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clonage moléculaire et

pluricellulaire
Plasmide
Bactériophage
Cosmide

• Un cosmide est un plasmide (avec son origine de


réplication, ses gènes de sélection et son site de
polyclonage) dans lequel on a inséré les
séquences cos nécessaires à l'encapsidation dans
des particules de bactériophage X.
Phagemide ou  phasmid
• Les phagemides sont des molécules hybrides entre
un plasmide et un phage.
• Ce sont des molécules d'ADN bicaténaires,
circulaires.
• Ils possèdent une origine de réplication, au moins un
gène de résistance à un antibiotique, un site de
polyclonage.
• Et une séquence provenant du phage Ml 3
contenant l'origine de réplication qui permet
d'obtenir la forme monocaténaire.
Les YACs
• Yeast Artificial Chromosome ou chromosome artificiel
de Levure, Saccharomyces cerevisiae: sont des
vecteurs construits à partir de séquences d'ADN
chromosomique de Levure.
• Ils possèdent une origine de réplication (ARS,
Autonomous Replicating Séquence).
• Plusieurs gènes de sélection codent pour des enzymes
permettant de sélectionner les Levures ayant
incorporé un vecteur viable.
• Un site de clonage unique, situé dans le gène SUP42 ,
permet l'introduction d'ADN étranger ainsi que
• la sélection des vecteurs recombinants
• D'autres vecteurs permettent également le
clonage de grands fragments d'ADN : les
Bacterial Artificial Chromosome (BAC) ou les
Pl-derived Artificial Chromosome (PAC).
Transformation des bactéries
• Afin de faciliter la pénétration des molécules
d'ADN au travers de la paroi et de la membrane
plasmique, les bactéries en phase exponentielle
de croissance sont fragilisées (comme p. ex. par
un traitement au chlorure de calcium à 4 °C).
• Ces bactéries ainsi préparées, appelées bactéries
compétentes.
• Ils sont mises en contact avec la solution de
plasmides à intégrer. Puis la membrane plasmique
est momentanément rendue perméable soit par
un choc thermique, soit par un choc électrique
transgénèse
• Le terme de transgénèse qui représente l'intégration et
l'expression d'un gène étranger dans le génome d'un
organisme donné.

• La transgénèse comprend deux opérations distinctes :


l’addition et le remplacement de gène.

• La première est très largement pratiquée chez plusieurs


espèces, la seconde commences seulement à être mise
en œuvre chez des espèces autres que la souris.

• Il faut bien définir le LCR (locus control region).


Les étapes de la transgénèse

• Etape 1 : Identifier, isoler, intégrer et multiplier


un gène d'intérêt

• Etape 2 : Transférer le gène

• Etape 3 : Régénérer et évaluer les organismes


transformées
• L’addition et le remplacement de gène sont des
techniques laborieuses mais standardisées chez la
souris et les plantes.
• Il n’en est pas de même pour d’autres espèces,
notamment pour les oiseaux et les gros
mammifères.
• Malgré ses imperfections, la transgénèse a été
largement adoptée par les expérimentateurs ainsi
que par certains industriels.
• Environ 1 000 gènes ont été modifiés par
recombinaison homologue chez la souris
• La première protéine recombinante issue du lait  a
été mis sur le marché en 2000.
• Plusieurs dizaines de plantes transgéniques
destinées à la consommation humaine sont sur le
marché ou en cours d’expérimentation.
• Des animaux transgéniques sont également prêts à
être proposés aux consommateurs.
Les techniques
de transfert de gène
1. Le transfert de gène dans les gamètes
2. Le transfert de gène dans les embryons au
stade une cellule
3. Le transfert de gène par l’intermédiaire de
cellules
4. Le transfert de gène dans les organites
cellulaires
5. Le transfert de gène à l’aide de vecteurs
épisomiques
1. Le transfert de gène dans les gamètes

• C’est une microinjection de gène dans les


ovocytes des animaux.

• L’introduction d’une particule rétrovirale


recombinante recouverte de l’enveloppe du VSV
(vesicular somatitis virus) entre la zone pellucide
et la membrane de l’ovocyte. conduit au transfert
et à l’intégration des gènes du vecteur
• L’enveloppe du virus VSV permet une haute efficacité
d’infection, et l’intégration est facilitée par l’absence de
membrane nucléaire de l’ovocyte au moment choisi pour
réaliser l’infection.

• cette technique est actuellement appliquée à la vache


seulement.

• La mise en contact direct des spermatozoïdes avec des


solutions d’ADN suivie d’une fécondation in vitro ou in vivo,
n’a conduit qu’à l’obtention d’un très petit nombre d’animaux
transgéniques:

• Plusieurs invertébrés marins, des poissons, des poulets et un


porc transgéniques ont pu être obtenus de cette manière.
2. Le transfert de gène dans les embryons au
stade une cellule

• Cette technique perd très nettement de son


efficacité chez les gros mammifères du faible
taux d’intégration de l’ADN étranger.

• Pour contourner ces difficultés, les embryons


peuvent être obtenus après maturation des
ovocytes et fécondation in vitro. Après
microinjection, les embryons sont cultivés
jusqu’au stade blastocyste.
3. Le transfert de gène par l’intermédiaire de
cellules
• Les cellules dans lesquelles on a transféré des
gènes peuvent être un intermédiaire intéressant
pour engendrer des organismes transgéniques.

• La formation de chimères à partir de cellules


multipotentes: blastocyste (cellules ES) ou des
cellules primordiales germinales d’un foetus
(cellules EG).
• Ces cellules sont considérées comme
multipotentes si elles peuvent coloniser une
morula ou un blastocyste après y avoir été
introduites par microinjection.

• L’obtention de clones à partir de cellules


différenciées: plus simple consiste, en principe, à
recréer un embryon et un organisme entier à
partir d’une cellule plus ou moins différenciée.
• Le transfert de gènes est le plus souvent
réalisé par biolistique. Ce procédé consiste à
projeter à haute vitesse des microbilles
métalliques enrobées d’ADN.

• Ces projectiles traversent la paroi cellulosique


et la membrane plasmique et délivrent ainsi
leur ADN dans la cellule
4. Le transfert de gène dans les organites
cellulaires

• Deux organites cellulaires, les mitochondries chez


les animaux et les chlorophastes chez les plantes
sont des cibles pour le transfert de gène.

• Des fragments d’ADN étranger peuvent être


transférés dans des mitochondries isolées, et les
mitochondries peuvent être introduites par
microinjection dans des cellules hôtes.
• L’ADN étranger peut être introduit par
biolistique ou par un système particulier de
microinjection.
5. Le transfert de gène
à l’aide de vecteurs épisomiques

• Les vecteurs capables de se répliquer de


manière indépendante du génome principale
par: des plasmides, des phages, des cosmides,
des BAC et de YAC.
LE CLONAGE DES ANIMAUX
• Le clonage est par définition la reproduction
d'organismes génétiquement identiques. Ceci
implique en pratique un mode de reproduction
non sexuée.
• Le clonage est le mode naturel de reproduction
chez des organismes unicellulaires (bactéries,
levures).
• Chez les organismes pluricellulaires, le clonage
implique un phénomène de dé-différenciation.
• La dé-différenciation est donc la capacité pour
une cellule appartenant à un tissu donné de
donner naissance par division cellulaire à des
cellules filles capables de produire toutes les
fonctions cellulaires.
02 techniques de clonage des animaux:

• Le clonage par clivage d'embryon


• Le clonage par transfert de noyau
1. Le clonage par clivage d'embryon

• Les cellules de l'embryon très précoce sont


considérées comme totipotentes.

• Les embryons de mammifère jusqu'au stade


blastocyste peuvent être mécaniquement clivés.
Les deux moitiés d'embryon peuvent dans
certaines conditions se développer et donner à
des jumeaux vrais.
2. Le clonage par transfert de noyau
• Après la fécondation, le noyau du spermatozoïde,
dans lequel aucun ou très peu de gènes sont
actifs.
• Quelques heures ou jours après, les gènes
provenant du spermatozoïde sont activés pour
permettre le développement de l'embryon.
• Le cytoplasme de l'ovocyte doit donc posséder les
éléments qui permettent la programmation du
génome du spermatozoïde.
Le principe du clonage est d'utiliser cette
propriété du cytoplasme de l'ovocyte pour ré-
activer les gènes de la différenciation à partir de
n'importe quel type de noyaux, notamment
ceux des cellules somatiques
TRANSFORMATION GÉNÉTIQUE DES VÉGÉTAUX
PAR AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

• Agrobacterium tumefaciens est une bactérie


tellurique responsable de la galle du collet ou
crown gall (zone de liaison entre la racine et la
tige).

• Une maladie des plantes dicotylédones, qui se


traduit par une division anarchique des cellules au
point d'infection et le développement d'une
tumeur végétale.
• Lors du processus d'infection, des mécanismes
moléculaires complexes mènent à l'intégration de
façon stable d'un fragment d'ADN –plasmide-
d'origine bactérienne dans le génome de la
plante.

• A. tumefaciens possède un grand plasmide, le


plasmide Ti (pour Tumour inducing), qui porte une
part importante des informations nécessaires au
transfert d'ADN bactérien dans le génome de la
plante hôte.
• La région T, présente sur ce plasmide Ti,
correspond à la séquence d'ADN qui sera
transférée dans le génome végétal sous le nom
d'ADN-T.

• Cette région est délimitée par 2 répétitions


directes de 25 paires de bases, les bordures.
Entre ces bordures sont localisés : (i) les gènes induisant le développement de la
tumeur (oncogènes), dont l'expression entraîne des déséquilibres dans la balance
hormonale des cellules transformées
(ii) les gènes qui dirigent la synthèse des opines, acides aminés liés à un sucre
utilisables par la bactérie et non par la plante
La région vir porte une série de gènes de virulence qui codent pour des protéines
intervenant dans les mécanismes de transfert de l'ADN-T dans la cellule végétale
(sous forme simple brin).
• Ainsi, l'interaction entre A. tumefaciens et la
plante hôte constitue un mécanisme naturel
de transfert d'ADN chez les plantes. Ce
mécanisme a été modifié pour devenir un
outil versatile de transformation génétique.