Les enzymes utilisées en biologie

moléculaire – Le clonage

Dr Amadou KONE
Enseignant – Chercheur
Biologie moléculaire et cellulaire, Immunologie
Faculté des Sciences et Techniques FST
Laboratoire SEREFO – FMOS/FAPH
Université des Sciences, des techniques et des
technologies de Bamako
Tel : +223 78 59 82 19 | 65 14 05 04
BP E4419
E-mail : amadoukone@icermali.org
koneamadou@gmail.com
koneamadou@yahoo.com
 Sommaire

• Les enzymes de restriction

• Les polymérases
• Les nucléases
• Les ligases
• Autres enzymes
• Clonage

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1. Les enzymes de restriction

3
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1. Les enzymes de restriction

Généralités
• Enzymes d’origine bactérienne
• Système de défense des bactéries contre les
bactériophages
• reconnait une séquence précise et coupe
l’ADN à une position précise
• On distingue endonucléase et exonucléase
– Endonucléase : coupe à l’intérieur de la séquence
– Exonucléase : coupe aux extrémités

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1. Les enzymes de restriction

STRUCTURE ET NOMENCLATURE

Axe de symétrie
STRUCTURE PALINDROMIQUE

Séquence palindromique
NOMENCLATURE

Chiffre de

EcoRI
Genus: Lettre en caractérisation : Chiffre
majuscule et romain
italique I: 1er enzyme
Espèce : 2 première
E: Escherichia découverte chez E. coli
lettre en italique
co: coli

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1. Les enzymes de restriction

DIFFERENTS TYPES
Type I : coupure aléatoire 1000 à 1500 bases après le site reconnu.
Type II : coupure au niveau de la séquence reconnue.
Type III : coupure une vingtaine de paires de bases après la séquence
reconnue

Utilisation surtout des enzymes de type II +++.

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1. Les enzymes de restriction

TYPES DE COUPURE

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Exemple: EcoRI

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ISOSCHIZOMERES

Coupure cohésive MboI

Coupure franche DpnI

Isoschizomères : enzymes différentes reconnaissant le même site de coupure et

le coupent différemment.

ISOCAUDOMERES

Isocaudomères : enzymes différentes reconnaissant des sites de coupures

différents pour obtenir des fragments aux extrémités identiques. 10
1. Les enzymes de restriction
Applications des enzymes de restriction : 2 grands domaines

1 - Cartographie d’un fragment d’ADN :

Établissement d’une carte de restriction grâce à la position relative des sites de restriction.
Ÿ Identification de mutations créant ou supprimant un site de coupure (mucoviscidose, drépanocytose,
etc.)

Ÿ Étude des polymorphismes mini-satellites? RFLP (criminologie, test de paternité, etc.)

2 - Construction de molécules d’ADN recombinantes :

Un fragment de restriction peut être recollé (« ligué ») à un autre fragment d’ADN si les
deux extrémités sont compatibles, c’est à dire présentent les mêmes extrémités cohésives
ou franches.
Ÿ Création de banques d’ADN.
Ÿ Études d’expressions, protéines de fusion, OGM…
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1. Les enzymes de restriction
La carte de restriction

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Exemple de carte de restriction :

Ÿ Coupure d’un ADN linéaire ou d’un plasmide par une

enzyme de restriction, puis par une autre, puis par les
deux…
Ÿ Séparation des fragments générés par électrophorèse.
Ÿ Évaluation du nombre et de la taille des fragments.

2 sites 1 site de
de coupure
coupure

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14
 c. Applications des enzymes de restriction
Construction de
Génération d’ADN recombinants protéines de fusion.

Identification d’une
séquence codante
® Gène ?

Étude du fonctionnement
d’un promoteur.

Création d’OGM
(Organismes
Génétiquement
Modifiés).
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 Applications des enzymes de restriction
Criminologie

Séquence 4 a été obtenue à partir de l’ADN de cellules

prélevées dans une goutte de sang sur le lieu du crime.
Cette empreinte a permis d’identifier le coupable dont
l’empreinte génétique est identique. 16
1. Les enzymes de restriction
Visualisation des fragments d’ADN
Electrophorèse en gel d’agarose (1%).

Dépôt des échantillons à la

pipette: ADN chargé
négativement.

+ -

Séparation en fonction de la taille.

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4.3. Les outils enzymatiques
b. Visualisation des fragments d’ADN

Electrophorèse en gel d’agarose (1%).

Gel coloré dans un bain de BET

500 pb

1. Marqueur de taille moléculaire (1kb plus).

2. Vide.
3. Un produit de PCR » 500 pb.
4. Fragment » 4.5 kb d'un plasmide digéré par EcoRI 18
2. Les polymérases

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2. Les ADN polymérases

Séq. d’hybridation
des amorces ADN à amplifier

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Les polymérases

• ADN polymérases ADN dépendantes :

Synthèse d’ADN à partir d’un brin d’ADN.
Besoin d’une amorce et 3’OH libre – synthèse chimique possible = primers ou
oligonucléotides.
La Taq polymérase (Thermus aquaticus (1965) ® thermostable) :
Activité polymérisation 5’ - 3’
Pas d’activité exonucléasique donc pas de correction des erreurs (1x105).
Le fragment de Klenow (digestion enzymatique de l’ADN pol I d’E.coli) :
Activité polymérisation 5’ - 3’ et activité de correction (1x106).
La Pfu et la Pwo (Pyrococcus furiosus et Pyrococcus woesei)…
(Dépend des commerciaux!!)
T4 et T7 ADN polymérases :
Activités 5’ - 3’ polymérase et 3’ - 5’ exonucléase plus fortes que la Klenow.
Utilisées pour rendre franches des extrémités sortantes.

Ø Utilisation : Analyse par PCR, Clonage, Séquençage. 21

 Les polymérases (suite)

• ADN polymérases ARN dépendantes :

Synthèse d’un brin d’ADN à partir d’un ARN. Origine virale (retro-transcription - RT)
Les « Reverse transcriptase » :
Activité 5’ - 3’ polymérase, pas de correction (3’ - 5’ exonucléase) d'erreur.
- MMLV et AMV sont des RT virales.
- Superscript (Invitrogen) : synthèse de grand cDNA.
- Fluoroscript (Invitrogen) : incorpore plus facilement les nucléotides fluorescents pour fabriquer
des sondes à hybrider sur les puces à ADN.

Ø Utilisation: Synthèse d’ADN complémentaire (ADNc) à partir

des ARN messagers,
RT-PCR.
On peut utiliser trois sortes d’amorces :
- soit un oligo - dT = population d’ADNc.
- soit une amorce au hasard = population d’ADNc dont l’extrémité 5’ est variable.
- soit une amorce spécifique = ADNc de séquence unique correspondant à un seul gène 22
 Les polymérases (suite)

• ADN polymérases n’ayant pas besoin de matrice :

Terminal transférase:
Enzyme rare qui ajoute des nucléotides en 3' d’un brin d’ADN en présence de dNTP. Si on
veut en ajouter qu'un seul, on ajoute un ddNTP.
Les télomérases:
Ribonucléoprotéines qui catalysent l'addition de motifs répétés à l'extrémité des
chromosomes de séquence TTAGGG.
• ARN polymérases ADN dépendantes :

T7, T3 et SP6 ARN polymérases:

Activité 5’ - 3’ polymérase en présence de ribonucléotides.
Reconnaissent un promoteur spécifique et synthétise un ARN complémentaire au brin en aval de ce
promoteur. Ces trois polymérases sont issues des phages T7, T3 ou SP6 et reconnaissent chacune
un promoteur spécifique de ces phages.

Ø Utilisation: Analyse d’un gène cloné derrière un promoteur spécifique.

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3. Les autres enzymes

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 Les nucléases
• Les DNAses :
Dégradation de l’ADN.
DNAse I:
Endonucléase qui coupe l’ADN db et sb au hasard (di, tri et oligonucléotides 5’-P et
3’-OH).
Nucléase S1:
Spécifique des ADN simple brin en milieu acide, en présence d'ions
Zinc.
Ø Utilisation: Empreintes génétiques,
Dégrader l’ADN lors des réactions de transcription ou
après extraction d’ADN, Faire
des bouts francs aux extrémités des fragments d'ADN…

L’Uracile DNA-glycosidase:
Clive l’ADN au niveau des uraciles présents dans l'ADN après amplification par PCR.
Cette enzyme est principalement utilisée dans les typages moléculaires à l’aide de PCR
pour éviter les contaminations croisées entre PCR.
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 Les nucléases
• Les RNAses:
Dégradation de l’ARN.
RNAse A :
Coupe côté 3‘ après les résidus pyrimidiques (C, U) en donnant un 3' phosphate libre sur
l'ARN simple brin.
RNAse T1 :
Coupe en 3' après G donnant un guanosine 3' Phosphate libre.

Ø Utilisation: Dégrader l’ARN, pour séquencer directement l’ARN ou

pour couper les fragments d’ARN non hybridés à de l’ADN.
RNAse H :
Digère l'ARN dans un complexe ARN-ADN. On s’en sert pour éliminer l’ARN après avoir
fabriqué un premier brin de cDNA à l’aide de la reverse transcriptase.
Les inhibiteurs de RNAse :
Ces RNAses sont des enzymes extrêmement stables, elles peuvent se renaturer après
chauffage à 100°C. Quand travail sur ARN, utiliser un inhibiteur de RNAse tel que la RNasin® :
protéine de 50 kDa qui inhibe les RNAses en interagissant avec elles selon une stoechiométrie
1:1.
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 Les ligases
Formation des liaisons phosphodiester entre les extrémités 3’OH et 5’-P libres.

T4 ADN ligase:
Elle ligue de l’ADN double brin. Elle a besoin d'ATP et d’ions divalents.

La Taq ADN ligase:

Même activité que la T4 ADN ligase, elle est plus stable et s’utilise à 45°C.

ADN ligase d’E.coli:

Ligue des extrémités cohésives double brin d’ADN. Inefficace pour liguer des extrémités
franches ou pour liguer de l’ARN. Elle utilise du NAD comme cofacteur.

T4 ARN ligase:
Catalyse la jonction entre un 5‘-P d'un ARN ou d'un ADN sb avec un 3'OH (ions divalents et
ATP).
Ø Utilisation : Ligation d'extrémités cohésives ou franches de fragments de
restriction (15-20°C pendant 4 à 16 heures). Attention, si les deux
extrémités sont déphosphorylés, la ligation ne peut avoir lieu.
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 Les autres…
• Les phosphatases et kinases :
Phosphatase alcaline bovine (CIP):
Catalyse le retrait du phosphate en 5‘ (zinc, magnésium et pH 9 – 10). Thermolabile, elle peut
être inactivée par incubation à 65°C pendant une heure.
Phosphatase alcaline de crevette (SAP):
Peut être utilisée dans la plupart des tampons compatibles avec les enzymes de restriction. Elle
est moins stable que la CIP et est inactivée par une incubation de 15 min à 65°C.
Ø Utilisation: Déphosphoryler les vecteurs avant liguation insert pour éviter sa recircularisation.

T4 polynucléotide kinase:
Transfert le phosphate en γ de l'ATP sur le 5'OH de l'ADN ou ARN (double ou simple brin).
Ø Utilisation: Marquage de l'extrémité 5' de l'ADN, marquage des oligonucléotides.

• Les méthylases :
Méthylation de l’ADN pour protection ADN bactérien contre propre digestion par les enzymes de
restriction.
Ø Utilisation: Inhiber la digestion d’un fragment. Détection des zones méthylés de l’ADN. 28