Les méthodes du séquençage de l’ADN

Mme: Ferhah Mélissa

 Définition

Séquencer une molécule d’ADN signifie

La détermination de la succession des nucléotides entrant

dans sa composition (Lire la composition en BA)

N.B: Il est possible de séquencer tout type d’ADN/ d’ARN (qlqs milliers de bases….. Plusieurs
centaines de milliards de bases)
Méthodes de séquençage à travers le temps

Méthode de Sanger 1975

Méthode de Maxam-Gilbert 1977

Applied Biosystems 370

Automatisation de Sanger 1987

Séquençage de la nouvelle génération

NGS 2005

Séquençage de la 3ème génération 2011

 Intérêts du séquençage

- Etudier les informations biologiques.

- Comprendre et de poser des diagnostics.

- Identifier des mutations génétiques.

- Personnaliser des traitements (médecine personnalisée).

- Comparaison des génomes (différence entre les populations)

 Séquençage de la première génération

Méthode de Sanger 1975 Méthode de Maxam-Gilbert 1977

Méthode enzymatique sélective.

Méthode chimique sélective.
Nécessite un ADN simple brin.

Matrice pour l’enzyme (ADNc )

Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

Prix Nobel Prix Nobel

1958 1980
 Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

Les nucléotides au sein d’un polymère

nucléotidiques sont liés par des LP: Groupement -
OH sur le C3 du ribose du 1er nucléotide de la
postion 5’ et le phosphore du groupe phosphoryle
en position α du nucléotide dit en position 3'.

 Principe: par terminaison de chaine.

 Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

L'absence de l'atome d'oxygène en 3' empêche la formation d'une nouvelle liaison

phosphodiester

L’ADN polymérase ne pourra plus rajouter de nucléotides lorsque un ddntp est lié

Arrêt de synthèse au niveau du nucléotides incorporé

Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

Séquençage d’ADN simple brin par: Réaction en cycles

Dénaturation
Annealing
Elongation du brin

La méthode à besoin:

Des amorces marquées

Une ADN polymérase
Des désoxyribonucléotide dNTP (A,T,C,G)
Des didésoxyribonucléotides (ddNTP) radioactifs
 Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

1. Fragmentation de l’ADN:

Après fragmentation de l’ADN, ce dernier sera mis en réaction de

polymérisation dans des tubes différents chacun contient un ddntp précis
 Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

2. Séquençage en cycles par PCR:

ddATP ddTTP ddCTP ddGTP

Les quatre tubes contenant chacun un type

de ddntp va subir une réaction de
dénaturation, hybridation et élongation.
Dés que le composant STOP est ajouté la
réplication est arrêtée.
 Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

3. Séparation des fragments séparés sur gel d’acrylamide:

Résultat: d’ADN de différentes tailles dont la réplication dans chaque tube sera
bloquée dans un type de ddntp bien précis

La séparation est faite en fonction de la masse moléculaire.

La grande résolution de ce gel permet de distinguer des fragments différents
entre eux d’une paire de base.
 Séquençage de la première génération
Méthode de Sanger 1975

4. Lecture / détermination des séquences:

La lecture se fait du bas vers le haut.

Le premier nucléotide est un C, le deuxième
est un G, le troisième est un C, le
quatrième est un T et ainsi de suite.
 Séquençage de la première génération
Automatisation de la méthode de Sanger 1980-2005

Le principe est toujours le même, mais plusieurs modifications ont été Apportées:

ddntp radioactifs ddntp fluorescents/ fluorochromes

4 différents tubes 1 seul mélange réactif/ tube capillaire

Electrophorèse sur plaque Electrophorèse dans des capillaires

en verre

 La méthode automatique est plus rapide.

 Séquençage de la première génération
Automatisation de la méthode de Sanger 1980-2005
 Séquençage de la première génération
Automatisation de la méthode de Sanger 1980-2005

- L’émission de fluorescence est mesurée à 4 longueurs d'onde correspondant aux

4 fluorophores.

- Les 4 réactions pourrons être effectuées dans un seul milieu comme chaque
nucléotides aura une couleur de fluorescence spécifique à lui.

- Le laser excite fluorochromes et une caméra réceptionne les émissions aux

différentes longueurs d'onde.

- La fluorescence émise permet de déterminer la nature du ddNTP incorporé à

l'extrémité du fragment du capillaire.

- Après traitement informatique, les signaux de fluorescence sont présentés sous

forme d'un chromatogramme qui permet la lecture direct de la séquence du brin
d'ADN complémentaire d'un brin séquencé.
La lecture est faisable sur le gel d’acrylamide
grâce aux bandes/ fragments d’ADN
radioactive.

Quant à celle de la technique automatique, la

fluorescence des nucléotides est détectable par
le séquenceur qui détectera l’intensité de
fluorescence de chacune grâce aux couleurs
visibles sur le chromatogramme
 Séquençage de la première génération
Méthode de Maxam-Gilbert 1977

1. Dénaturation de l’ADN:

 Obtention de simples brins d’ADN.

 Séquençage de la première génération
Méthode de Maxam-Gilbert 1977

2. Marquage des extrémités 5’ par le P32:

 Séquençage de la première génération
Méthode de Maxam-Gilbert 1977

3. Clivage au niveau de nucléotides spécifiques:

 Séquençage de la première génération
Méthode de Maxam-Gilbert 1977

3. Clivage au niveau de nucléotides spécifiques:

Acide formique: A + G

Sulfate de diméthyle/ alkylation : G

Hydrazine: C + T

Chloride de sodium: C
 Séquençage de la première génération
Méthode de Maxam-Gilbert 1977

4. Clivage des extrémités 5’:

5. Séparation des fragments sur gel d’acrylamide: ’:

6.Visualisation du gel par autoradiographie:

 Séquençage de la nouvelle génération

Les techniques actuelles de séquençage à haut débit

(SHD/ NGS)

La première génération des appareils de séquençage à haut débit sur le marché : 2007
Séquençage de la nouvelle génération

NGS= parallèle massif / haute performance

Méthodologies de séquençage d'ADN différentes et modernes

Caractéristiques:
Séquençage automatisé
Parallèle ( milliards de fragments en même temps)
Haut débit

Ces techniques reposent sur:

La synthèse d’ADN
L’hybridation sur puces ADN
 Séquençage de la nouvelle génération

La préparation des librairies/ PCR

Les cycles de réactions de séquençage

La prise d’image après chacun de ces cycles pour déterminer le

nucléotide correspondant

Analyse des données

Pyroséquençage Illumina/ Séquençage par

454 Roche Solexa ligation
 Séquençage de la nouvelle génération
Pyroséquençage : la technologie de Roche

- Séquençage par synthèse =/= Séquençage par terminaison

- La PCR utilisée: en émulsion (emulsion PCR ou EmPCR), les

fragments d’ADN sont liés à des billes d’agarose.
 Séquençage de la nouvelle génération
Pyroséquençage : la technologie de Roche

1. Préparation des librairies simples brin/ bibliothèque:

Par Fragmentation de l'ADN de l’échantillon à analyser de 300 à 800 pb

afin d’obtenir une banque d’ADN simple brin matrice, fixation des
adaptateurs à chaque extrémité, et dénaturation.
 Séquençage de la nouvelle génération
Pyroséquençage : la technologie de Roche

2. Amplification de l’ADN en émulsion:

Un fragment d'ADN est fixé sur chaque bille, ces billes sont isolées
dans une goutte d'huile, une amplification par PCR à lieu dans chaque
émulsion. Chaque bille transporte dix millions d'exemplaires d'une
unique matrice d'ADN.
À la surface des billes, il existe des séquence complémentaires aux
adaptateurs de sorte que l'ADN simple brin peut se lier spécifiquement
aux billes.
 Séquençage de la nouvelle génération
Pyroséquençage : la technologie de Roche

L'émulsion est détruite, et chaque bille est placée dans les puits de la
plaque à fibre optique le diamètre des puits ne permet qu’une seule bille
à la fois.

Dans chaque puit, sont placées des microbilles transportant des

enzymes nécessaires à la réaction de pyroséquençage.
 Séquençage de la nouvelle génération
Pyroséquençage : la technologie de Roche

3. Séquençage:

L’incorporation d’une base DNTP

Libération de ppi

ATP
sulfurylase
ppi + adenyl phosphate ATP

Luciférine + O2
ATP Fluorescence
Luciférase
 Séquençage de la nouvelle génération
Pyroséquençage : la technologie de Roche
 Séquençage de la nouvelle génération
Pyroséquençage : la technologie de Roche

Le signal luminescent est enregistré par une caméra CCD.

Séquençage par synthèse avec émission de lumière, on parle de

pyroséquençage.
 Séquençage de la nouvelle génération
Séquençage Solexa/ illumina

- Séquençage sur puces.

- Utilise des terminateurs réversibles.

Principe: incorporation réversible de nucléotides fluorescents dont

l’extrémité 3'OH est désactivée, ce qui permet l'incorporation d'une seule
base par cycle et par lecture optique de la fluorescence.
 Séquençage de la nouvelle génération
Séquençage Solexa/ illumina

1. Préparation des banques d'ADN:

- Fragmentation aléatoire de l'ADN.

- Fixation d'adaptateur à chaque

extrémité des fragments d'ADN.
.
 Séquençage de la nouvelle génération
Séquençage Solexa/ illumina

2. Amplification par pontage:

-. Dénaturer/ attacher les fragments à une flow-cell

- Amplification par pontage/ bridge-PCR par ajout d’enzyme et de

nucléotides
 Séquençage de la nouvelle génération
Séquençage Solexa/ illumina

- Dénaturation des ADN double brin (il y a plusieurs copies d’ADN simple
brin attachées à la flowcell).

- Le premier cycle de séquençage commence en ajoutant les quatre

terminateurs réversibles marqués (A,T,G et C), les amorces et l’ADN
polymérase.

Après excitation par un

laser, la Fluorescence émise
par chaque cluster est
récupérée et la première base
est lue.
 Séquençage de la nouvelle génération
Séquençage Solexa/ illumina

- Chaque ajout de terminateurs réversibles et de captage après excitation

est considéré comme un cycle qui se répétera plusieurs fois pour lire chaque
base.