L3 Biochimie, FSNV, UFAS1

Mme BOUCHEFFA S
2020/2021

1
 Introduction

Définition:
Le génie génétique ou téchnologie de
l’ADN recombinant est l’ensemble des
techniques (identification, isolement,
transfère et modification) de
manipulation des génomes

Bref Historique:
1868 Friderich Miescher découvre l'ADN.
1953 Watson et Crick élucident sa structure et établissent le modèle de la
double hélice
1961 marque la découverte du code génétique qui a permis de comprendre le
langage simple de l'ADN
1970 le Suisse Werner Arber isolent les endonucléases (= enzymes servant
aux bactéries à dégrader l'ADN d'organismes parasites). Elles sont
devenues pour les chercheurs de véritables "ciseaux" biologiques
permettant de découper l'ADN de n'importe quel organisme en petits
morceaux très précis
 Pourquoi on fait du génie génétique?

• En médecine (vaccins, sondes, thérapie genique)

• Biotechnologie (domaine alimentaire: vitamines, enzymes
acides aminés)
• Clonage
• Animaux/plantes transgeniques
• Production de protéines (insuline, GH…..)

Les outils de génie génétique

Génie génétique

Les cellules Les Les

Les sondes
hôtes vecteurs enzymes

3
 ADN recombinant
ORGANISME DONNEUR : VECTEUR
Extraction d'un fragment (fragment d'ADN
d'ADN d'intérêt capable de réplication
autonome)

Insertion du fragment d'intérêt

dans le vecteur

Obtention d'un ADN Recombinant

-Expression et purification des protéines correspondantes

ou
- Obtention de plusieurs copies d’ADN d’interet

ADN
d’interét

plasmide

L’hôte 4
4
5
 Les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont des protéines synthétisées par des

bactéries pour se protéger des infections des virus (bactériophages). Ces
enzymes coupent l’ADN viral à des endroits spécifiques. Ce mécanisme de
résistance aux bactériophages, dénommé restriction

Les enzymes de restriction sont des endonucléases spécifiques qui

coupent l'ADN à l'intérieur en cassant les liaisons phosphodiester. Elles
coupent au niveau de sites spécifiques appelés « sites de restrictions »,
ces sites sont de nature palindromique, c'est-à-dire que la lecture des
deux brins complémentaires dans des sens opposés donne la même
séquence.
6
 Caractéristiques du site reconnu par les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction

Reconnaissent des séquences
spécifiques sur l’ADN de 4 à 8
paires de bases (pb)

7
 3 types d’enzymes de restriction isolées des bactéries

Type I : Dont l’action nécessite la présence de Mg++, d’ATP et de S-adénosyle-

méthionine. Leur site de coupure est éloigné de leur site de reconnaissance

Type III : Ressemblent à celles du type I pour la séparation des sites de

reconnaissance et de coupure, mais qui s’apparentent à celles du type II par leur
mode d’action.

Type II : reconnaissent l’ADN à des sites particuliers et coupe dans ces sites ou à
proximité immédiate d’eux. Ce sont des endonucléases, Pratiquement les seules
utilisées en génie génétique, à cause de leurs propriétés de coupure et de
reconnaissance. Coupe à l'intérieur de la séquence d'ADN db au niveau des sites de
reconnaissance et de coupure spécifiques, générant des fragments d'ADN double brin
se terminant par 5'-phosphate.

Le E.C. de ces enzymes (The Enzyme Commission number) est le suivant:

E.C.3.1.21.4.

3 =(classe): Hydrolase
1 =(sous classe): Agissent sur les liaisons esters (Estérases)
21= (sous-sous classe): Leurs produits gardent leurs phosphates 5’initial
4=Nécessite la présence de Mg++dans le milieu.
8
 Nomenclature des enzymes de restriction
 La première lettre, en majuscule, représente l’initiale du genre bactérien.
 Les deux lettres, minuscules, qui suivent la première sont représentatives de l’espèce.
 Le chiffre romain qui suit ces trois lettres est le numéro d’ordre de découverte de
l’enzyme pour la même bactérie source.
 La dernière lettre majuscule n’est pas obligatoire pour toutes les endonucléases de
restriction. Elle est représentative de la souche de la bactérie d’où l’enzyme a été
isolée.
Exemple EcoRI

E Escherichia genre

co coli espèce

R RY13 souche bactérienne

1ere à
I être
Ordre
d’identification
identifier 9
 Action des enzymes de restriction

Exemples d’enzymes de restriction

extrémités collantes extrémités franches

Utilisation d’enzyme de restriction pour la
production d’ADN recombinant

11
 Utilisation des endonucléases de restriction pour établir la mappe de
restriction (carte de restriction)

Une carte de restriction est une carte de sites de restriction connus dans une séquence
d'ADN. La cartographie de restriction nécessite l'utilisation d'enzymes de restriction

12
Méthylation de l’ADN: effets sur les Enzymes de restriction

La méthylation de l’ADN est l’une des modification les plus courants de

l’ADN chez les eucaryotes et les procaryotes. Chez les bactéries, cela
fait partie du système de défense restriction-modification contre
l’infection par les phage , les bactéries hôtes protègent leur propre
ADN contre le clivage par leurs enzymes de restriction endogènes.

Le système de défense des bactéries

13
 Enzymes de modification des acides nucléiques

Modifient l’ADN (gène d’interêt et vecteurs) par ajout ou élimination d’un

groupement chimique

14
 I. Les polymérases:

Synthétisent de l’ADN ou de l’ARN in vitro.

1. ADN polymérases: Elles réalisent des liaisons phosphodiesters entre deux
nucléotides adjacents.

a) Fragment de Klenow: obtenu par digestion

enzymatique de la polymérase I d’E.coli. Ce
fragment conserve l’activité polymerase et
exonuclease 3’-5’ et perd l’activité exo-
nuclease 5’-3’.
Utilisé dans le séquençage de l’ADN (méthode
de Sanger)

b) Taq polymérase : extraite à partir d’une bactérie Thermus aquaticus , Active à

70°C, utilisée dans la technique PCR, en vue d’une amplification de l'ADN in vitro.

2. ADN polymérase ARN dépendante (réverse transcriptase): vient de rétrovirus

synthétise de l’ADN à partir de l’ARN, utilisée dans la technique RT-PCR.

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 II. RNase (Ribonuclease)

Nucléase qui catalyse la dégradation de l'ARN en petits

fragment .
Les ARN intracellulaires sont protégés de l'activité RNAse par : le coiffage des
extrémités 5', la polyadénylation des extrémités 3' et le repliement au sein d'un
complexe protéique d'ARN (RNP).

• La RNase A : coupe le simple brin en 3’ des résidus pyrimidiques

(après C et U) et donne des nucléotides 3’phosphate.

ARNsb

Rnase A

16
• La RNase T1 : coupe du simple brin après un G et donne un 3’phosphate.

• La RNase H : hydrolyse le brin d'ARN dans un double brin hybride

ADN:ARN. Ceci leur permet d'hydrolyser l'ARN viral après qu'il a servi
de matrice pour synthétiser un ADN double brin qui va s'insérer dans le
génome de la cellule infectée, Elle coupe après tous les nucléotides

17
 III. Les enzymes coupant l’ADN
DNase
• Enzyme de la digestion des ADN chez les
animaux (pancreas).
• Active contre les molécules ADNsb et
ADNdb.
• Endonucléase, coupant préférentiellement
sur les liaisons adjacentes aux nucléosides T
et C.
• La DNase I est couramment utilisée dans
l'extraction d'ARN
La nucléase S1
•Agit sur ADNsb, ARNsb à de faibles
concentrations, à des concentration
élevées , agit sur ADN/ADN,
ADN/ARN ET ARN/ARN
•agit en milieu acide, en présence d’ions
Zinc.
•produite par Aspergillus oryzae
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 IV. Les enzymes modifiant l’ADN

Enzymes modifient l'ADN par addition ou suppression de

groupes chimiques spécifiques

• la phosphatase: Catalyse l’élimination d’un

groupement phosphate en 5’ Empêchant
donc la formation de liaison
phosphodiester (empêche toute action
des ligases): phosphatase alcaline

• La T4 polynucléotide kinase rajoute un

phosphate en 5’ γ de l’ATP sur une
fonction alcool du carbone 5’ d’un ADN ou p
d’un ARN

• Les méthylases agissent sur les sites de

restriction en les méthylant pour
empêcher l’action des enzymes de
restriction. 19
 V. Les ligases : coller

Elles réalisent des liaisons phosphodiesters, pour souder deux

segments d'ADN, Active à 16 °C. C'est une enzyme capitale
puisqu'elle permet la construction de molécules d'ADN
recombinées.

1. ADN ligase d’E. coli L'enzyme

n'agit que si les 2 ADN sont
associes par des extrémités
cohésives. Cette ligase assure la
formation des liaisons
phosphodiesters entre une
extrémité 3'OH et une extrémité
5' phosphate.

2. T4 ADN ligase Elle est capable

d'effectuer des ligations entre 2
ADN a bouts francs.
20
 CHAPITRE II
Hôtes et vecteurs de
clonage

21
 Hôtes de clonage

Définition
Les hôtes sont les systèmes vivants ou les cellules dans lesquels le porteur
de la molécule d'ADN recombinant ou du vecteur peut être propagé.
Il existe différents types de cellules hôtes: procaryotes (bactéries) et
eucaryotes (champignons, animaux et plantes).

Caractéristiques d’un hôte idéal

• Capable de croissance rapide en milieu peu coûteux;

• Non pathogène

• Capable d'incorporer de l'ADN

• Génétiquement stable en culture

• Equipé d'enzymes appropriées pour permettre la réplication du vecteur

Types des cellules hôtes utilisées en génie génétique

-Facilement Génétiquement très

-Génétiquement transformable bien connue
très bien connue. - Non pathogène - Non pathogènes
- Nombreuses - Protéines secrétés - Assure la
+ souches disponibles naturellement maturation des
- Formation ARNm et des
d’endospores protéines
facilitant les - Facile à cultiver.
cultures.
Potentiellement - Génétiquement - Plasmides
- pathogènes (LPS) instable instables
-Périplasme - Génétique moins -Pas de réplication
piégeant les connue qu’E. coli pour la plupart des
proteins plasmides
procaryotes.
 Méthodes d’introduction de l’ADN à cloner dans les cellules hôtes

Transformation d’une cellule bactérienne en utilisant un traitement

au CaCl2

Les bactéries doivent subir

une forme de traitement
physique et / ou chimique qui
augmente leur capacité à
absorber l'ADN. Les cellules
qui ont subi ce traitement
sont dites compétentes

La microinjection
méthode directe pour introduire de
l'ADN dans le cytoplasme ou le noyau. Il
s’agit d’une procédure microchirurgicale
réalisée sur une seule cellule, à l’aide
d’une aiguille de verre , d’un dispositif de
positionnement de précision (un
micromanipulateur) pour contrôler le
mouvement de la micropipette et d’un
microinjecteur

24
 Eléctroporation

C’est la création de pores dans la membrane

d’une cellule, par des impulsions électriques,
afin de permettre la pénétration de certaines
molécules

La biolistique (GENE GUN)

méthode de transfert direct de gène dans une cellule. le principe consiste à projeter sur des tissus des
microparticiles de tungstenes ou d’or enrobées d’ADN à l’aide d’un canon à particles, la force de
propulsion est obtenue soit par explosion d’une poudre dans une balle, soit par détente d’un gaz sous
pression , certaines des microparticules vont penetrer dans les cellules , transportant avec elle l’ADN,
cet ADN peut ensuite atteindre le noyau et s’y integrer
Le canon à gènes est limité aux tissus exposés, tels
que l'épiderme ou aux cellules d'une feuille de plante.
 Vecteurs de clonage

2 types de vecteurs

• Un vecteur d'expression est un vecteur dans lequel • Un vecteur de clonage est un vecteur ayant une réplication
on va cloner le même fragment d'ADN après autonome dans la cellule hôte et un site multiple de clonage
vérification du clonage dans le vecteur de clonage afin de cloner un fragment d'ADN d'intérêt.
(taille de l'insert, séquence...) et grâce à son
promoteur (constitutif ou inductible) ce vecteur va
diriger la bactérie hôte d'expression pour produire
la protéine d'intérêt.

Un vecteur de clonage est un petit élément génétique à

réplication autonome dans un organisme hôte compatible,
afin de produire plusieurs copie du gène d’intérêt. Ils
sont conçus pour permettre l’intégration d’un ADN
étrangé dans un site spécifique sans que cela affecte sa
propre réplication.

Le clonage: c’est l’action d’isoler et d’insérer dans un vecteur un fragment d’ADN

d’interet pour le multiplier à l’identique
 Caractéristiques d'un vecteur de clonage idéal

1-Origine de Réplication (Ori)

-Conffère une replication autonome pour le
vecteur
-ori es une séquence specifique ou commence la
réplication du vecteur et de l’ADN integré

2-Site de clonage
-C’est un site ou le vecteur peut être digéré et
un ADN étranger peut être inséré par les même MCS
enzymes de restriction POLYLINKER
-Des plasmides recombinant peuvent présenté
de multitude de site de restriction (MCS:
Multiple cloning site) qui peuvent avoir jusqu’à
20 sites de restriction

3-Marqueurs de sélection
-Gène qui confère une résistance à des
antibiotiques particuliers ou des agents
sélectifs

4-Genes rapporteur, ou gène de sélection

-Faciliter l'identification du clone réussi.
 Vecteurs bactériens
(plasmides, Phages, phagmides, cosmides, BAC )

1- Plasmides

Molécules d'ADN bicaténaire circulaire, extrachromosomique, capables de se répliquer indépendamment de la

cellule hôte, transmissibles à la descendance de façon stable, leur taille est inferieur à 10kb (< 5% de la taille
du chromosome bactérien).

• Un gène de sélection tel que ampr, qui code pour

l'enzyme-lactamase et confère une résistance à
l'ampicilline.
• Séquence d'origine de réplication (ORI) dans laquelle
la réplication de l'ADN est initiée par les enzymes
de la cellule hôte.
• Polylinker contenant les séquences de reconnaissance Insertion de
pour plusieurs enzymes de restriction différentes l’ADN exogène
(chaque site du polylinker est unique sur le plasmide).
• Les fragments clonés dans un plasmide ont une taille
de 100pb à 5kb
• 100 copies identiques de l’ADN cloné dans un
Vecteur de clonage
plasmide dans une cellule hôte. plasmidique
• combinent une facilité de purification avec des
propriétés souhaitables telles qu'une efficacité de
transformation élevée
 Le pBR322
Le pBR322 vecteurs de clonage construit par
génie génétique sur la base d’une chimère
rassemblant les éléments intéressants des
plasmides naturels et en augmentant le nombre
de sites uniques de coupure par les enzymes de
restriction.
tetrar
Vecteurs (pUC)
Le plasmide pUC19, taille de 2686pb
-présente un gène de résistance à l’ampicilline
de pBR322
-possède une région de régulation du gène lacZ
de l’opéron Lactose qui code pour le promoteur
et le peptide α de β- galactosidase dans lequel a
été introduit un MCS (Multiple cloning site),
contenant toute une série de sites de coupure
unique.

Le fait que ce polylinker soit inséré dans le gène

ampr lacZ qui intervient dans le catabolisme du
lactose permet de révéler facilement
l’intégration d’un insert par « inactivation
insertionnelle).

ori

Caractéristiques
-Origine de réplication
-2 gènes de résistance aux antibiotiques
(ampicilline et tétracycline )
-Plusieurs séquences de reconnaissance uniques
d’enzymes de restriction
-Une petite taille (4361pb)
 Les différentes étapes du clonage plasmidique

Étape 2 Préparation Étape 3 Réalisation du recombinant

Étape 1 Préparation du vecteur
de l’ADN à insérer

Étape 4:
Étape 5:
Incorporation
Etalement ,
dans l’hôte
culture et
purification

30
 Bactériophage λ

• virus d’E. coli génétiquement

complexe,
• présente un ADN linéaire double
brin de 48 kb. Après infection
de la cellule bactérienne, l’ADN
se circularise.
• Possède des extremités
cohesives naturelles , elle
s’associent pour former le site
cos(éléments important pour la
réplication et l'encapsidation de
bactériophage )
• La région verte du génome
(figure) contient des gènes qui
ne sont pas essentiels à la
croissance et à l’encapsidation
de lambda. Cette région peut
être remplacée par de gros
inserts d’ADN étranger (jusqu’à
environ 23 kb).
 Chromosome
Plasmide Ti Chromosome artificiel artificiel de
de levure (YAC). Vecteur cosmide bactérie (BAC).

• C’est un plasmide
• Plasmide de La • Développés pour • Construits a
transporter d’énormes dans lequel on a partir du
bactérie
quantités d’ADN inséré les séquences plasmide F
Agrobacterium eucaryote (150-2 000
tumefaciens (140 utilisé pour la
kb). cos du transformation
à 235 kb) agent • Centromère de levure
responsable de bactériophage λ. et le clonage
(ségrégation lors de la
maladie des galles mitose).
dans des
• Encapsidation in bactéries,
chez les plantes • Séquences de
• Utilisé pour télomères sont vitro de grand généralement
produire des présentes aux deux E. Coli.
extrémités. Une cellule
fragment d'ADN de • ● Capacité
plantes
transgéniques de levure traitera cette 35 à 45 kb d'insérer
structure, bien jusqu'au 300
qu'artificielle, comme kb.
un chromosome.

32
Variation de la taille des inserts d’ADN selon le type de vecteur
• Le clonage de l’ADN – soit dans des cellules, soit in vitro
– permet à des molécules d’ADN d’être sélectivement
répliquées en un nombre de copies très élevé. Quand il
est amplifié par ce moyen, l’ADN est efficacement
purifié et le clonage de l’ADN permet d’étudier des
séquences ADN isolées de l’ADN génomique.

• L’hybridation des acides nucléiques : approche

complètement différente. Au lieu d’essayer de purifier
individuellement des séquences d’acides nucléiques,
l’objectif est de les détecter spécifiquement et de
suivre leur devenir au sein d’une population complexe qui
représente un échantillon biologique.
 I,Hybridation moléculaire:

Association de 2 acides nucléiques simples brins de séquences complémentaires et qui

conduit à la formation d'un double brin ou duplex par formation de liaisons H entre ces
deux brins.

 Detection d'une molecule d'ADN ou d'ARN dans un mélange contenant des milliers de
similaires: "trouver une aiguille dans une meule de foin"

La formation et la stabilité des duplex dépendent de nombreux facteurs :

• la composition en bases
• Longueur des duplex
• complexité de la séquence (taille des séquences non repétés.
 1) Principes de l’hybridation des acides nucléiques

Dans l’hybridation des acides

nucléiques, une population d’acides
nucléiques connus (SONDE) permet
d’analyser une population d’acides
nucléiques mal connus

 Une sonde est un ADN mono-

brin ou ARN, ayant une
séquence complémentaire à la
séquence à détecter.
 En s’hybridant avec sa
séquence cible, elle permet
de la détecter.
2) Types de sondes
 Sonde génomique: fragment obtenu par coupure de l’ADN génomique.
 Sonde ADNc : sonde ADN obtenue par transcription réverse d ’un ARNm
messager (= séquence codante).
 Sonde oligonucléotides : ADN (ou ARN) simple brin de 18 à 50 nucléotides
synthétisé chimiquement.

3)Facteurs ayant une influence sur l’hybridation

 La température: la température optimale d’hybridation est en général
inférieure de 25% à la Tm de la sonde. Tm = 4 (C+G) + 2(A+T) ; Ta = Tm-5
 La taille des fragments ou des sondes.
 La force ionique: l’hybridation est accélérée en forte concentration saline.
 La durée de l’hybridation : plus l’hybridation est longue, plus la rencontre
entre séquences complémentaires est favorisée
 3 La température de fusion de l’ADN Tm
(melting Température)

 C’est une température, appelée également Température de demi

dénaturation (Tm) qui correspond à l’ouverture ou au déroulement de 50%
de la chaîne de l’ADN chauffé.
La valeur de Tm des ADN est une fonction linéaire du pourcentage de (G +
C) de l'ADN
Une solution d’ADN simple brin absorbe plus les UV que la même solution
d’ADN double brin. Cette caractéristique est connue sous le nom de
hyperchromicité
 Exemple d’application de l’hybridation moléculaire Le Southern blot
Consiste à détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur
hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope.
Applications.
• Mise en évidence de réarrangements chromosomiques.
• Diagnostics de maladies héréditaires
- délétions ou insertions de grandes tailles
- Mutations au niveau d’un site de restriction (RFLP)

Clivage par des

enzymes de
restriction
 II. Les agents de marquage des acides nucleiques (sondes)

Marquage : Méthode consistant à incorporer un nucléotide radioactif,

fluorescent ou modifié chimiquement dans une molécule d’acide
nucléique.

a) Isotopes radioactifs: qui permettent de constituer des sondes « chaudes »:

ex: Le P32 est le plus utilisé pour le marquage des nucléotides. Il émet des
rayonnements β qui vont impressionner des plaques photographiques lors de
l'autoradiographie

b) Marqueurs non-radioactifs: qui constitueront les sondes « froides » :

La détection des sondes froides est basée sur une réaction enzymatique
qui fera apparaître un produit coloré ou fluorescent ou bien une
production de photons. Ex: biotine (interaction covalente avec l’avidine),
digoxigénine (Ac-Ag) , fluorescéine (émet une lumière réfléchie de
fluorescence lorsqu'elle est excitée sous les ultraviolets)……
 III. Techniques de marquage des sondes

1) Nick translation (déplacement de brèche)

But: couper des petits bous d’ADN pour les

remplacer par de l’ADN marqué

a) Cassure aléatoire par une endonucléase , la

Dnase
b) Agrandissement des cassures parl’activité
exonucléase 5’—3’ de l’ADN polyI
c) Synthèse d’ADN grace à l’activité
polymerase de l’ADN poly I en utilisant des
dNTP marquées

Résultat: obtention d’un ADN bicatenaire

contenant des nucléotides marqués sur les deux
brins
2) Multi-Random priming= multi amorcage au hasard

But : synthèse de l’ADN marqué

a) Chauffage de l’ADNdb puis refroidissement
brutal entrainant une séparation définitive
des 2 brins
b) Synthèse de façon aléatoire d’une multitude
d’amorces
c) Parmi ces amorces, certaines vont
forcement rencontrer leurs séquences
complémentaires sur l’un des brins d’ADN
d) Synthèse d’ADN par l’ADN poly en utilisant
des dNTP marquées

Résultat: obtention de 2 molécules d’ADN

bicentenaires (dont un seul brin est marqué par
molécule)
 3) Marquage aux extrémités
• Marquage 5’P: grâce à une polynucléotide kinase
Échange de phosphates par la polynucléotide kinase , en présence de γp32 d‘ATP,
la polynucléotide kinase échange le phosphate en 5’ de la sonde, ce qui permet de
la marquer.

• Marquage 3’OH: La transférase terminale catalyse l’addition de

désoxynucléotides sur une fonction alcool 3’OH terminale de l’ADN