TD2 Biologie Moléculaire

S6/2023-2024

Exercices 1 :

Un ADN monocaténaire (brin positif) présente la composition molaire en base suivante :

adénine = 25%, thymine = 33%, guanine= 24%, cytosine= 18%.
-Quelle est, en présence d’ADN polymérase, la composition en bases du brin négatif
complémentaire néoformé?
- Quelle est dans les mêmes conditions celle de l’ADN bicaténaire (positif + négatif) ?

Exercice 2

Pour faire un travail de recherche en biologie moléculaire, l’étudiant doit réaliser deux
premières étapes. L’extraction de l’ADN à partir des cellules biologiques (eucaryotes ou
procaryotes). Cet ADN doit être pur (il ne doit pas être associé à des protéines). Sachant que
les protéines absorbent à 280 nm et l’ADN à 260 nm, une solution d’ADN dont le rapport Do
280/Do 260nm = 0.02.
Est- ce que cet acide nucléique est pur ?

Exercice 3

Un biologiste a isolé, purifié l’ADN (extraction d’ADN) et mélangé dans une éprouvette
diverses molécules nécessaires à la réplication de l’ADN. Lorsqu’il a ajouté un peu d’ADN au
mélange, une réplication s’est produite, mais chaque molécule d’ADN qui s’est formée se
compose d’un brin d’ADN normal apparié à un grand nombre de segments d’ADN d’une
longueur de quelques centaines de nucléotides.

Quel élément a-t-il probablement oublié d’incorporer dans le mélange ?

1. L’ADN polymérase.
2. L’ADN ligase.
3. Les nucléotides.
4. Les fragments d’Okazaki.
5. La primase.

Exercice 4 :

Dans le but d’étudier la fonctionnalité d’un gène chez les souris, un clonage est réalisé au site
Eco RI du vecteur plasmidique pBR330 et le fragment Eco RI-Eco RI d'ADN génomique de
souris portant le gène d’intérêt. Proposez un protocole de clonage et indiquez comment vous
sélectionnez les clones recombinants ?
Exercice 5 :
Vous avez les enzymes suivantes
KpnI : 5'GGTAC/C3'
Acc65I: 5'G/GTACC3'
BamHI (G / GATCC)
MboI ( / GATC):
Quelle est la relation entre le couple :[KpnI , Acc65I] Et le couple [BamHI, MboI]

Exercice 6 :
Deux fragments d'ADN dont la longueur est de 18 bases :
Fragment A : 5'CCCCGTTCTATCACCAGG3'
Fragment B : 5'CCTATATCTACATATTCC3'
1- Calculer la Tm pour chaque fragment ?
2- Expliquez l'obtention de deux Tm différentes ?

Exercice 7 :
Un fragment d’ADN est coupé d’une part par Hind III, d’autre part par Sma I, puis
conjointement par les deux enzymes. Les fragments obtenus sont les suivants :
 Hind III : 2.5 kb et 5.0 kb
 Sma I : 2.0 kb et 5.5 kb
 Hind III + Sma I : 2.5 kb, 2.0 kb et 3.0 kb
a) dessinez la carte de restriction (On appelle carte de restriction la position des sites de
restriction d’une enzyme sur la séquence d’ADN digéré)

Exercice 8 :
La séquence d’un ADN bicaténaire (double brin), correspondant à un gène, est partiellement
reportée ci-dessous.
5’ ATACGGGATCCGAGCTCTCGATCGTCTGCAGAAATTCC 3’

1) Ecrire la séquence et l’orientation du second brin de ce fragment.

2) Donner le brin complémentaire d’ARN

3) Soient les enzymes de restriction BamH I, Pst I, Xho I et Mbo I dont les sites reconnus sont :
BamH I : 5' G/GATCC 3' ; Pst I : 5' CTGCA/G 3' ; Xho I : 5' C/TCGAG 3' ; Mbo I : 5' /GATC
 3'. Recopier la séquence de l’ADN et encadrer les sites de restriction en indiquant la position
des coupures.

6) On mélange ce brin d’ADN apparié avec son brin complémentaire à un autre fragment d’ADN
double brin. La solution est portée à une température supérieure à leurs Tm respectives, puis
refroidie. Que peut-on attendre? 8) Voici la séquence d’une amorce (ou primer) : 5’ - TTTCTGCA- 3’
Où cette amorce se fixera-t-elle sur la séquence d’ADN ? Quelle séquence obtiendra-t-on après
élongation par la DNA-polymérase ?

Exercice 9 :
Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de séquences parfaitement définies. Il
est donc possible d’établir une véritable carte d’un gène donné par la technique de Southern.
L’ADN à étudier est réparti en différentes fractions. Chaque fraction est traitée par une
enzyme de restriction ou un couple d’enzymes de restriction.
L’illustration 1: Dans le puits 1, on dépose l’ADN digéré par Eco RI seule; dans le puits 2,
on dépose l’ADN digéré par Hind III seule et dans le puits 3, l’ADN digéré par Eco RI et
Hind III. La détection des différents fragments est réalisée à l’aide d’une sonde marquée du
gène étudié. Illustrations des fragments après migration et des positions sur l’ADN ;

- Dessinez la carte de restriction.

Exercice 10 :

Illustration 1 : on dépose l’ADN plasmidique digéré par BamH1 seule; dans le puits 2, on dépose
l’ADN digéré par XhoI seule et dans le puits 3, l’ADN digéré par BamH1et XhoI.
 - Dessinez la carte de restriction.

Exercice 11 :

l’autoradiographie d’un gel de polyacrylamide réalisée pour déterminer la séquence d’un

fragment d’ADN selon la méthode Sanger est représentée ci-contre. Chaque indication
figurant sur le schéma en haut du gel : G, A, T, C correspond à l’incubation en présence d’un
didésoxy-nucléotide-triphosphate. Qu’elle est la séquence de 5’ à 3’ du fragment d’ADN
matrice.

Exercice 12 :
Vous disposez d’un brin d’ADN à séquencer (matrice), d’une amorce, d’ADN polymérase
tronquée*, des quatre 2’-désoxyribonucléotides (dXTP) et d’un jeu des différents 2’,3’-
didésoxyribo-nucléotides (ddXTP). L’amorce est radiomarquée par du phosphore radioactif
32P. L’ADN matriciel à séquencer ACGTAATCGC---- comporte, à son extrémité 3’, une
séquence supplémentaire (représentée ici par un segment de droite en pointillé) sur laquelle
l’amorce va s’hybrider, créant ainsi le site d’initiation de l’ADN polymérase.
*l’enzyme est constituée de plusieurs domaines dont l’un est responsable de la destruction "
programmée " de l’amorce ; après élimination de ce domaine, la fraction restante, désignée "
fragment de Klenow ", conserve l’activité ADN polymérase.
1 — Résumez brièvement le principe de la méthode en indiquant le rôle du
didésoxyribonucléotide.
2 — Compléter le tableau en indiquant la composition des différents milieux réactionnels et, pour
chaque milieu, le type et la taille des fragments néosynthétisés.

3 — Sur le gel ci-dessous, représenter la taille des fragments néosynthétisés dans chaque
milieu réactionnel (utiliser l’échelle de taille représentée à gauche du schéma)

4 — Reporter, à droite, la séquence du brin synthétisé puis la séquence recherchée, en

indiquant le sens de lecture des séquences établies.

Exercice 13 :

1ère partie : Un chercheur vient d’identifier un nouveau gène chez E. coli. Afin de vérifier la
présence de ce gène dans d’autres espèces bactériennes, de l’ADN génomique de ces
différentes espèces est analysé par Southern blot. L’ADN génomique d’E. coli est utilisé
comme témoin positif. La sonde utilisée pour cette expérience est isolée et amplifiée par
Polymerase Chain Reaction (PCR) à partir d’ADN génomique de l’espèce témoin E. coli. Les
séquences des extrémités de la sonde à amplifier sont présentées dans la figure 1.
Les amorces oligonucléotidiques utilisées (20 nucléotides) sont préalablement radiomarquées
à leur extrémité 5’.
Q1- A partir de la séquence ADN présentée dans la figure 1, donnez la séquence du couple
d’amorces pour amplifier par PCR la totalité de la séquence indiquée figure 1.
5’CCTAGGACTGGCTTATAGTG3’ et 5’TCTGTGAACGTGTACCTATC3’

Q2- Décrivez la méthode permettant de radiomarquer ces oligonucléotides à leur extrémité

5’ ? Vous préciserez le nom et la fonction de(s) enzyme(s) ainsi que les réactifs nécessaires.
1) phosphatase (alcaline) pour déphosphoryler l’extrémité 5’ du fragment PCR 2)
Phosphorylation des extrémités 5’ avec la PolyNucléotide Kinase (PNK) en présence
d’ATP ![32P]
2) La PCR est réalisée et le fragment d’ADN ainsi amplifié est utilisé comme sonde pour
des expériences d’hybridation en Southern Blot. Après hybridation, la membrane est
incubée dans différentes solutions de lavages puis autoradiographiée, un signal est
obtenu, mais il est très faible, y compris pour l’ADN génomique d’E. coli (témoin
positif).
3) Q3- Rappelez les principales étapes du Southern Blot.
Extraction de l’ADN Hydrolyse de l’ADN par action d’une ou plusieurs enzymes de
restriction Séparation par électrophorèse sur gel d’agarose en conditions natives
Dénaturation par traitement alcalin
Transfert sur membrane de nitrocellulose
Hybridation avec sonde radiomarquée
Autoradiographie,
révélation selon le marquage de la sonde
Q4- Le chercheur souhaite modifier les conditions expérimentales des lavages afin d’obtenir
un signal plus fort, quel(s) paramètre(s) ce chercheur peut-il modifier et comment doit-il le(s)
faire varier ? Justifiez votre réponse.
Le signal existe, mais il est trop faible. Il faut des conditions moins stringentes. Abaisser la T°
de lavage car plus la température est basse par rapport au Tm et plus les appariements sont
favorisés et/ou Augmenter la concentration en sels car les sels neutralisent les charges
négatives portées par les groupements phosphate permettant de diminuer les répulsions
électrostatiques entre les brins et donc de favoriser les appariements

Figure 1 : Séquences des extrémités du fragment d’ADN à amplifier pour la préparation de la

sonde (seul le brin sens a été représenté, orientation 5’-3’). Les tirets indiquent la présence
d’une séquence d’ADN non définie.

2ème partie : La matrice décrite ci-dessous est utilisée dans un milieu réactionnel contenant
le fragment de Klenow de l’ADN polymérase I et une solution tampon (pH 7,4) contenant des
cations mono- et bivalents (6 tubes identiques numérotés de 1 à 6 sont préparés en parallèle).
Les nucléotides libres indiqués dans le tableau suivant sont ajoutés, en quantités équimolaires
(équivalentes), dans chacun des 6 tubes qui sont alors incubés pendant 10 minutes à 37°C (cf.
tableau).

Tube N°1 Aucun

Tube N°2 dCTP
Tube N°3 ddGTP + dATP
Tube N°4 dCTP + dATP + dTTP + dGTP
Tube N°5 dATP + dTTP + dGTP + ddCTP
Tube N°6 dCTP + dATP + dTTP + dGTP +ddCTP

Tableau: Nucléotides ajoutés dans chacun des six tubes

Q1- Rappelez les activités enzymatiques du fragment de Klenow de l’ADN polymérase I.

Polymérisation 5'--!3' et exonucléase 3'--!5'.

Q2- Pour chaque mélange, donnez le nombre total de fragments d’ADN obtenus. Indiquez la séquence
du brin signalé par la flèche pour chacun de ces fragments.
Tube N°1 0 fragment : le brin indiqué d’une flèche est entièrement hydrolysé
Tube N°2 1 fragment 5’GGTAC3’
Tube N°3 1 fragment 5’GGTACTG3’
Tube N°4 1 fragment 5’GGTACTGATAGATCATATGAAT3’
Tube N°5 1 fragment 5’GGTACTGATAGATC3’
Tube N°6 2 fragments 5’GGTACTGATAGATC3’ 5’GGTACTGATAGATCATATGAAT3’