Corrigé Exercices PCR

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Mars 2020

Frédéric Grosjean
Application de la PCR au diagnostic médical

Amplification par PCR d’un bout d’ADN CFTR contenant l’acide amine en position 551.

Pour pouvoir analyser la région qui contient l’acide aminé 551 on a amplifié des
fragments d’ADN, provenant des deux parents et de leurs trois enfants, à l’aide le da
PCR en utilisant les amorces A1 et A2 pour produire le fragment X. (Le fragment X
correspond à la région d’ADN contenant la séquence de nucléotide qui code pour
l’acide aminé en position 551 ; pour rappel, les acides aminés sont codés au niveau de
l’ADN par des groupes de trois nucléotides (CODONs). Le tableau vous indiquant quel
CODON code pour quel acide aminé vous est donné à la fin du fichier « Analyse
génétique par PCR_2020.pdf » disponible sur MyUnil)

A1 : 5’‐TTCCTGATAGTCCTTGCCCTTT‐3’
A2 : 5’-TTCTTTAAATGTTCCATTTTAG-3’

1) En sachant que l’amorce A1 se lie entre la position 760 et 855 de l’ADN

soulignez la région correspondante à l’amorce sur la carte d’ADN de CFTR que
vous trouvez en annexe.

Une des amorces est l’amorce « sens » et l’autre l’amorce « antisens ». Une des
amorces va s’associer au brin codant, l’autre au brin complémentaire de
manière à pouvoir amplifier sélectivement le fragment d’ADN d’intérêt qui se
trouve entre ces deux amorces.

La séquence qui est donnée dans l’annexe 1 est la séquence du CFTR, les
numéros indiqués en début et fin de chaque ligne correspondent aux positions
des nucléotides dans la séquence du CFTR. La ligne du haut représente les
nucléotides sur le brin codant (lecture de 5’ en 3’, de gauche à droite), la ligne
en dessous correspond au brin complémentaire (de 3’ en 5’, de gauche à droite).
Le premier nucléotide sur le brin codant est un « A », le deuxième également, le
troisième est un « T », et ainsi de suite… celui en position 2679 est un C.

L’amorce A1 est l’amorce sens, elle va s’apparier au brin complémentaire, la

séquence à trouver est donc la séquence sur le brin codant (5’ -> 3’) qui
correspond à la séquence de l’amorce.

2) En sachant que l’amorce A2 se lie entre la position 1900 et 1995 de l’ADN

soulignez la région correspondante à l’amorce sur la carte d’ADN de CFTR que
vous trouvez en annexe.
L’amorce A2 est l’amorce « antisens », elle est donc complémentaire au brin codant. La
lecture du bin complémentaire allant de 3’ en 5’ dans la séquence donnée, il faut donc
« inverser » la séquence de l’amorce A2 afin de trouver où elle s’hybride (s’associe de
par sa complémentarité) au brin complémentaire. La lecture s’effectue toujours de 5’
en 3’, mais cette polarité du brin complémentaire est l’inverse de celle du brin codant :

3) Estimez la taille, en nucléotides, du fragment qui est amplifié à l’aide des

amorces A1 et A2 (fragment X)

Pour faire cela il faut trouver quelle est la position du premier nucléotide amplifié avec
les amorces A1 et A2, ainsi que la position du dernier nucléotide amplifié. C’est le
produit final de la PCR (amplicon) qui contient des séquences d’ADN de la même taille,
taille définie par les amorces utilisées.

L’amorce A1 commence à amplifier un fragment à partir du nucléotide numéro 817. Le

produit de PCR se termine au dernier nucléotide compris avec l’amorce A2.

 1967 – 817 + 1 = 1151 (taille en paires de base du produit de PCR) (*)

(Explication du calcul : pourquoi «+1 » ?

Imaginer que vous vouliez compter combien de piquets constituent la clôture devant
chez vous (il y en a 20 en tout). Vous les numérotez de 1 à 20. Pour savoir combien
vous en avez, vous pouvez faire la différence du plus grand par le plus petit (20-1), mais
cela vous dira combien vous en avez rajouté à partir du premier, pas le nombre total, il
faudra donc rajouter 1. C’est la même chose ici, pour avoir le nombre total de
nucléotide il faut soustraire à la position du dernier, la position du premier et ajouter 1).

Fragment X taille estimée: ……1151……… bps (paires de bases)

4) A l’aide de la liste des enzymes (annexe) de restriction dont les séquences sont
présentes dans le gène du CFTR, identifiez et marquez sur la séquence (carte)
de CFTR le ou les site(s) de restriction pour l’enzyme HincII qui coupent dans le
fragment X entre les positions 1483 et 1880.

Notez que HincII coupe la séquence palindromique ci-dessous où Y représente C

ou T et R représente A ou G et qu’exceptionellement pour cette enzyme le site
n’est pas toujours palindromique (les deux R et Y peuvent être une base
différente sur chaque brin).

Il y a donc quatre possibilités de séquences reconnues par HincII :

5’-GTCAAC-3’ (A)
3’-CAGTTG-5’

5’-GTCGAC-3’ (B)
3’-CAGCTG-5’

5’-GTTAAC-3’ (C)
3’-CAATTG-5’

5’-GTTGAC-3’ (D)
3’-CAACTG-5’

Les formes (B) et (C) sont palindromiques, vous pouvez lire la séquence du brin codant
ou du brin complémentaire de 5’ et 3’ et vous obtenez la même séquence pour
chacune d’elle. (Forme (B) : brin codant : 5’-GTCGAC-3’, brin complémentaire : 5’-
GTCGAC-3’). Les formes (A) et (D) sont identiques, mais ne sont pas palindromiques (si
vous en retournez la forme (A), vous obtenez la forme (D)). L’annexe 2 vous indique les
positions où l’enzyme de restriction coupe la séquence du CFTR :
On vous indique dans la donnée qu’il faut chercher où cette enzyme coupe le gène
entre les positions 1483 et 1880. Le seul site qui existe dans cet intervalle est à la
position 1786.

Si on regarde la séquence du CFTR proche de cette position :

C’est donc la possibilité (A) (ou (D) étant donné qu’elles sont équivalentes) qui a un site
de restriction à la position 1786.

5) Etant donné que la mutation G551D est localisée, entre les positions 1483 et
1880, dans le fragment X amplifié, et qu’elle affecte un site codant pour une
glycine et un site de restriction HincII, identifiez et marquez la glycine mutée en
position 551 sur la carte de CFTR.

Selon le code génétique (voir dernière slide du document « Analyse génétique par
PCR_2020.pdf »), il existe deux façons de transformer une glycine en acide aspartique :

Au niveau de l’ARN (les couleurs reprennent celle du tableau du code génétique

présenté dans le document « Analyse génétique par PCR_2020.pdf) :

GGU -> GAU

GGC -> GAC

Ce qui au niveau de l’ADN correspond aux séquences suivantes :

GGT -> GAT

GGC -> GAC

Comme cette mutation doit affecter un site de restriction pour HincII, il faut regarder si
l’une de ces deux séquences est observée dans le site reconnu par HincII et dont la
mutation affecterait ce site de restriction. Effectivement la séquence correspondant à
la mutation GGT (glycine, allèle non muté) -> GAT (acide aspartique, allèle muté) est
observée dans la séquence (non mutée du CFTR, donc la séquence GGT) au niveau du
site reconnu par HincII.
Ce codon GGT code effectivement pour une Glycine (indiqué par la lettre G sous le
codon). Pour information, les symboles à une lettre utilisés pour représenter les acides
aminés sont donnés dans le tableau ci-dessous :

Si on lit la séquence ADN indiquée ci-dessus de 5’ en 3’, les CODONS présents codent
pour les acides aminés suivants (dans l’ordre) :

Isoleucine-Thréonine-Leucine-Serine-Glycine-Glycine-Glutamine-Arginine-Alanine-etc…

6) En sachant que la mutation G551D est causée par une mutation ponctuelle
d’une seule base d’ADN qui code pour le mauvais nucléotide, que cette
mutation détruit le site HincII et change l’acide aminé glycine en acide
aspartique, déduire quel nucléotide est touché par cette mutation et quel est la
séquence nucléique mutée en G551D. Utilisez le code génétique (cours) pour
répondre.

Comme on l’a vu dans la question précédente, il existe deux façons de changer un

CODON codant pour une glycine en un CODON codant pour un acide aspartique :

GGT -> GAT

GGC -> GAC
Celle qui nous intéresse est la version GGT -> GAT (c’est celle présente qui va faire
disparaitre le site pour HincII)

Indiquez une région de 10bps qui entourent le site muté et soulignez la

mutation:

………………………………AGT GGA GAT CAA CGA…………………………………………………….

7) A l’aide de la liste des enzymes de restriction pour le CFTR en annexe, identifiez

et marquez sur la séquence (carte) de CFTR le ou les site(s) de restriction pour
l’enzyme MboI qui coupent dans le fragment X, entre les positions 1483 et 1880.

A nouveau, si on regarde quels sont les sites de restriction de MboI présents dans la
séquence du CFTR donné dans l’annexe, on trouve :

Le seul site qui se trouve entre la position 1483 et 1880 est le site trouvé à la position
1504.

8) Analysez la séquence nucléotidique mutée en G551D et identifiez si le

changement nucléotidique chez les patients atteints de cette mutation affecte
le clivage du fragment X par MboI.
 Décrire comment la mutation affecte les sites de clivage par HincII et MboI

Avec le mutation G551D, on crée un site reconnu par MboI qui n’existe pas à
cette position dans la séquence sauvage du gène CFTR.

En présence de la mutation, on perd le site de restriction reconnu par l’enzyme

HincII.

La mutation transforme donc un site HincII en un site reconnu par MboI.

En présence de la mutation G551D, le site pour HincII disparait, la séquence

nécessaire de nucléotide pour être coupé par HincII (en gras dans la séquence
non-mutée) n’existe plus. L’allèle muté a fait apparaitre un site pour l’enzyme
MboI qui n’était pas présent dans la séquence non-mutée.

9) En sachant que tous les sites pour HincII et MboI du fragment X se trouvent
entre les positions 1483 et 1880, déduire la taille des fragments obtenus si l’on
prend le fragment X d’un chromosome sain et qu’on le digère avec HincII.
Répétez l’exercice avec MboI. Répétez l’exercice Si le fragment X provient d’un
chromosome avec la mutation G551D.

Dessinez les fragments sur le schémas en tenant compte du marqueur de taille

En fonction de la présence de la mutation G551D ou non, les produits de la digestion
avec les enzymes de restriction HincII ou MboI seront différents :

Pour le cas de l’allèle non-muté (Sain) coupée avec HincII, on a vu qu’il y a un site de
restriction en position 1786. Cette digestion résultera en deux fragments lors de la
migration sur gel : un de 970 paires de base et un de 181 paires de bases (voir le
schéma explicatif ci-dessous).

Pour le gène sain coupé avec MboI, on a un seul site de restriction sur le fragment X en
position 1504. La digestion résultera en deux fragments sur gel : un de 688 paires de
bases et un de 463 paires de bases.

Pour le gène muté, coupé en présence de HincII, nous avons vu que le site reconnu par
cette enzyme est perdu (à cause de la mutation). HincII ne sera donc pas capable de
couper le fragment X, ceci résultera en un seul fragment de la taille du fragment X, à
savoir 1151 paires de bases.

Pour le gène muté, coupé avec MboI, le site présent à la position 1504 est toujours là.
Un nouveau site a été créé, grâce à la mutation, à la position 1783. La digestion
résultera donc en trois fragments de tailles différentes : un de 184 paires de bases, un
de 279 paires de bases et un de 688 paires de bases, lors de la migration sur gel.

Grâce à la présence d’un marqueur de taille présent dans le gel, il est possible de faire
une estimation de la taille des fragments observés lors d’une migration avec de vrais
échantillons.
 10) Grace à la digestion avec HincII, déterminez si les parents et les enfants sont
atteints de mucoviscidose, sont porteurs sains où n’ont pas la mutation G551D.

Nous avons vu à la question (9) que si un utilise l’enzyme HincII en présence de l’allèle
mutant, ce dernier ne peut pas couper le fragment X. La présence d’une bande d’une
taille de 1151 représente donc la présence d’un allèle mutant. Si l’allèle n’est pas muté,
l’utilisation de HincII résulte en deux fragments de 970 et 181 paires de bases. La
présence de ces fragments traduit la présence d’une version non mutée de l’allèle.

Chacun des membres de la famille pouvant être soit homozygote pour l’allèle non
muté (s//s), homozygote pour l’allèle muté (m//m) ou porteur sain hétérozygote (m//s),
il suffit de regarder la taille des fragments obtenus pour se prononcer.
Tara ne présente qu’une bande à 1151, elle est donc homozygote pour la version
mutée du CFTR (les deux allèles mutée) : m//m (elle ne présente pas les tailles
attendues en présence de l’allèle non muté).

Gus ne présente que les bandes attendues en présence de l’allèle non muté, il est donc
homozygote pour la version non mutée du CFTR (les deux allèles sains) : s//s.

Clive, Ethel et Ula présentent tous trois un pattern identique, à savoir trois fragments,
ceux spécifiques à l’allèle non muté et celui spécifique à l’allèle muté (non digéré par
HincII), ils sont donc tous trois hétérozygote pour la mutation (porteur sain) : m//s.