Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene

(USTHB)
Faculté des Sciences Biologiques (FSB)
Département BCM

Licence L3 Biochimie

Module: Génie génétique

Digestion enzymatique par les endonucléases de

restriction
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Exercice A

On réalise une digestion de restriction de l’ADN de 45 kb du virus bactériophage

lambda par l’enzyme EcoRI.

- La répartition des nucléotides sur la séquence d’ADN étant considérée comme

aléatoire, combien de sites de restriction EcoRI doit-on s’attendre à trouver sur
l’ADN du phage lambda ?

123456

EcoRI 5’ GAATTC 3’
Site de reconnaissance de 6pb
3’ CTTAAG 5’

Enzyme de Sites de reconnaissance

restriction

Fréquence des sites de restriction= 1 /4n Longueur du site de

restriction
Nombre de bases (A,T,C,G)
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Exercice A

 Fréquence des sites de restriction EcoRI = 1 /46 = 1/4096

Cela signifie que EcoRI présente un site chaque 4096 pb (coupe chaque 4096 pb)

 Le nombre de sites de restriction EcoRI dans le génome du bactériophage λ

4096pb 4096pb 4096pb 4096pb 4096pb 4096pb 4096pb 4096pb 4096pb 4096pb 4096pb

45000pb
Taille du gènome du phage λ= 45 kb = 45000 pb
Nb de fragments= 45000/4096
EcoRI présente 1 site chaque 4096 pb = 10,98
≈11 fragments
EcoRI possède 10 sites de restriction au niveau du génome du phage λ (ADN linéaire)
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Exercice A

Une unité d’enzyme (1 U) est définie comme la quantité capable de cliver 1 µg d’ADN
sur un site de restriction en 1 heure.

Quelle quantité d’enzyme utiliser pour une digestion complète d’1 µg d’ADN de phage
lambda par EcoR I en 1h?

1U 1μg 1 site de restriction 1heure

Le génome du phage λ présente 10 sites de restriction pour l’EcoRI cela signifie

qu’il faut 10 unités d’enzymes pour digérer 1μg de ce génome.
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Exercice A

- Quels paramètres de l’activité enzymatique doivent être pris en considération afin

d’optimiser la digestion enzymatique de l’ADN ?

- La concentration d’ ADN
- La concentration d’enzyme
- La température
-pH
- Degré de salinité
- Mg2+
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Exercice A

On souhaite digérer 1 µg d’ADN. La solution d’ADN est fournie à une concentration de

0,5 µg/µl. 10 unités d’enzymes sont nécessaires à la digestion d’1 µg d’ADN. L’enzyme
utilisé a une concentration initiale de 10 unités/µl (basse concentration).
Cette digestion se fait à pH constant grâce à l ’addition d’un tampon concentré 10 fois :
le volume de tampon initial utilisé doit donc correspondre à 10% du volume total final du
tube de digestion.

-Quels volumes doit-on déposer dans le tube de digestion pour obtenir un volume final
de 20 µl contenant 1µg d’ADN digéré ?

ADN

L’ADN est concentré à 0,5 µg/µl

0,5µg→1µl
1µg→ x
x =2µl
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Exercice A

On souhaite digérer 1 µg d’ADN. La solution d’ADN est fournie à une concentration de

0,5 µg/µl. 10 unités d’enzymes sont nécessaires à la digestion d’1 µg d’ADN. L’enzyme
utilisé a une concentration initiale de 10 unités/µl (basse concentration).
Cette digestion se fait à pH constant grâce à l ’addition d’un tampon concentré 10 fois :
le volume de tampon initial utilisé doit donc correspondre à 10% du volume total final du
tube de digestion.

- Quels volumes doit-on déposer dans le tube de digestion pour obtenir un volume final
de 20 µl contenant 1µg d’ADN digéré ?

Enzyme

Une unité d’enzyme (1U ) est définie comme la quantité capable de cliver 1 µg
d’ADN sur un site de restriction en 1 heure.

[E] =10U/µl
10 sites→10U → v V=1µl
10U→ 1µl
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Exercice A

On souhaite digérer 1 µg d’ADN. La solution d’ADN est fournie à une concentration de

0,5 µg/µl. 10 unités d’enzymes sont nécessaires à la digestion d’1 µg d’ADN. L’enzyme
utilisé a une concentration initiale de 10 unités/µl (basse concentration).
Cette digestion se fait à pH constant grâce à l ’addition d’un tampon concentré 10 fois :
le volume de tampon initial utilisé doit donc correspondre à 10% du volume total final du
tube de digestion.

- Quels volumes doit-on déposer dans le tube de digestion pour obtenir un volume final
de 20 µl contenant 1µg d’ADN digéré ?

Tampon

100%→20 µl
10%→ ?=2µl
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Exercice A

- Dans quel ordre doit se faire le dépôt compte tenu du fait que l’enzyme doit être
maintenu le plus longtemps possible à -20°C avant utilisation ?

Dépôts Volume (µl) Ordre de dépôt

ADN 2 3
Enzyme 1 4
Tampon 2 2
Eau distillée 15 1
Volume total final 20
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Exercice B
Le génome humain a une taille d’environ 3 . 109 pb. Celle du virus marqueur
utilisé, un phage lambda, est de 45 kb.

Quelle est la masse d’ADN contenue dans une cellule humaine et combien de
cellules sont utilisées pour l’extraction d’1 µg d’ADN génomique ?
On donne la masse molaire moyenne d’un nucléotide : 330 g/mole

Taille du génome en paire de bases est de 3 .109 , c’est la quantité de paires de bases
M=m/n d’où m= M X n
La masse molaire d’un nucléotide M =330g/mole
Détermination de n (nombre de mole)?
n = la quantité de molécules / le nombre d’avogadro
Les molécules en question dans ce cas sont des nucléotides
1 paire de bases =2 nucléotides
La quantité de molécules dans un ADN humain = 3 . 109 pb = 3 . 109 X 2 nucléotides
N= 6 . 109/ 6.022 . 1023 → n= 9.96 10-15 moles
m= 330 x 9.96 10-15= 3.28 10-12g
Pour extraire 1 µg d’ADN génomique Nombre de cellules = 10-6 / 3.28 10-12= 3.04
106cellules
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Exercice B

Quelle est la fréquence statistique théorique du site de restriction EcoR I (GGATTC)

sur l’ADN génomique humain (3 . 109 pb)?

Fréquence des sites de restriction= 1 /4n Longueur du site de

restriction
Nombre de bases (A,T,C,G)

Site de restriction de EcoRI est constitué de 6pb Fréquence du site de restriction =

1 /46 = 1/4096 càd 1 site chaque 4096 pb

Le nombre de sites de restriction au niveau du génome humain = 3. 109 /4096

= 7,32421 105 fragments
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Exercice B
En supposant que la digestion effectuée sur l’ADN génomique soit totale, pouvez-vous
expliquer la différence d’aspect entre les bandes nettes obtenues pour les fragments de
restriction du marqueur et la tache diffuse (= « Smear ») obtenue pour l’ADN génomique
digéré ?
Témoin 1 : ADN viral non digéré
Témoin 2 : Marqueur (ADN viral prédigéré Hind III)
Témoin 3 : ADN génomique prédigéré EcoR I

Smear= trainé = mauvaise séparation

Du fait que l’ADN génomique soit grand, renfermant plusieurs sites de restriction dont
la digestion génère plusieurs fragments de taille très proche qui ne peuvent pas être
séparé par une électrophorèse ordinaire.

- Comment obtenir un résultat d’éléctrophorèse qui permettrait une étude de restriction

précise d’un gène humain ?

•Utiliser des électrophorèsesspatialisées = PFGE

•Travailler sur une partie du génome : fragment chromosomique, 1 chromosome…..
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Exercice C

MspI et HpaII sont deux endonucléases qui clivent le même motif palindromique
CC/GG. Il est par ailleurs démontré que la méthylation des cytosines qui précèdent les
guanines protège les sites CC/GG de l’attaque de HpaII et non celle de MspI. L’étude
de deux fragments d’ADN (A) et (B) isolés à partir de deux tissus différents d’un
même individu, est réalisée à l’aide de ces deux enzymes. L’électrophorégramme ci-
après est obtenu après coloration au BET des sous fragments de digestion des
deux ADN, préalablement séparés par électrophorèse.

CH3
5kb HpaII
-
4kb 4kb 4kb CCGG
3kb 3kb 3kb
2kb 2kb 2kb
+ MspI

1kb 1kb 1kb

3 sites de restriction pour HpaII et MspI mais HpaII n’a agit que sur un seule site au
niveau de l’ADN B donnant 2 fragments de 5kb.
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Exercice C

-Quelle signification physiologique peut revêtir le constat fait à la question 1 ?

La région analysé a un rapport avec une fonction tissulaire qui est active dans le
tissu A (déméthylé) et inactivé dans le tissus B ( méthylé).
Dans le but de cartographier les fragments d’ADN A et B, ils sont marqués avec le
(λ32P) ATP, puis digérés par les enzymes de restriction. L’autoradiogramme
obtenu est présenté ci-dessous :
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Exercice C

- Donnez la cartographie des ADN (A) et (B).

HpaII HpaII HpaII
5kb 5kb
10kb
2kb 3kb 4kb 1kb
MspI MspI MspI
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Exercice D

On opère une digestion de restriction d’un ADN plasmidique circulaire de 1,6 kb

par 2 enzymes EcoR I et Pst I. Le profil électrophorétique obtenu est le suivant:

- +

- Construire la carte de restriction pour les deux enzymes EcoRI PstI

EcoRI PstI 100pb
PstI
1000pb 500pb 200pb
600pb 200pb
Plasmide Plasmide Plasmide PstI
1,6kb 1,6kb 1,6kb
PstI 300pb
600pb
PstI
800pb
EcoRI 500pb EcoRI
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Exercice E

Un fragment d’ADN linéaire est coupé d’une part par Hind III, d’autre part par Sma I,
puis conjointement par les deux enzymes. Les fragments obtenus sont les suivants :
Hind III : 2,5 kb et 5,0 kb
SmaI : 2,0 kb et 5,5 kb
Hind III + SmaI : 2,5 kb, 2,0 kb et 3,0 kb

- Dessinez la carte de restriction.

HindIII
2,5 kb 5 kb
7,5kb
SmaI
5,5 kb 2 kb
7,5kb

HindIII SmaI
2,5 kb 3 kb 2 kb
7,5kb
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Exercice E

le mélange des fragments produits par la combinaison des deux enzymes est
ensuite digéré par l’enzyme EcoRI, ce qui fait disparaître le fragment de 3Kb et
fait apparaître une bande colorée correspondant à un fragment de 1,5 kb.
Indiquez le site de clivage d’EcoRI sur la carte de restriction.

EcoRI

HindIII SmaI
2,5 kb 3 kb 2 kb
7,5kb
1,5kb 1,5kb
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Exercice F
On souhaite étudier la fonctionnalité d’un gène M d’une bactérie. Pour cela, on
essaie de cloner au site EcoRI du vecteur plasmidique pBR330 de la bactérie un
fragment d'ADN génomique d’intérêt (voir schéma) :

Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous sélectionnez les clones

recombinants.
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Exercice F
1.Préparation de l'insert:
Extraction d'ADN génomique de la bactérie d’interet comportant le géne M.
Digestion partielle de cet ADN par l'enzyme de restriction EcoRI, de manière à
générer des fragments de 7 à 10 kb.
2.Préparation du vecteur:
Digestion du pBR330 par l’enzyme Eco RI dont le site de restriction est
unique (linéarisation du vecteur)
Déphosphorylation des extrémités.

3.Ligation: Intégration des inserts d’ADN dans les vecteurs (ligase).

4.Sélection: Transformation d'E. coli (Cellule hôte AmpS, StrS) et sélection des
clones recombinants .
Etape 1 : Sélection des colonies transformées sur milieu contenant de la
streptomycine (1er marqueur de sélection). Cette première boite de sélection nous
permet d’écarter les cellules non transformées
Etape 2 : Sélection des clones recombinants en ensemençant par la technique
tampon velours 2 boites de culture l’une contenant la streptomycine (Témoin positif) et
l’autre contenant l’ampicilline qui nous permet de distinguer les clones recombinants
des clones non recombinant.
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Exercice F

(Streptomycine)

Streptomycine Ampicilline

Utilisation de sonde spécifique au gène

d’intérêt (hybridation in situ sur colonie).

AmpR
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Exercice F
Un des plasmides recombinants contenant le gène M (appelé pBM1) est digéré par les
enzymes de restriction BamHI et EcoRI. Après migration et séparation des fragments d'ADN
sur gel d'agarose puis coloration au bromure d'éthidium, on obtient les profils de restriction
suivants:
-

Donnez la carte de restriction du plasmide recombinant pBM1.

BamHI 3Kb EcoRI
BamHI 5.5Kb
EcoRI 2.5Kb
8Kb
BamHI 5.5Kb BamHI
6Kb 4Kb 4Kb
EcoRI BamHI
4.5Kb 3.5Kb
EcoRI BamHI 4.5Kb BamHI EcoRI
1Kb
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Exercice G

Pour rechercher une mutation chez les apparentés d’un individu, une étude par
PCR-RFLP a été pratiquée.
Quel est le principe de cette méthode ?

RFLP= Restriction Fragments Lenght Polymorphism

C’est une analyse des variations de taille des fragments de restriction et donc du
nombre de sites de restriction due à la présence d’une mutation (Apparition ou
disparition d’un site de restriction)

1. Amplification par PCR du gène ou d’un fragment du gène (exon) portant la

mutation (sujet malade et sa famille et un témoin sain).

2. Digestion du produit d’amplification par une enzyme de restriction.

3. Séparation des différents fragments de restriction par électrophorèse.

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Exercice G

Avec la séquence mutée apparaît un site supplémentaire de digestion par

l’enzyme de restriction E. L’amplification par PCR de l’exon concerné du gène
du récepteur du calcium, conduit à l’obtention d’un fragment de 504 paires de
bases. Ce fragment est soumis ensuite à une digestion par E qui génère différents
types de fragments (cf. schéma).

3 fragments de restriction
87pb, 313pb et 104 pb

4 fragments de restriction
87pb, 133pb, 180pb et 104pb
Disparition du fragment de 313
pb et l’apparition de 2 nouveaux
fragments de 133pb et 180pb
313pb

La mutation engendre l’apparition d’un nouveau site de restriction

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Exercice G
Sur l’arbre généalogique est représenté le résultat de la migration sur gel
d’agarose de ce produit de PCR, non digéré puis digéré par E, issu de
l’amplification de l’ADN génomique des individus A, B, C et D.
- Lesquels de ces sujets présentent la mutation ?
- Quel serait le profil électrophorétique pour un patient porteur de 2 allèles
mutés T ?

Les sujets A et B présentent le même profil électrophorétique : 5 fragments de restriction :

313pb, 180pb, 133pb, 104pb et 87pb.
Ces fragments comprennent les fragments 313, 104 et 87 qui correspondent à l’allèle normale
et les fragments 180, 133, 104 et 87 correspondant à l’allèle muté.
Donc : les sujets A et B sont hétérozygotes pour l’allèle muté.
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Exercice G

Les sujets C et D présentent le même profil

de restriction : 3 bandes : 313, 104 et 87 pb
qui correspondent à l’allèle normal.
Donc les sujets C et D sont homozygotes
pour l’allèle normal

Un individu porteur de deux allèles

mutés = homozygote pour la mutation
donc il aura 4 bandes : 180, 133, 104,
87 pb
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Exercice H

La famille dont l’arbre généalogique est reproduit ci-dessus présente des

cas de drépanocytose, une maladie affectant les globules rouges et liée à
la présence d’une hémoglobine anormale Hb S à la place d’une
hémoglobine normale Hb A. les individus II 2 et II 3 sont malades.
HB A/ HB S
(Porteur sain)

HB A/ HB A ou HB A/ HB S HB S/ HB S
(Sujet sain) (Sujet malade)

Pouvez-vous réaliser une analyse des phénotypes présentés et en déduire les

génotypes des membres de cette famille. Quel est le génotype de II 1 ?

Une maladie dominante apparait obligatoirement à chaque générations donc

c’est une maladie récessive (saut de génération) qui ne peut s’exprimer qu’a
l’état homozygote.
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Exercice H

La mutation S responsable de cette maladie est bien connue, elle affecte un acide
aminé de la chaine de béta globine, protéine qui entre dans la constitution de
l’hémoglobine. Le tableau ci après présente les séquences de la portion mutée :

Hb A ... Pro Glu Glu ... Hb S ... Pro Val Glu ...

Allèle A (sain) ... CCT GAG GAG... Allèle S (muté) ... CCT GTG GAG ...

On veut réaliser une digestion de restriction du gène concerné permettant d’obtenir des
fragments de restriction différents pour chacun des allèles A et S. Choisir dans la liste
d’enzymes de restriction proposée, l’enzyme qui convient à l’identification des 2 allèles.

Enzyme EcoR I Hind III Mst II Hae III Bam I

Site de
G/AATTC A/AGCTT CT/GAGG GG/CC G/GATCC
restriction

L’enzyme qui convient est Mst II : le site de restriction existe sur l’alléle normal qui sera
donc digéré en moins en deux fragments. La mutation sur l’alléle HB S entraine la
disparition du site de restriction qui donc ne sera pas digéré.
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Exercice H

Le profil d’électrophorèse obtenu est schématisé. Pouvez-vous repérer les

différences observables entre les profils de restriction des deux allèles ?

Dans le profil correspondant à l’allèle normal, on note la présence de 2 bandes,

de 0,2 et 1,1Kb, qui sont absentes dans le profil de l’allèle muté. Par ailleurs, ces
deux bandes sont remplacées par une bande de 1,3Kb, dans l’allèle muté. La
mutation entraine la perte du site de restriction de Mst II qui se situe à 200pb.
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Exercice H

On réalise la même opération sur des extraits d’ADN, correspondant au gène de la

béta globine, des 5 membres de la famille étudiée. Une partie du profil
d’électrophorèse est visualisé. Pouvez-vous maintenant diagnostiquer le génotype
de II 1 ?

II 1 présente une bande à 1,1 kb donc il est homozygote pour l’allèle normal.
I 1 et I 2 une bande à 1,3 et 1,1 donc hétérozygote.
II 2 et II 3 une bande à 1,3kb donc homozygote pour l’allèle muté.