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PCR (Polymerase Chain Reaction)

DEFINITION En 1983, Karry Mullis met au point une technique damplification de lADN: la PCR (Polymerase Chain Reaction ou Raction de Polymrisation en Chane). Aujourdhui cest une technique incontournable et couramment utilise en routine dans les laboratoires. En deux mots, cest une raction enzymatique qui permet de slectionner puis damplifier en une trs grande quantit un fragment dADN particulier, prsent en trs faible quantit au dpart, parmi des millions dautres fragments.

PRINCIPE La PCR est une suite de cycles, qui se rptent en boucle, comportant chacun trois paliers de temprature. De plus, chacun de ces paliers est caractris pas une raction chimique distincte. En moyenne une PCR comporte entre 20 et 40 cycles.

Les acteurs de la PCR sont:

1. LADN Avant la raction de PCR, lADN est extrait partir de lchantillon que lon veut analyser (salive, cheveux, cellules, fossile). Puis, cet extrait purifi en ADN, contenant le fragment dADN que lon souhaite amplifier, peut tre utilis en PCR. 2. Les deux amorces Ce sont des fragments courts d'ADN, capables de s'hybrider de faon spcifique, grce la complmentarit des bases, sur lun des deux brins d'ADN.

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Les amorces sont choisies de faon encadrer la squence d'ADN amplifier. La taille de ces amorces est gnralement dune vingtaine de dsoxyribonuclotides. De plus, les amorces sont en trs forte concentration par rapport celle de lADN amplifier.

Amorce 1 (CFTR 1)

Amorce 2 (CFTR 2)

3. Les DsoxyriboNuclotides-Tri-Phosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Les dNTPs (Dsoxyribonuclotides-Tri-Phosphates) sont des molcules de base, qui constituent lADN, utiliss par la Taq polymrase pour la synthse du nouveau brin dADN complmentaire. 4. Lenzyme, Taq polymrase Lenzyme utilise est une polymrase, c'est--dire quelle peut synthtiser un nouveau brin dADN partir du brin dADN matrice aprs stre fixe une amorce. 5. Le milieu ractionnel Le milieu ractionnel de la PCR comporte lADN amplifier, les dNTPs, les deux amorces, la Taq polymrase, un tampon et des ions magnsium (MgCl2). Ces deux derniers composants dfinissent un milieu avec un pH optimal et une concentration saline optimale pour le bon fonctionnement de lenzyme.

LA REACTION La PCR est une technique automatise. En effet, la raction de PCR se fait dans un thermocycleur. Lappareil contient un bloc chauffant o lon insre les tubes contenant notre mlange pour la raction de PCR et o la temprature peut varier trs rapidement et trs prcisment de 0C 100C.

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Le thermocycleur est alors programm pour effectuer les diffrents cycles de la PCR. Ainsi, chaque cycle est compos dune succession de paliers de temprature prdtermine, et dune dure bien dfinie. Ces deux paramtres, temprature et temps, dpendent de la taille de la squence amplifier de la taille et de la composition en dsoxyribonuclotides des amorces.

Bloc chauffant Clavier pour la programmation des cycles

Petite anecdote: Il faut savoir quau dbut des annes 80, les chercheurs navaient pas encore de thermocycleur dans leur laboratoire et pour changer la temprature, ils devaient passer les tubes dun bain-marie lautre. Je vous laisse imaginer le temps que cela prenait !!

Chaque cycle est donc constitu de trois priodes diffrentes: 1 2 3 Dnaturation Hybridation Elongation

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Schma de la PCR
Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle 4 Cycle 30

1 copie 1
Temprature

109 copies

Matrice ADN

N cycles

+
dNTPs

+ +

Polymrase Amorces

Temps

La dnaturation:

La temprature dans le tube est rgle 95C. A ce moment l, lADN se dnature. En effet, lADN perd sa structure caractristique en double hlice, les liaisons hydrogne reliant les bases de chaque brin dADN tant instables cette temprature. LADN double-brin (2 brins) est dnatur en ADN simple brin (1 brin).

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25C

ADN double-brin

95C 1

2 brins dADN simple-brin

Lhybridation:

Ensuite la temprature est descendue la temprature dite dhybridation. Cette dernire est gnralement comprise entre 50C et 60C et elle est fonction de la composition en dsoxyribonuclotides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces. Les amorces reconnaissent et se fixent leurs squences complmentaires en reformant des liaisons hydrogne. On dit que les amorces shybrident au brin dADN.

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Entre 50C 2 et 60C

Amorce 2 Amorce 1

Llongation:

Puis la temprature est rgle 72C, temprature idale pour lactivit de la Taq polymrase. Cest une enzyme trs spciale, puisquelle est dite thermorsistante. En effet, sa temprature optimale d'action est de 72C et elle est capable de rsister des tempratures allant jusqu 100C. Cette Taq polymrase est extraite dune bactrie extrmophile, Thermus

aquaticus, qui ne vit que dans les sources chaudes. En effet, cest en 1969 que
Thomas Brock dcouvre cette bactrie thermophile, dans le plus grand geyser du monde, le Steamboat Geyser, au parc de Yellowstone aux Etats-Unis.

Amorce 2 72C 3 Amorce 1

Taq polymrase dNTPs

Cette tape permet la Taq polymrase de synthtiser le brin complmentaire lADN matrice, grce aux dNTPs libres prsents dans le milieu ractionnel.

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Au cycle suivant, les nouveaux fragments synthtiss servent leur tour de matrice pour la synthse de nouveaux fragments dADN. En thorie, la fin de chaque cycle la quantit dADN cible est double.

Le premier cycle est fini et voil quun nouveau cycle recommence. Cela se reproduira 30 fois (en fonction du protocole de PCR) comme vous pouvez le voir sur le schma. A partir dune copie dADN cible, on pourra donc obtenir 1 milliard de copie dADN cible.

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Applications de la PCR:

La PCR est trs couramment utilise dans de nombreux domaines:

En mdecine: pour diagnostiquer des maladies gntiques (myopathie, mucoviscidose, etc), des infections virales (SIDA, Hpatite C, SRAS), bactriennes (tuberculose) ou parasitaires (toxoplasmose), mais aussi des cancers.

En recherche fondamentale: Multiples applications routinires.

En mdecine lgale: pour identifier une personne par son empreinte gntique dans le cadre dune enqute judicaire, pour un test de paternit.

En agroalimentaire: pour identifier des varits ou des espces vgtales et animales, pour slectionner de nouvelles varits de fruits et lgumes, comme la tomate pour le contrle de la qualit des produits agroalimentaires, dtecter la prsence dOGM dans un aliment par exemple.

En histoire: pour des tudes phylogntiques sur des squelettes fossiles (ADN fossile), rechercher les liens de parent entre les individus (cas les plus clbres: les enfants de Louis XVII, ou ceux du tsar Nicolas II)

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pour ltude des migrations des populations humaines et animales (en Islande, les indiens dAmrique), pour la dtection dinfections virales, bactriennes et parasitaires sur des momies gyptiennes et andines (par exemple H-C Li et son quipe ont montr la prsence du virus HTLV-1, lorigine du SIDA, dans des momies de la Cordillre des Andes datant de plus de 1500 ans).

Dtection dOGM dans les aliments: Un OGM est un organisme gntique modifi. Cest un organisme dont le patrimoine gntique a t modifi par ajout dun gne ou plusieurs gnes particuliers, confrant ainsi lorganisme de nouvelles caractristiques (par exemple le gne de rsistance un herbicide ou un parasite). Ces gnes ajouts sont appels des transgnes.

Des laboratoires se sont spcialiss dans la recherche dOGM dans de nombreux produits la base de notre alimentation (mas, soja, farine, semoule, gluten, corn flakes, amidons et drivs, extrait protique, sirop de glucose, lait de soja, tourteau, lcithine, etc ...). Aprs avoir extrait lADN des produits ils font plusieurs PCR en utilisant diffrents couple damorces spcifiques pour un transgne connu. Si le transgne nest pas prsent dans le produit, les amorces ne shybrident pas sur lADN et la PCR est ngative. Au contraire, si le transgne est prsent, il sera dtectable par lobtention dun produit damplification et la PCR est positive.

En mdecine: Lutilisation de la PCR dans les laboratoires de diagnostic molculaire se fait de manire routinire.

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En cancrologie, le but est de dtecter des mutations connues dans certains gnes spcifiques du cancer. Cette technique de diagnostic sous-entend que lon connaisse le gne qui est dficient, les diffrentes mutations possibles, qui sont alors responsables dun type de cancer.

Par exemple de nombreuses recherches ont t faites sur le cancer du sein (gnes

BRCA1 et BRCA2), de la prostate ou de la thyrode. On sait maintenant que les mutations

dans le gne BRCA1 sont les plus frquentes et prdisposent la majorit des cancers familiaux du sein et de lovaire. Les mutations du gne BRCA2 sont plus frquentes dans les populations anglo-saxonnes et nordiques. La recherche de mutations dans ces gnes se fait dans le cadre de dpistage de cancer dans des familles risque, sinon cela revient beaucoup trop cher.

Une autre technique qui commence tre de plus en plus utilise est la dtection de marqueur de tumeur. En effet, ce qui diffrencie une cellule normale dune cellule tumorale, cest que cette dernire prsente de nombreuses mutations ayant pour consquence une altration du mtabolisme cellulaire et une drgulation du cycle cellulaire. Ces modifications rendent la cellule immortelle et dans certains cas la cellule devient mobile, cest--dire quelle ne fait plus parti dun tissu donn. La cellule na donc plus le mme phnotype et elle se met exprimer de nouvelles protines.

Ces nouvelles techniques permettent surtout partir dune prise de sang de doser les protines exprimes en grande quantit par les cellules tumorales et de manire non spcifique. Mais dans certains cas le dosage de ces marqueurs tumoraux protique nest pas assez fiable et dautres techniques ont t dveloppes.

En effet, aprs extraction de lARNm partir du sang prlev sur le patient, puis dune tape de reverse transcription de cet ARNm en ADN dit complmentaire on peut

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faire une PCR pour dtecter la prsence de ce marqueur de tumeur ARN. Cette technique utilise, avant ltape de PCR, une enzyme capable de transcrire lARN en ADN comme le fait la reverse transcriptase du virus de SIDA. Cette technique est pour le moment trs peu utilise en routine, car elle est difficile mettre au point et cela revient trs cher.

Dans le cas du cancer diffrenci de la thyrode les mdecins peuvent suivre ltat de leurs patients en dosant la quantit dARNm de la thyroglobuline, protine trs fortement exprime par les cellules tumorales de la thyrode. Cette technique a t rcemment propose comme une alternative prometteuse plutt que lutilisation du dosage de la protine (thyroglobuline) directement.

Attention, il faut savoir que la prsence de certaines mutations dans certains gnes nentrainent pas forcement un cancer. Il faut aussi ajouter cela deux composantes. Premirement, chaque personne est diffrente et ne ragit pas de la mme manire aux mutations, aux traitements, etc. Deuximement, il existe une composante

environnementale, vous avez du en entendre parler: lamiante, certains virus, les ondes lectromagntiques (tlphone, lignes hautes tension)

En Histoire: LADN prlev sur des restes anciens de plantes et danimaux est appel ADN fossile. La recherche sur l'ADN fossile est une activit scientifique trs mdiatise. Vous connaissez peut-tre le film Jurassic Park ? Juste avant la sortie du film, en 1993, une quipe de chercheurs a russi extraire de lADN partir dun charanon fossilis dans l'ambre vieux de 130 millions dannes.

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En gnral, lextraction dADN fossile pose de nombreux problmes. LADN fossile est un matriel trs fragile et soumis diffrentes contraintes environnementales, qui a pour consquence sa dgradation.

Mais lADN peut-tre sauvegard dans diffrents tissus. LADN est extrait partir de tissus mous issus de restes momifis ou de spcimens naturaliss. La conservation des tissus mous peut rsulter de processus naturels comme la conglation en milieu froid (dans le cas dOtsi, lhomme des glaces, retrouv dans les Alpes la frontire entre lItalie et lAutriche) ou la dessiccation dans les dserts chauds et secs. Les tissus mous peuvent aussi tre conservs de faon artificielle (momies, animaux taxidermiss, herbiers des collections, spcimens conservs dans l'alcool). Il est galement possible aujourd'hui d'extraire de l'ADN partir de tissus durs (os et dents). Les milieux froids, les dserts chauds et secs, les tourbires et les fosses goudron prservent mieux l'ADN ancien.

Dans une perspective d'volution molculaire, les squences peuvent servir dterminer les relations de parent entre espces actuelles et fossiles. La premire tude publie sur l'ADN fossile a permis, partir d'une peau naturalise de cent quarante ans, de construire un arbre phylogntique fond sur des donnes

molculaires, reliant le quagga (anctre du cheval) aux espces d'quids actuelles. Cette analyse et les suivantes ont montr que le quagga tait troitement apparent au zbre de Burchell ou zbre commun.

Voici quelques exemples qui ont chang lHistoire :

Ces dernires annes, plusieurs tudes ont port sur la famille Romanov. Selon lhistoire officielle de lURSS, le dernier tsar, Nicolas II, aurait pri la nuit du 16 juillet 1918 avec toute sa famille, son pouse et ses 5 enfants, ainsi que quelques serviteurs.

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Cependant, en 1920, une jeune femme, connue sous le nom de Anna Manahan Anderson, prtend tre la plus jeune des filles du tsar, la grande duchesse Anastasia, qui aurait chapp au massacre. Si bien des gens la souponnrent dimposture, elle fut reconnue comme Anastasia par des membres de la famille impriale, comme la princesse Irne (la tante dAnastasia) ou le grand duc Alexandre (cousin de Nicolas II). La possibilit de squencer lADN ancien allait permettre dtablir la vrit. Anna tait morte depuis plusieurs annes, mais on possdait une biopsie intestinale delle. On put en extraire de lADN et squencer des fragments dADN mitochondrial. Ces squences furent compares celles de membres vivants de la famille de la tsarine (dont le duc dEdimbourg). Il fut ainsi prouv que Anna Manahan ne pouvait en aucun cas tre la fille de la dernire tsarine.

Selon lhistoire officielle, le jeune roi Louis XVII, fils de Louis XVI et de Marie-Antoinette, est mort au Temple, le 8 juin 1795. Mais la rumeur se propagea rapidement que lenfant mort au Temple ntait pas Louis XVII, mais une doublure quon lui avait substitue pour mettre excution un plan dvasion. Ds aprs la restauration, de nombreux prtendants au nom de Louis XVII se firent connatre. On en compta mme jusqu New York, aux Seychelles, aux Aores et en Dalmatie ! Le prtendant le plus srieux fut Naundorff, qui se fit reconnatre comme tant Louis XVII au dbut de la monarchie de juillet par quelques vieux serviteurs de Versailles ou des Tuileries, notamment par Madame de Rambaut, gouvernante de Louis XVII. Son cas ne fut tranch que trs rcemment, grce son ADN (prlev sur son squelette). Et lADN extrait du cur de lenfant mort au Temple que le mdecin responsable avait conserv. La squence des bases de certaines zones de lADN mitochondrial fut tablie pour les deux sources et compare avec la squence correspondante tablie chez des descendantes de Marie-Antoinette.

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Il fut alors clairement montr quil tait impossible que Naundorff soit le fils de Marie-Antoinette, mais que, par contre, lenfant mort au Temple tait trs probablement Louis XVII.

Voici une petite anecdote :

En 1995, cent cinquante ans aprs sa mort, les yeux de John Dalton ont pu tre analyss : la dficience visuelle du dcouvreur du daltonisme tait lie l'absence du gne MW-opsine.