Vi (5,6.10-6 M) = 1,98 µmol/min

c) Courbe des vitesses initiales en fonction de la concentrations d’enzyme

On a une droite Vi = k[E]; la cinétique est d’ordre 1.

Donc en cinétique Michaëlienne, la cinétique est d’ordre 1

n=1 par rapport à la concentration d’enzyme

[E] 10-6 M 14
 Exercice 3: Suite
d) Activité spécifique de l’enzyme avec MM = 250000 g/mol

Déterminons l’activité moléculaire (AM)

AM = k = Kcat; il s’agit donc de déterminer la pente de la droite de la droite V i = k[E]

Rappelons que 1 cm3 1 mL de solution d’enzyme ont servi pour les essais

[E] = X.10-9 mol/mL; avec X = pente de la courbe

1,98 – 0,33
Kcat = Kcat = 0,35 µmol/min/10-9 mol Enz Kcat = 350 min-1
(5,6 – 1) x 10-9

Pour retrouver une formule de l’activité spécifique exprimée en µmol/min/mg;

faisons des rapports des unités des données en présence
MM = 250000 g/mol et Kcat = 350 min-1
Kcat
Ainsi, AS =
MM 15
Exercice 3: Suite
350
AS = = 0,0014 mol/min/g = 0,0014 µmol/min/103 mg AS = 1,4 µmol/min/mg
250000

e) Données: 300 mg prot/100 mL 3 mg prot/mL

3,6 µmol de glucose (produit)/4 min 0,9 µmol glc/min

 Calculons l’Activité relative (AR) de 1 mL de l’extrait enzymatique

Donc 0,9 µmol/min ont été obtenu en utilisant 100 mL d’enzyme

0,9 µmol/min 100 mL d’enzyme

AR 1 mL d’enzyme

0,9
AR = AR = 9.10-3 µmol/min/mL
100

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 Exercice 3: Suite
 Calculons la concentration molaire de cet extrait enzymatique

Il faut procéder avec les unités des données en présence pour retrouver une formule probable de la Conc. Molaire
(CE)

AR 9.10-3
CE = = CE= 25,7.10-6 µmol/mL = 25,7.10-9 mol/L
Kcat 350

 Déduisons en pourcentage en masse d’enzyme pure

(CE) = 25,7.10-9 M MM = 250000 g/mol Cmassique = 3 g prot/L

CE x MM 25,7.10-9 x 250000
PE = = PE = 0,2%
Cmas Enz 3

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Exercice 3 B: Suite
Partie B- Influence de la concentration en substrat
a) Tracé de la courbe 1/Vi = f (1/[S])
Il s’agit de la courbe en coordonnées inverses

Il faut d’abord calculer les valeurs de 1/Vi et de 1/[S]

Après le tracé, 1/VM ≈ 0,53 VM ≈ 1,89µmol/min

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Exercice 3 B: Suite
b) Activité relative (AR) de 1 cm3 (1 mL) d’enzyme

Etant entendu que l’énoncé précise que 1 cm3 ou encore 1 mL d’enzyme a servi à réaliser les essais
AR ≈ 1,89µmol/min/mL

c) Concentration molaire de la solution d’enzyme

Si on procède avec les unités des données; Equations aux dimensions

AR 1,89
CE = = CE = 5,4.10-6 M
Kcat 350

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 Exercice 4 Représentation en coordonnées inverses (ou de Lineweather et Burk)

Remarques:

 Il s’agit de calculer 1/Vi et 1/[S] pour chaque substrat à chaque concentration

 Puis tracer le graphe en coordonnées inverses

 Choisir une échelle

 Tracer proprement les deux droites dans le même graphe

 Déterminer graphiquement Vi ; 1/Vi ; 1/Km et Km

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Exercice 4 Représentation en coordonnées inverses (ou de Lineweaver et Burk)

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 Exercice 4 Représentation en coordonnées inverses (ou de Lineweather et Burk)
Substrats
Paramètres
AcétylCoA PropionylCoA
1/Km 17241 soit 0,17 6666,6 soit 0,0666.
Km 1,5.
1/VM 31. 1,099
VM 3,22 0,91
VM / Km (efficacité catalytique) 5,5. 104 6. 103

 1/Km correspond à l’affinité de l’enzyme pour son substrat

 plus 1/Km est élevé plus l’affinité de l’enzyme pour son substrat est grande

 VM/Km représente l’efficacité catalytique de l’enzyme

 La phosphotransacétylase a une meilleure efficacité catalytique (5,5. 104) pour l’acétylCoA.

Ainsi la phosphotransacétylase a une meilleure affinité pour l’acétylCoA 22
Différente cas d’Inhibition

Inhibition compétitive

L’inhibiteur et le substrat possède le même site de

fixation sur l’enzyme, conduisant à une
modification de l’affinité de l’enzyme pour son
substrat: KM est modifiée; tandis que la Vm est
constant.
[I]
KM app = 1✢
KI

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Inhibition Incompétitive L’inhibiteur ne fixe que sur le complexe ES
induisant un changement conformationnel qui
empêche la formation du produit:
1/Vm app
KM et Vm sont modifiés (diminuent).

Les inhibiteurs incompétitifs se lient au complexe

E·S, réduisant ainsi la vitesse de formation du
1/Vm produit. Il y a une diminution du Km et du Vmax
de la réaction enzymatique
KM Vm
KM app = Vm app =
- 1/KM [I] [I]
1✢ 1✢
KI KI

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Inhibition non compétitive mixte La fixation de l’inhibiteur induit un changement
conformationnel qui va se répercuter à la fois sur le
site catalytique de l’enzyme et le site de fixation du
substrat. Il y a donc deux composés dont les sites
des fixations sont interdépendants
KM et Vm sont affectés.

1/[S]

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 Recapitulation

Compétitif Non compétitif Non compétiif incompétitif

classique mixte
KM app ⍺ KM KM ⍺ KM KM

ß ⍺

Vm app Vm Vm Vm
Vm

⍺ ß ⍺

[I] [I]
Avec: ⍺=1✢ ß=1✢
KI K’I

26