UE Biologie Moléculaire 2

L1S2

Biologie Moléculaire

2022/2023

Contenu de l’enseignement :

Cours magistraux : 9 X 2 h
Travaux dirigés : 5X 2h

Contrôle des connaissances :

Contrôle Continu1 (cours et travaux dirigés) (40%): 30 min

Contrôle Terminal (cours et travaux dirigés) (60%): 1h

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TD N°1 : PCR (Polymerase Chain reaction)

Exercice n° 1 :

Vous venez de retrouver dans un vieux congélateur du laboratoire une boîte contenant des
oligonucléotides nommés "oligosbGeo", numérotés P1, P2, P3 et P4. Les séquences de ces
oligonucléotides sont indiquées sur chacun des tubes (figure 1). D’autre part, vous avez connaissance
de la séquence nucléotidique de l’ADN correspondant au gène bGeo (figure 1). A côté de ces tubes, dans
la même boîte, vous trouvez un tube contenant de l’ADN génomique humain purifié provenant de
cellules HeLa. Afin de savoir si vous allez conserver ou non ces oligonucléotides, vous envisagez de les
tester en réalisant des expériences de PCR.

Figure1 : Matrice bGeo :

1 5 10 15 20 25 310 315 320 325

5’GGACTAGCTTGCATGCGTACTGCGG//…//GCTATGCTATCCCGATTGGTAGT 3’

Séquence des oligonucléotides :

P1 : 5’ GACTAGCTTGCATGCGTA 3’ P3 : 5’ CAATCGGGATAGCATAGC 3’
P2 : 5’ TAGCTTGCATGCGTACTG 3’ P4 : 5’ TGCTATCCCGATTGGTAG 3’

1. Rappelez brièvement le principe de la technique PCR en insistant sur les points déterminants. Par
quelle technique peut-on vérifier que la PCR a bien fonctionné ?
2. Est-ce que chacun de ces oligonucléotides s’hybride avec votre séquence ? Si oui sur quel brin
s’hybrident-ils et à quel endroit ?
3. Donnez en le justifiant la taille des fragments PCR obtenus (s’ils existent) avec les six couples
possibles d’oligonucléotides (P1P2, P1P3, P1P4, P2P3, P2P4 et P3P4).
4. Chaque cycle de PCR double la quantité d’ADN. L’amplification par un facteur 103 sera-t-elle obtenue
après 10, 20 ou 30 cycles ? Justifiez votre réponse.
5. Au cours du premier cycle d’une PCR faite sur de l’ADN génomique, les amorces ADN initient une
synthèse qui ne s’achève que quand le cycle s’achève ou si, par hasard une extrémité de l’ADN est
rencontrée. Pourtant, à la fin de 20 ou 30 cycles, le seul produit visible est précisément défini par
les extrémités des amorces ADN. A partir de quel cycle un tel fragment d’ADN bicaténaire est-il
généré ?
6. A votre avis, est ce que ces 4 oligonucléotides peuvent s’hybrider autre part dans le génome ? Si
oui, quels résultats pourraient être obtenus ? Comment pourrait-on alors améliorer la spécificité du
résultat de la PCR en regard de l’obtention du fragment correspondant au gène bGeo ?

Exercice n° 2 :

En stage dans un laboratoire de recherche, votre encadrant vous demande d’amplifier par PCR
une partie de la séquence du gène Th1 de souris représentée ci-dessous :

5’-ccaagacccg ttcgggatcc atggtgcagt cctgctccgc ctacggctgc aagaaccgct acgacaagga caagcccgtc

1 11 21 31 41 51 61 71
tccttccaca tacggagcac cgcgtccgag aggggctacg tgatcctacc aaatgactac tttgaaattg ttgaagttcc
81 91 101 111 121 131 141 151
agctgaaagc atgaagacct tctg -3’
161 171 181

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1. Ecrivez la séquence (dans le sens 5’à 3’) des deux oligonucléotides (d’une longueur de 20
nucléotides) que vous devrez commander afin d’amplifier cette séquence d’ADN du nucléotide 11
au nucléotide 180.
Oligonucléotide1 : 5’…………………………………………………………………………3’

Oligonucléotide2 : 5’………………………………………………………………………….3’

2. Quelle matrice d’ADN allez-vous utiliser pour faire cette expérience de PCR ?
3. Quelle devrait être la taille du fragment amplifié ?
4. Que feriez-vous afin de vérifier que la réaction de PCR vous a donné le fragment attendu ?
5. Représentez ce résultat.

TD N°2 : Analyse quantitative et qualitative des acides nucléiques

Exercice n° 3 :

On mesure l'absorbance à 260nm (A260) d'une solution X d'ADN chromosomique d’E.Coli purifié
double brin à l’aide d’un spectrophotomètre. On obtient une absorbance A260=3. Après une dilution au
1/10 de la solution X on obtient une A260=0,6. A cette dilution, le rapport A260/A280=1,8.
1. Pourquoi mesure-t-on l’absorbance à 260nm ? Quelle indication donne le rapport A260/A280?
2. Quelle valeur de l’énoncé faut-il utiliser pour déterminer la concentration de la solution X ?
3. Déterminez cette concentration sachant que
A260 = 1 correspond à 50µg/ml pour un ADN double brin
4. Quelle est la longueur en nm de l’ADN chromosomique d’E.Coli sachant que sa masse molaire
est de 2,6.109 g/mol, lorsqu'il est sous une forme d'hélice B.

1 tour d'hélice d'un ADN forme B est de 3,4nm et contient 10,4 pb par tour.
On considèrera que la masse molaire d’un nucléotide est en moyenne de 330g/mol.

Exercice n° 4 :
On désire étudier la concentration molaire d'un fragment d'ADN double brin (X) que l’on vient de
purifier à partir d’ADN chromosomique d’E.Coli. Pour cela, on réalise une électrophorèse sur gel
d'agarose.
On a déposé sur la piste n°1 : 10µl d'un mélange équimolaire constitué de différents fragments dont les
tailles (7,5 , 2 et 0,5 Kb) et la concentration (10ng/µl pour le mélange) sont connues.
Et sur la piste n°2 : 10µl d'une solution contenant le fragment d'ADN (X) que l’on vient de purifier de
concentration inconnue.
L'intensité de la coloration des différentes bandes des pistes 1 et 2 a été quantifiée : Les intensités de
fluorescence des bandes correspondant au fragment (X) purifié piste2 et au fragment de 2Kb de la piste1
sont identiques.

3
 1. Donnez les critères de migration et de séparation de l’ADN
sur gel d’agarose.
2. Par quelles techniques peut-on révéler la présence de ces
différents fragments d’ADN ?
3. Pourquoi l’intensité des bandes colorées sur la piste 1
décroit-elle ?
4. Calculez les concentrations molaires du fragment de 2Kb et
du fragment de X.
5. A votre avis, pourquoi n’a-t’on pas utilisé le
spectrophotomètre pour mesurer la concentration de cette
solution d’ADN (X) ? Quelle valeur d’absorbance aurait dû être
trouvée ?

N.B. : Masse molaire moyenne d’un nucléotide 330g/mol.

Kb : par usage on utilise Kb et non pas Kpb.

Exercice n° 5 : Soit les séquences de deux oligonucléotides :

5'-cagtgagcatagcgattcgataggagctat-3'
5'-tccaatgcaggatacctgcattggatcgac-3'

L’utilisation conjointe de ces deux oligonucléotides pour réaliser une amplification par PCR sur la matrice
ADN appropriée ne donne aucun produit d’amplification ; pour comprendre les raisons de ce résultat
négatif, les questions suivantes ont été posées:
1- Ces deux oligonucléotides peuvent-ils s’hybrider entre eux ?
2- Peuvent-ils adopter une quelconque structure ? Justifiez.
3- Quelle hypothèse peut-on énoncer ?
4- Quel type d’expérience permettrait de tester cette hypothèse ?

Les deux oligonucléotides sont soit pris séparément soit mélangés en quantités équimolaires ; les tubes
sont chauffés 2 min à 95 °C puis la température est progressivement abaissée jusqu’à 25 °C. Le contenu
de chacun des tubes est alors réparti en 2 tubes, l’un est traité à la nucléase S1 - cette endonucléase
digère les acides nucléiques naturellement simples brins ou restant simples brins après hybridation
(mésappariement ou boucle), l’autre tube n’est pas traité ; les échantillons sont ensuite analysés sur 2
gels d’acrylamide l’un dénaturant, l’autre non dénaturant (natif) ; les résultats sont présentés dans la
figure ci-dessous.

4
 5- Que représentent les différentes bandes obtenues pour les différents échantillons dans les 2 types
de gel ? Concluez sur l’étude de la structure des acides nucléiques.

(Nota Bene : pour les besoins de l’exercice, on peut imaginer que l’expérience décrite ci-dessus ait été réalisée avec
de grandes quantités de molécules afin de piéger assez d’intercalant pour permettre leur visualisation sous UV : les
molécules simple brin retiennent moins d’intercalant qu’une même molécule double brin).

TD N°3 : Plasmides, digestions enzymatiques et clonage de fragments de restriction

Exercice n° 6 :

La séquence d’un fragment d’ADN bicaténaire d’une longueur de 900pb est partiellement reportée ci-
dessous :

1 201 401
900
5’-ATACCAT…ACGGATCCGAGCTCTCGA……TTCGATGTCGGATCCGTGCA…GAAATTCC-3’

1. Ecrire la séquence partielle correspondante du second brin de ce fragment et indiquez son

orientation.
2. Quelle forme (mono ou bicaténaire) de l’ADN est reconnue par les enzymes de restriction ?
3. Le site reconnu par l’enzyme de restriction BamHI est le suivant :

4. Sur votre séquence d’ADN double brin encadrer le ou les sites BamHI en indiquant les sites de
coupure.
5. Sachant que, sur cette séquence d’ADN, il n’y a pas d’autres sites BamHI que ceux identifiés ci-dessus,
combien de fragments sont obtenus après digestion totale de votre fragment d’ADN par l’enzyme
BamHI ?
6. Ecrire les séquences des extrémités des molécules d’ADN digérées.
7. Dessinez le profil de migration que vous attendez après avoir fait migrer l’ADN digéré sur un gel
agarose révélé par une coloration au Sybrgreen.
8. Sachant que vous avez déposé 500ng d’ADN digéré, combien de molécules d’ADN se trouvent dans
chacune des bandes obtenues ?

N.B.: masse molaire moyenne d'un nucléotide : 330g/mol

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Exercice n° 7 :

Des bactéries ont été transformées par le plasmide pTD1 représenté figure 1. Elles sont ensuite
cultivées en milieu liquide. Puis 1ml de culture est centrifugé, les bactéries sont lysées et l’ADN
plasmidique est purifié et remis en suspension dans 50µl d’eau.
Le plasmide pTD1 (Figure 1) purifié est ensuite soit non digéré (piste 1), soit digéré pendant 1h à 37°C
avec des concentrations croissantes d’enzyme de restriction BamHI (pistes 2 à 7). Les différentes
digestions sont analysées par électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 2). Pour chaque piste, 100ng d’ADN
sont déposés. Un marqueur de taille correspondant à de l’ADN linéaire est déposé piste M.

1. Décrivez en détail les différentes étapes de la transformation bactérienne et des conditions de

culture.
2. Indiquez sur la figure le sens de migration du gel.
3. Comment peut-on révéler ces différents fragments d’ADN ?
4. Pourquoi observe-t-on deux bandes dans la piste 1 alors que le plasmide n’est pas digéré ?
5. Expliquez à quoi correspondent les différentes bandes dans chacune des pistes.
6. Quelle est la taille totale du plasmide pTD1? Justifiez.
7. Que traduisent les différences de fluorescence observées dans les pistes 1 et 7 ? Peut-on estimer
le rapport de fluorescence des bandes présentes dans chacune des deux pistes ? Le cas échéant,
quel est-il ?
8. Par spectrophotométrie à 260nm on a dosé la solution d’ADN plasmidique purifiée après dilution
au 1/10 et on a trouvé une D.O égale à 0,2. Sachant que pour de l’ADN double brin, une D.O égale
à 1 correspond à une solution de concentration égale à 50µg/ml, calculez la concentration en
µg/µl de votre solution d’ADN plasmidique purifié. Quel volume d’ADN plasmidique a été utilisé
par digestion enzymatique ?
9. Sachant que la masse molaire moyenne d’un nucléotide est de 330g/mol, calculez la
concentration molaire de votre solution d’ADN plasmidique purifié.

Figure 1
BamHI
Amp

pTD1

ORI BamHI

Figure 2
1 2 3 4 5 6 7 M
pb
5000
4000
3500
3000
2000

1000

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Exercice n° 8 :

Nous souhaitons cloner dans le vecteur pTD2 (figure1), le fragment EcoRI de 9kb obtenu après
digestion d’un fragment d’ADN génomique de 45 kb (figure 2), lui-même provenant d’une banque d’ADN
génomique (réalisée par digestion par l’enzyme XhoI). Ce nouveau clonage permettra de travailler sur un
fragment d’ADN génomique de taille plus restreinte !

BamHI (2800)

Amp EcoRI (1)

Figure 1
pTD2
(2900pb)

SalI (500)

ORI

1- Combien de fragments d’ADN distincts obtient-on après digestion du fragment d’ADN génomique
par EcoRI ? Quelles sont leurs tailles ? Comment peut-on isoler et purifier le fragment que l’on
souhaite cloner ?
2- Décrire les différentes étapes du clonage.
3- Peut-on obtenir plusieurs types de plasmides recombinants ? Pourquoi ? Dessinez les résultats
moléculaires.

TD N°4 : Southern blot

Exercice n° 9 :

TECHNIQUE DE SOUTHERN

Q1 : Lors de la technique dite de SOUTHERN, l’ADN analysé par électrophorèse sur gel d’agarose
doit être dénaturé. Pourquoi cette dénaturation ? Et comment pratiquement réaliser cette
dénaturation ?

Q2 : Une sonde marquée est utilisée lors du Southern. De quel type de molécules s’agit-il et
comment réalise-t-on un tel marquage ?

7
SOUTHERN SUR PLASMIDE

L’ADN purifié d’un plasmide pS1 a été digéré par

l’enzyme de restriction BamH1. L’ADN ainsi
digéré a été analysé par électrophorèse sur gel pS1
d’agarose et coloration au BET (Fig 1A et Fig 1B).
Une sonde A (= fragment d’ADN de 200 paires de
bases) a été marquée radioactivement puis
hybridée avec une membrane correspondant à
un transfert du gel d’agarose préalablement
réalisé.
Le gel est représenté sur la Fig 1B et le résultat
après hybridation, lavage et autoradiographie
de la membrane est montré en Fig 1C.

Q3 : A l’aide des figures 1A, B et C, analysez ces résultats et positionnez (même

approximativement) la sonde A sur la carte de la fig 1A pour montrer l’endroit où elle s’hybride.

Une autre sonde (B = fragment d’ADN de 200 paires de bases, différent de A), a aussi été marquée et
utilisée en hybridation sur une membrane de transfert identique à la précédente. Le résultat est montré
sur la Fig 1D.
Q4 : Analysez les résultats et positionnez aussi la sonde B.

L’ADN purifié de ce même plasmide a été digéré par l’enzyme de

restriction EcoR1. L’ADN digéré a été analysé par électrophorèse sur
gel d’agarose puis transféré sur membrane et hybridé avec soit la
sonde A (Fig 2A) soit la sonde B (Fig 2B) dont les positions
d’hybridation ont été définies au préalables (Q3 et Q4).

Q5 : Dessinez l’ADN plasmidique pS1 et positionner sur celui-ci les sondes A et B ainsi que le(s)
site(s) reconnu(s) par EcoR1.
Q6 : Proposez une nouvelle expérience complétant ces deux résultats et permettant d’affiner la
carte du plasmide proposée en question 5.

SOUTHERN GENOMIQUE

10 µg d’ADN humain purifié ont été digérés en totalité par l’enzyme EcoR1 dont le motif reconnu est de
6 paires de bases (GAATTC). La taille de l’ADN génomique humain est de 3. 109 paires de bases.

Q7 : Quel est le nombre approximatif de fragments différents d’ADN humain obtenus après une
telle digestion enzymatique ? Expliquez votre raisonnement ainsi que le calcul. Ces fragments
sont-ils tous de la même taille ?
Q8 : Qu’observerait-on si on digérait avec l’enzyme de restriction Not1 dont le motif reconnu est
de 8 paires de bases (GCGGCCGC) ?
Q9 : Sur le même type de gel d’agarose que précédemment, comment se présenterait une
électrophorèse d’ADN humain digéré par EcoR1 et coloré par le BET ? Expliquer.

8
 Une sonde S1 (fragment d’ADN issu du génome humain,
d’une longueur de 1000 paires de bases) a été marquée
radioactivement. Elle est hybridée avec une membrane
correspondant à un transfert (Southern) réalisé à partir d’un
gel où l’ADN humain (10 µg) a été digéré soit par EcoR1, soit
par BamH1, soit par les deux enzymes à la fois.
Après hybridation, lavage et autoradiographie, le résultat
est montré Fig 3.

Q10 : Analysez ces résultats.

Q11 : Peut-on estimer combien de fois la séquence contenue dans le fragment de 1000 paires de
bases est-elle présente sur l’ensemble du génome humain ?
Q12 : A partir des résultats de ces digestions, construisez une carte physique de cette région du
génome en y positionnant la séquence du fragment de 1000 paires de bases (sonde).

Une autre sonde S2 de 1000 paires de bases issue du génome

humain a été utilisée pour le même type d’expériences de
Southern.

Les résultats sont montrés Fig. 4 ci-contre.

Q13 : Analysez ces résultats en les comparant à ceux

de la figure précédente. Que pouvez-vous conclure quant
aux séquences d’ADN contenues dans cette nouvelle sonde?

TD N°5 : PCR (Polymerase Chain reaction), clonage par PCR et séquençage

Exercice n° 10 :

A) On souhaite cloner dans un plasmide la totalité du cadre de lecture codant la protéine TD6 (atg=codon
d’initiation/ tga=codon stop). Pour cela une amplification par PCR sur le cDNA ci-dessous est réalisée.
1 11 21 31 41
ccaagacccg ttcgggatcc atggtgcagt cctgctccgc ctacggctgc
51 61 71 81 91
aagaaccgct acgacaagga caagcccgtc tccttccaca agtttcctct
101 111 121 131 141
tacggagcac cgcgtccgag aggggctacg tgatcctacc aaatgactac
151 161 171 181 191
tttgaaattg ttgaagttcc agcatgaaag cttgaagacc ttctg

1. Ecrivez la séquence (dans le sens 5’®3’) des deux oligonucléotides (d’une longueur de 20 nucléotides) qui
permettront d’amplifier cette séquence des nucléotides 11 à 190.

Oligonucléotide 1 : 5’………………………………………………………………………… 3’

Oligonucléotide 2 : 5’…………………………………………………………………………. 3’
9
 2. Quelle est la taille du fragment amplifié? ...........................pb

B) Le fragment amplifié en A) est cloné dans le plasmide pL2S4 dont la taille est de 3000pb (figure 1 ci-
dessous). Ce plasmide contient un site de clonage multiple (MCS ou Polylinker) comportant les sites de
restriction suivant :

3. Compte-tenu de la séquence que vous avez amplifiée en A), indiquez les deux sites de restriction que vous
pourriez utiliser directement afin de réaliser un clonage orienté de votre fragment amplifié dans le plasmide
pL2S4.

C) Après avoir digéré votre plasmide pL2S4 et votre fragment PCR par les deux enzymes de restriction
choisies à la question 3, vous réalisez la ligation du fragment PCR et du plasmide digéré puis vous
transformez des bactéries compétentes avec ce produit de ligation.
Après transformation, vous isolez une colonie dont le plasmide correspond au plasmide
recombinant souhaité « pL2S4-TD6 ».

4. Schématiser le plasmide recombinant souhaité en faisant apparaitre :

- l’insert (le fragment cloné),
- le(s) site(s) de restriction Pvu1 (NB : il n’y a pas de site de restriction Pvu1 dans l’insert)
- les sites utilisés lors du clonage (choisis à la question 3).

Vous digérez alors ce plasmide recombinant par l’enzyme Pvu 1 ou les deux enzymes de restriction
utilisées lors du clonage (choisies à la question 3).

5. Dessinez sur le gel d’agarose schématisé ci-contre en respectant les

intensités de fluorescence, les bandes attendues pour une digestion de
ce plasmide par Pvu I (piste1) ou par les deux enzymes de restriction
correspondant aux sites de clonage (piste2). Vous considérerez que les
digestions sont totales.

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 Exercice n° 11: On souhaite amplifier la région comprise entre les nucléotides 10 et 350 d'une
matrice d'ADN linéaire double brin en vue d’un clonage. La séquence d’un des deux brins est
donnée ci-dessous.

5'GTCCCACCTA ACGTTGCAAC TGGGAGACTT CCGGGGGCCT CACTGCTCCT AGAGCCCTCT

TCGCTGACTG CCAATATGAA GGAGTGACCT CTGTTCAGGC GTGACGAGGA AGCGACTGAC
CAGGGTGGAT TGCAACGTTG ACCCTCTGAA GGCCCCCGGA TCTCGGGAGA GGTTATACTT
CCTCCATGGA GACAAGTCCG AATGTCAATT GCAACAGGGC AAGCCGCTAC CTCGGAATTC
TACGTCACTT CCCTTGTGGG ACGGCTACCA TTGCCCTTAG TGCCCCTGGA GACGAGGATC
ATGCAGTGAA GGGAACACCC TTACAGTTAA TGCCGATGGT CGTTGTCCCG AACGGGAATC-3'

1- En précisant leur orientation, donnez les séquences d’un couple d’amorces (20nt) qui pourrait
être utilisé pour réaliser cette PCR.
2- Indiquer à l’aide de schémas explicatifs les différentes étapes de la PCR.

3- On souhaite cloner le produit de PCR ainsi obtenu dans le vecteur pKS+ représenté ci-
dessous.Parmi les quatre sites de restriction proposés dans le site de clonage multiple (figure 2),
le(s)quel(s) choisissez-vous pour digérer votre plasmide et cloner votre produit PCR ? Pourquoi ?

(NB : les sites de restrictions présents dans la séquence apparaissent soulignés (voir figure 1).

4- Lors de ce clonage, quels traitement devez-vous faire subir avant ligation du vecteur et du
produit de PCR par la T4 DNA ligase :
a/ au produit PCR ? Pourquoi ?
b/ au vecteur ? Pourquoi ?

Après transformation de bactéries compétentes

par le produit de ligation vous obtenez des
colonies bactériennes sur boites de cultures
contenant du milieu LB+ampicilline.
Trois colonies isolées sont mises en culture et
l’ADN plasmidique est purifié puis est analysé
par digestion enzymatique. L’ADN plasmidique
est digéré par Sac I + Kpn I (figure 3a) et par
EcoRI (figure 3b).
Les digestions sont analysées par
électrophorèse sur gel d’agarose et coloration Figure 3 : Profil de digestion des 3 ADN plasmidiques
SyBr Green. Les résultats sont présentés dans la (1, 2 et 3) digérés par SacI et KpnI (a) ou EcoRI (b)

figure 3 ci-contre.

5- Dessiner les cartes de restriction de chacun des 3 ADN plasmidiques en faisant apparaitre le(s)
inserts, les sites de restriction SacI, EcoRI et KpnI.

6- Pourquoi ne pas avoir analysé une digestion de l’ADN par l’enzyme EcoRV ?
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