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Université Abou Bekr Belkaid Tlemcen

Enseignants : A.Bedrane & F.Lahfa

Travaux dirigés
Exercice N° 1
La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations, obtenue en substituant la cellulose par des
groupements carboxyméthyls (- CH2 – COOH).
Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés égativement aux pH suivants : 1; 4,76 ; 7 et 9 (on
considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76).
Des protéines suivantes :
pHi de : Ovalbumine 4,6 Cytochome c 10,65 Lysozyme 11
Quelles sont celles qui sont retenues par la CM – cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine – CM –
cellulose, sont uniquement électrostatiques).

Exercice N° 2
La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d’anions, obtenue en substituant la cellulose par des
groupements diéthylaminoéthyls :
CH2 – CH3
-CH2–CH2–+NH
CH2 – CH3
Quelle est la proportion de radicaux – DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2; 7; 9,4; 12? (On considérera que le pK
de l’amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).
Des protéines suivantes :
pHi de Sérumalbumine 4,9 Uréase 5 Chymotrypsinogène 9,5
Quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE – cellulose ? (On considérera que les interactions protéine – DEAE
– cellulose sont uniquement électrostratiques).

Exercice N° 3
On veut séparer l’acide L-glutamique, la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des
groupements sulfonates (- SO3-).
Les pH isoélectriques de l’acide L- glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont progressivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25
°C. On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on amène progressivement le pH à 7.
Quels acide aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interaction acide aminé – résine sont uniquement
électrostatiques).
Exercice : N° 4
On détermine le volume d’élution, Ve au cours d’une chromatographie sue Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît
le poids moléculaire.

MM Ve (ml)
- Aldolase 145 000 52
- Lactate déshydrogénase 135 000 57
- Phosphatase alcaline 80 000 92
- Ovalbumine 45 000 131
- Lactoglobuline 37 100 143
1 – Porter Ve en fonction de log Mr. Que remarquez-vous ?
2 – Pour la glucokinase, Ve = 105 ml. Déterminer son poids moléculaire à l’aide du graphique précédent.

Exercice : N° 5
Acide Aminé pK (-COOH) pK (-NH2) pK (–r)
Leucine 2.4 9.6
Aspartate 2.1 9.8 3.8
Histidine 1.8 9.2 6.0
Glycine 2.3 9.6
Glutamine 2.2 9.1
Arginine 2.2 9.0 12.5
On veut séparer ces acides aminés par chromatographie sur résine polystyrénique substituée par des groupements
sulfonates (-SO3-). On dépose ces acides aminés sur la colonne à pH 2, puis on amène progressivement le pH à 10.
Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acides aminé-résine sont
uniquement électrostatiques.
Exercice : N° 6
Etude d’un mélange de protéines.
1 – Fractionnement sur échangeurs d’ions. Les groupements actifs de la résine utilisés sont des fonctions acides sulfoniques
(-SO3H).
La résine est équilibrée à pH 5,6 par lavage un tampon approprié, jusqu’à ce que l’effluent ait la même composition que le
tampon.
Phi MM
Cytochrome c 10,6
Chymotrypsinogène 9,5 23240
Sérumalbumine 4,8 68500
Globuline 6,6 150000
Ensuite le mélange protéique est équilibré à pH 5,6 et déposé dans la colonne. On fait passer du tampon pH 5,6.
a) Expliquer le comportement des 4 protéines du mélange avant élution. On élue ensuite la colonne par un tampon dont le
pH augmente progressivement. Le diagramme d’élution suivant est obtenu.

b) Pourquoi se place t-on à 280 nm pour établir le diagramme d’élution ? Quelle autre longueur d’onde auriez vous choisi
pour obtenir le même genre de diagramme ?
c)Interpréter ce diagramme et identifier les 3 protéines A, B et C.
Remarque : on considère que les interactions entre l'échangeur et les protéines sont purement électrostatiques et que la
force ionique du milieu est négligeable.
d) Sachant que la teneur en fer du cytochrome c est égale à 0,418 p.100, déterminer sa masse molaire minimale (Fe =
55,85 ).

Fractionnement par gel-filtration. Le gel utilisé est le Sephadex G100 dont le domaine de séparation est compris entre 4
000 et 150 000.
a) Principe du fractionnement ; à l'aide d'un schéma approprié, illustrer le principe de la chromatographie d’exclusion
moléculaire.
b) Fractionnement du mélange protéique : le mélange protéique est déposé: au sommet d’une colonne de Sephadex G100.
Déterminer le volume d'élution des différentes protéines du mélange et donner l'allure du diagramme d'élution obtenu. (Le
Volume mort de la colonne V0 déterminé par passage du bleu dextran (MM = 2.106) est de 40 ml ; le volume total de la
colonne Vt est de l50ml ; la relation suivante est vérifiée Kav= -a logMM +b, avec a=0,6 et b = 3,1.)
c) Sachant que le volume d'élution du cytochrome c est de 108 ml, déterminer sa masse molaire. le résultat obtenu est il en
accord avec celui de la question 1d ?
Les protéines pures obtenues doivent d’abord être débarrassé des sels minéraux qui ont servi à les précipiter,
d) comment procéderiez vous pour les éliminer
Exercice : N° 7 Soit le chromatogramme suivant :

1°) Calculez les Rf (facteurs de régression) des différents acides animés (aa1, aa2, aa4) et du mélange X.
Rf aa1 = Rf aa2 = Rf aa3 = Rf aa4 = Rf mélange X =
2°) Après avoir récupéré les différents acides animés ainsi que le mélange X, on trempe l’aa1 dans une solution de b
diméthyl – amino benzaldehyde – à 1% dans l’acétone contenant 10% de l’acide chlorhydrique fumant (réactif d’Erlich) on
obtient une coloration violette intense.
- L’aa2 étant l’hydroxyproline.
- L’aa3 réagit avec la ninhydrine en donnant une coloration jaune révélé à l’isatine. Conduit à une réaction positive.
- Le nitroprussiate de Na donne avec l’ion S une coloration violette – rouge, en présence de l’aa4 conduit à une réaction
positive (violet – rouge). En déduire la composition du mélange X en justifiant vos réponses.

Exercice 8 :
Après chromatographie sur couche mince de gel de silice, des substances A, B, C, D, et révélation on a trouvé les
valeurs de Rf suivantes dans le système de solvants indiqués :

Butanol H20 Iso propanol-Hcl Ethanol CH3 COOH

A 0,23 0,31 0,42 0,09


B 0,24 0,20 0,51 0,62
C 0,38 0,60 0,40 0,64
D 0,41 0,56 0,53 0,10

a) Représenter sur papier millimétré de préférences, la position de chacune des 4 substances dans chaque système
de solvant.
Pour chaque solvant les 4 substances sont déposées au même endroit sur la ligne de départ. Le front de migration
du solvant est de 10 cm de cette ligne de départ.

b) Que représente le Rf de chaque substance ?

c)Quelle (s) est (ou sont) la (ou les) condition (s) donnant la meilleure séparation des quatre composés ?
Pourquoi ?