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Biotechnologies animales et végétales

Transgenèse végétale et applications

Sommaire

Introduction!

2

1

- Une nouvelle approche : la transgénèse végétale !

2

2- Les différentes étapes de la transgénèse!

3

3 - La construction génique !

3

 

a - Gène d'intérêt

4

b - Marqueur de sélection

4

4 - Méthodologies de transfert de l'ADN chez les végétaux !

5

 

a - Transfert indirect

5

b - Vectorologie et protocole de transformation

7

c - Transfert direct

8

5 - Quelques applications !

9

 

a - Résistance aux insectes

9

b - Tolérance aux herbicides

10

c - Ramolissement des fruits

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d - Riz enrichi en β-carotène

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e - Modification de l'amidon

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f - Production de molécules d'intérêt pharmaceutique

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Introduction

Amélioration des plantes :

* Domestication des plantes sauvages L'homme la pratique depuis très longtemps

* Amélioration des plantes

* Critères de sélection Augmentation du rendement, de la qualité. Résistance à des stress bioti- ques et abiotiques

Mais il y a des limites :

* Barrières interspécifiques

* Gènes intéressants liés à d'autres gènes présentant des caractères non désirés

* Caractère polygénique

1 - Une nouvelle approche : la transgénèse végétale

* OGM : organisme dont le matériel génétique est modifié d'une manière qui ne s'eectue pas naturellement par multiplication et/ou par recombinaison naturelle

* Transférer une séquence connue à la plante Cette séquence va être introduite dans le génome de la plante. On connaît au préalable la séquence qu'on introduit

* Intégration de manière stable dans le génome de la plante

Obtenir des nouvelles variétés avec des fonctions prédéfinies

Apporter des fonctions nouvelles

La transgenèse est possible, car tous les organismes vivants et les virus possèdent le même système de codage et d'expression de l'information génétique

vivants et les virus possèdent le même système de codage et d'expression de l'information génétique 2

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Les cultures transgéniques ont surtout des résistances aux insectes et des tolérances aux herbicides

Les 4 plantes les plus concernées par les OGM :

- Coton

- Soja

- Maize

- Canola

Les États-Unis remportent la palme du pays qui réalise le plus d’OGM

2- Les di érentes étapes de la transgénèse

1ère étape : identifier le gène d'intérêt On connait la séquence, la fonction et ce que cela peut apporter à la plante 2ème étape : réaliser une construction génique 3ème étape : transformation de la plante et régénération par culture in vitro 4ème étape : Caractérisation des transformants. Tri des individus ayant les meilleurs ca- ractéristiques. Transfert et analyse en serre et au champ. Demande d'autorisation. La ca- ractérisation passe par une analyse moléculaire

3 - La construction génique

* Gène d'intérêt fonction

On part d'un eucaryote, on utilise l'ADNc (copie d'ADN double brin à partir d'un ARNm). On utilise pour cela une enzyme (ADN polymérase ARN dépendante) qui va induire une "reverse transcription". On utilise l'ADNc, car il n'y a plus de séquence intronique donc il est plus facile à manipuler ou à transférer. Il n'y aura plus besoin d'épissage, car il pour- rait être aberrant s’il a lieu dans un organisme autre que celui normalement destiné

* Marqueur de sélection sélection des cellules, tissus transformés

Il faut très vite sélectionner les tissus transformés, car si on repique des plantes non transformées, les coups seront très chers (main d'oeuvre)

* Di érentes parties sont clonées dans un vecteur (E.Coli)

- Enzymes de restriction, PCR

- Ligature dans un vecteur

- Transformation de cellules E.Coli compétentes

- Analyse des recombinants E.Coli

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! a - Gène d'intérêt

!

* Séquence codante

* Promoteur fort et constitutif Constitutif : sera actif dans tout les organes de la plante

Exemple d'un promoteur fort : 35S du Virus de la Mosaique du Chou-fleur (très utilisé pour la transformation de dicotylédones). C'est un virus à ADN qui attaque les crucifères. Pour la multiplication, le virus passe par un intermédiaire ARN

Promoteur d'un gène actine ou ubiquitine. : ce sont des promoteurs fort pour les mono- cotylédones

On peut avoir des promoteurs tissu spécifique, qui vont être exprimé que dans certains endroits de la plante (que dans le tubercule pour la pomme de terre par exemple)

* Séquence de terminaison

* Peptide signal

On utilise un peptide signal si on veut adresser une protéine à un compartiment donné lorsque c'est nécessaire

! b - Marqueur de sélection

!

* Promoteur, séquence codante, séquence de terminaison

* Gène de résistance à un antibiotique

Exemple : nptII (néomycine phosphotransférase) détoxifie des antibiotiques de la famille des aminoglycosides. Transfert d'un groupement phosphate sur l'antibiotique et lorsqu'il est phos-

phorylé, il n'a plus d'action. Il n'est plus utilisé aujourd'hui, car on a peur des transferts de gènes dans le tractus digestif du bétail du gène chez les bactéries

* Gène de tolérance à un herbicide

* Marqueur de sélection positive

Exemple : manA (phosphomannose isomérase). On met du mannose dans le milieu de culture, le mannose est absorbé par la cellule et est transformé en mannose-6-phosphate par l'action d'une hexokinase, mais l'inconvénient ensuite c'est que le man-6-phosphate, mais les plantes qui possè- dent le gène de la phosphomannose isomérase vont le métaboliser en fructose-6-phosphate qui sera assimilable par l'organisme

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4 - Méthodologies de transfert de l'ADN chez les végétaux

Transfert direct ou transfert indirect

! a - Transfert indirect

!

* Bactérie

- Agrobacterium tumefaciens

- Agrobacterium rhizogène provoque un chevelu racinaire (hairy root). Utilisation nes transformées sécrétant molécules d'intérêt

* Virus

de raci-

Agrobacterium thumefaciens : provoque la formation de tumeur

Bactérie phytopathogène tellurique de la famille des Rhizobiacées (elle infecte plus de 90 familles de dicotylédone, peu de monocotylédones)

Le pouvoir pathogène est situé sur le plasmide pTi (Tumeur indicing) :

- Il se trouve en 1 ou 2 copies dans chaque bactérie

- Il est très grand 200 à 400 Kpb

dans chaque bactérie - Il est très grand 200 à 400 Kpb On distingue plusieurs régions

On distingue plusieurs régions :

ADN-T : le T pour transfert, car c'est cette région qui va être transféré depuis la bactérie jusqu'à l'ADN du noyau végétal. Il n'y a aucune fonction qui permet le transfert sur l'ADN végétal et donc il est a distinguer d'un transposon

25 bp repeats (FD et FG) : ce sont les frontières gauche et droite par rapport à l'ADN-T. Ce sont des séquences répétées imparfaites de petite taille (25 pb) qui délimité l'ADN-T et donc c'est ce qu'il se trouve entre ces frontières qui va être transféré à la cellule végétale

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Gènes de virulence : il se trouve soit sur le chromosome ou la région Vir Ce sont eux qui permettent le transfert de l'ADN-T dans la cellule végétale

L'ADN-T contient des oncogènes

* Gènes de synthèse d'auxine (iaaM et iaaH)

La synthèse d'auxine se fait à partir du tryptophane, grâce au iaaM, le tryptophane donnera indolacé-

tamide qui subit l'indolacétamide hydrolase et le gène iaaH pour donner l'acide indolacétique

* Gène de cytokinine (ipt) ipt : isopentémyltransférase

* Gènes modulant l'e et de l'auxine et/ou des cytokinines

* Gènes de synthèse d'opines On les retrouve que chez les organismes infectés par les Agrobactérium. On classe les Agrobacte- riums en souche selon le type d'opine qu'elles sont capables de faire exprimer à la plante infectée

Suite à une blessure de la plante, A.tumefaciens transfère l'ADN-T dans le noyau de la cellule végétale

Le transfert de l'ADN-T s'e ectue grâce aux gènes de virulence

* L'ADN-T ne porte aucune fonction permettant son transfert vers la cellule végétale

* Les gènes de virulence sont localisés sur :

- Le chromosome

- La région Vir

Le transfert de l'ADN-T

Initié lorsque la bactérie perçoit des composés phénoliques (substances chimiotactiques; acétosyringone) et des sucres relargués par les cellules végétales blessées. La bactérie s'attache à la cellule végétale grâce à un réseau de fibres de cellulose (synthétisé par la bactérie)

Transduction du signal et induction des gènes de virulence

* VirA est un chimiorécepteur membranaire de composés phénoliques s'autophospho- ryle

* VirA phosphorylée phosphoryle VirG

* VirG phosphorylée induit sa propre expression et celle des autres gènes de virulence

Formation d'un complexe multiprotéique VirD4 et VirB1-11 qui constitue une structure en forme de pilus qui assure le transport de l'ADN-T Les protéines VirD1 et VirD2 coupent l'ADN-T au niveau des frontières droite et gauche La protéine VirD2 se lie de manière covalente à l'extrémité 5' du monobrin d'ADN-T

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L'ADN-T est transféré à la cellule végétale sous forme de monobrin

transféré à la cellule végétale sous forme de monobrin La bactérie à gauche et la cellule

La bactérie à gauche et la cellule végétale à droite Les protéines Vir E2 se lient sur toute la longueur de l'ADN-T, dans les cellules végétales Les gènes situés sur l'ADN-T sont exprimés dans la cellule végétale Les protéines Vir D2 et Vir E2 permettent l'entrée de l'ADN-t

! b - Vectorologie et protocole de transformation

!

Système binaire

* Clonage (dans E.Coli) du gène d'intérêt et du marqueur de sélection dans un vecteur d'expression contenant les séquences frontière droite et gauche

* L'agrobactérie contient un plasmide pTi désarmé sans l'ADN-T qui cause le cancer chez les plantes, mais qui conserver les gènes de virulence qui permettent le transfert de l'information géné- tique dans la cellule végétale

* Le vecteur d'expression est transféré de E.Coli jusqu'à l'agrobactérie (conjugaison, élec- troporation)

* Les protéines Vir agissent sur l'ADN-T situé sur le vecteur d'expression et permettent son transfert vers la cellule végétale

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La transformation par Agrobactéries

* Agrobactéries en présence des explants végétaux (acétosynragone)

* Transfert sur milieu de culture in vitro adapté à la plante

* Coculture, car milieu de culture adapté à la plante et/ou pousse aussi la bactérie

* Transfert sur un milieu de sélection contenant un antibiotique pour éliminer les agrobac- téries et l'agent de sélection

* Régénération de plantules par culture in vitro en présence de l'agent de sélection

* Contrôle de la transformation, est-ce que le transgène est présent ? Est-ce qu'il s'exprime? Est-ce que la protéine attendue est elle exprimée ? Quels sont les individus avec les meilleures caractéristiques ?

c - Transfert direct

! !

* L'électroporation

Elle est pratiquée sur des protoplastes. Ces protoplastes sont mis en présence de l'ADN qu'on souhaite transférer on place ensuite les protoplastes dans une cuvette d'électro- poration stérile on place cette cuvette dans l'électroporateur ensuite on fait de la culture in vitro formation de cals indi érenciés régulateurs de croissance : auxine, cytokine régénération in vitro de plantules

* Impulsions électriques (plusieurs centaines de volts, quelques millisecondes)

* Di érence de potentiel désorganisation de la membrane

* L'ADN pénètre par les pores formés dans la membrane plasmique

* L'ADN s'intègre au hasard dans le noyau

* La biolistique

Utilisation d'un canon à particules. Bombardement de billes de tungstène ou d'or qui sont recouvertes de l'ADN qu'on souhaite transféré à la cellule végétale

Le bombardement sous un flux d'hélium sous vide partiel pour ne pas que les billes soient freinées par l'air.

L'avantage c'est qu'on peut utilisé directement des explants végétaux (feuilles, tiges des protoplastes qui ne se régénèrent parfois pas en plantule

)

et non pas forcement

Les particules pénètrent dans la cellule, plus ou moins profondément. L'ADN s'intègre dans le noyau. Régénération de plantes in vitro

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5 - Quelques applications

a - Résistance aux insectes

! !

La chenille de la pyrale du maïs : mise en évidence d'une endotoxine de Bacillus thurin- giensis lorsque la bactérie sporule. Protéines Cry (endotoxine) spécifique des coléoptè- res, lépidoptères et diptères

Mode d'action de l'endotoxine : La protéine est ingérée par l'insecte et dans le tube di- gestif se lient à un récepteur membranaire des cellules épithéliales de l'insecte. La pro- téine Cry sera activée par une protéase et suite à cette activation, elle forme la formation de pore dans les membranes de ces cellules épithéliales. La conséquence c'est que l'in- secte perde l'appétit et l'insecte meurt

*Risques

* Flux de gène : dissémination non contrôlée des transgènes (pollen, semence) donc risque pour l'environnement

* Choix de l'agriculteur et du consommateur pour la culture conventionnelle, OGM ou bio- logique

* Toxicité vis-à-vis d'insectes non ciblés Le papillon monarque est un emblème aux États-Unis. On remarqué que le pollen de maïs transgénique venait se poser sur d'autres plantes que venait butiner cet insecte, et il mourait * Apparition de résistance chez les insectes Les plantes transgéniques n'auraient plus d'effet

*Comment retarder l'apparition de résistance ?

* Utilisation d'une variété conventionnelle sur une partie des surfaces cultivées de maïs Bt zone refuge : réservoir d'insectes sensibles

* Si refuge : insectes SS du refuge descendance SS ou SR tuée dans champs transgé- niques (S = sensible ; R = résistance)

* Absence de refuge : individus SR et RR s'accouplent entre eux -> descendance SR et RR. Mais Bt sans eet !

*Bilan

* Hutchinson et al., 2010 (Science)

* Évolution populations de pyrales et bénéfices agricoles en 1996 et 2009

* Culture du maïs Bt profite aux agriculteurs n'ayant pas choisi maïs transgénique, car le fait qu'il y a moins d'insectes, les plantes non transgéniques ne se font plus détruire par

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les insectes et ces semences non transgéniques coute moins cher donc c'est plus ren- table, mais ceci est grâce aux agriculteurs qui ont fait de l'agriculture transgénique

b - Tolérance aux herbicides

! !

Qu'attend-on d'un herbicide ?

Il doit être e cace Peu de risque pour l'environnement Il faut qu'il soit spécifique (pas comme le round-up qui tue tout)

Tolérance au glyphosate (round up) Tolérance au glufosinate

*Tolérance au glyphose

* Le glyphosate inhibe la 5-énol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) Le

EPSPS intervient dans la synthèse des acides aminés aromatique

* Enzyme chloroplastique codée par un gène nucléaire (plantes) L'enzyme est synthétisé

dans le cytoplasme, mais est adressé au chloroplaste

* Mutant de Salmonella typhimurium tolérant au glyphosate Mutation qui donne une protéine EPSPS qui montre une affinité moins grande pour le glyphosate

A aiblir la sensibilité de la plante à l'herbicide

Maïs GA21 (Syngenta Seeds) :

* mEPSPSynthase de maïs (99,3% d'homologie avec le gène sauvage)

* Promoteur d'un gène d'actine du riz; séquence d'adressage au chloroplaste; séquence de terminaison : nos 3'

* Bombardement de particules (fragment 3,4 kb)

* Aucun marqueur de sélection on applique directement le round up

Maïs NK603 (Maïs Roundup Ready) :

EPSPS de A.tumefaciens : séquence modifiée pour contenir codons préférentiellement utilisés par la plante

2 cassettes d'expression :

Promoteur 35 S avec région activatrice dupliquée; intron HSP70 de maïs; peptide signal d'adressage au chloroplaste de EPSPS d'A.thaliana; nos 3' Promoteur d'actine 1 de riz avec intron associé; peptide signal de EPSPS d'A.thaliana; nos3'

La transformation s'est faite par biolostique. Autorisation pour importation pour UE. Inter- dit à la culture en UE

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Étude toxicologique :

Séralini et al, 2012. Food and Chemical Toxicology (available 19 semptember 2012 on line)

Dispositif expérimental :

100 rats mâles, 100 rats femelles répartis en 10 groupes de 10 animaux

1 lot : nourris avec maïs non OGM et eau du robinet

3 lots nourris avec 11, 22 ou 33% de maïs OGM traité avec Roundup

3 lots nourris avec 11, 22 ou 33 % de maïs OGM non traité avec Roundup

3 lots nourris avec maïs non OGM et eau avec 3 concentrations di érentes de Roundup

Durée de l'expérimentation : 2 ans. Évaluation de mortalité, pathologies, caractères bio- chimiques

Des résultats et des critiques :

- Augmentation de la mortalité

- Développement de tumeurs mammaires

- Congestion, nécrose du foie, pathologies rénales chez mâles

Perturbations hormonales dues au Roundup et maïs OGM

Mais :

- Faiblesse des tests statistiques, nombre d'animaux utilisés

- Choix de la lignée de rats lignée de rat qui a tendance à développer des tumeurs

*Tolérance au glufosinate

* Analogue du glutamate

* Bialaphos (phyn, antibiotique produit par Streptomyces viridochromogenes. Inhibe la glutamine synthétase enzyme qu'on trouve chez les bactéries, seul enzyme qui permet de mé- taboliser l'ammonium. Cela dit l'excès d'ammonium est toxique donc la plante meurt

* Gène-bar (bialaphos résistance) codant une phosphinotricine acétyltransférase (permet de transférer un groupement sur la phosphinotricine qui ne peut plus inhiber la gluta- mine synthétase

* Phosphinotricine acétylée est inactive sur le plan herbicide

détoxification de l'herbicide

Risques :

* Flux de gènes entre plantes transgéniques et non transgéniques dans parcelles voisines coexistence OGM, plantes conventionnelles ou bio

* Flux de gènes vers les plantes adventices, autres espèces

* Repousse si on change de culture, l'ancienne résistante ne pourra plus être éliminé avec l'insecti- cide

* Apparition de résistance de ces plantes vis-à-vis de l'herbicide

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! c - Ramolissement des fruits

!

* Tomates Flavr Savr ou Mac Gregor (1994) premier aliment transgénique mis sur le marché

* Cible : polygalacturonas produite au moment où le fruit commence à murir. Elle dépoly- mérise les pectines et le fruit ramollit

* Approche anti-sens

* Tomate reste ferme (stockage, transport

)

Production des lycopènes le transgène n'agit que sur le ramollissement du fruit

! d - Riz enrichi en β-carotène

!

* Envisagé pour la déficience en vitamine A β -carotène précurseur de la vitamine A

* Enrichir le riz en provitamine A

* Approche impossible par sélection classique

* Riz ne contient pas de β -carotène, mais contient son précurseur (géranyl-géranylpyro- phosphate)

Biosynthèse des caroténoïdes :

mais contient son précurseur (géranyl-géranylpyro- phosphate) Biosynthèse des caroténoïdes : 12 sur 16

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Un prototype : synthèse de β-carotène dans l'endosperme de riz

2 x Géranyl-géranyl pyrophosphate (phytoène synthase)Phytoène (Phytoène désa- turase)ζ -carotène (Lycopène β -cyclase) β carotène (1,6microgramme de caroté- noïdes/g)

Améliorations du prototype :

* Augmenter la quantité de β-carotène

* Enlever le gène de résistance à l'antibiotique

* optimiser le choix des gènes

* Validation dans d'autres variétés de riz

* Laboratoires publics et privés (Syngenta, Zeneca)

Du prototype au Golden Rice I et II :

(Syngenta, Zeneca) Du prototype au Golden Rice I et II : Analyse de di ff érents

Analyse de di érents gènes psy dans cals de maïs :

Zeneca) Du prototype au Golden Rice I et II : Analyse de di ff érents gènes

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Analyse de gènes psy dans le riz :

animales et végétales Analyse de gènes psy dans le riz : Essai aux champs (Louisiane) en

Essai aux champs (Louisiane) en 2004 et 2005 Rétrocroisements GR1 et GR2 dans le riz indica. Avril 2008 : essai au champ aux Philippines

e - Modification de l'amidon

Amylose (20 à 30%) : chaines linéaires de glucose reliées par des liaisons alpha-1,4 glu- cosidiques Amylopectine (70 à 80%) : chaînes ramifiées (liaisons alpha-1,6 glucosidique)

*Biosynthèse de l'amidon

AGPase : ADP-glucose pyrophosphorylase amidon synthase (SS) enzyme de branchement (SBE) amidon synthase liée au grain (GBSS)

* Utilisations : colles, gélifiants, textiles, emballages, produits cosmétiques, enrobage des comprimés

* Di érentes approches :

- Augmentation de la quantité d'amidon (surexpression de AGPase)

- Enrichissement en amylose ou en amylopectine (en utilisant l'approche antisens)

Pomme de terre "Amflora"

* BASF Plant Science

* Pomme de terre féculière Prévalent. EH92-527-1

* Amylopectine : 98 % ; amylose : 2%

* Autorisation de la commission européenne le 2 mars 2010 pour

- Utilisation des co-produits pour l'alimentation animale

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- Culture et utilisation industrielle

Construction et transformation :

* ARN antisens de BBSS. Provoque dégradation de l’ARNm

* Résistance à kanamycine

* Transsformation par A.tumefaciens

* Protéine GBSS non détectable

* Protéine NPTII non détectable dans amidon, ni bouilli 1 minute

Évaluation de l'impact sur la santé humaine :

* Risque associé à NPTII :

- Souris : administration de dose élevée

- Milieu digestif de ruminants

- Simulation milieu digestif humain

* Risque associé au transfert de résistance à NPTII

- NPTII ubiquitiste (tube digestif de l'Homme et animaux, environnement)

- Nécessité de franchissement de barrière génétique bactérienne

- Système d'expression eucaryote

f - Production de molécules d'intérêt pharmaceutique

* Demande croissante de protéines humaines, molécules d'intérêt pharmaceutique, anti- corps

* Production dans les microorganismes, mais certaine modifications post-traductionnel sont di érentes chez certaines bactéries

* Production dans les animaux transgéniques ou cultures cellulaires animales mais les coûts sont exorbitant et on n'est jamais à l'abri de contaminer la culture par des virus, prions

* Production dans les plantes, une alternative intéressante, car pas de pathogène ani- maux chez les végétaux (plus au niveau de la sécurité sanitaire)

Quelques exemples :

* Avidine

* Trypsine : protéase utilisée dans l'industrie pharmaceutique

* Lipase gastrique (Meristem therapeutics) : lipase recombinante canine

Planticorps (anticorps) :

Di érents types : igG, igA sécrétoire

Pour avoir les 2 chaines. On transforme une plante qui synthétise la chaine lourde, une

autre la chaine légère ensuit on croise les 2 plantes

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Production dans les plantes, mais

* N-glycosylation (di érente entre les protéines des animaux et les protéines des végé- taux). Elles sont réalisées dans le réticulum endoplasmique qui sont communes aux 2 règnes. C'est dans la dernière phase de l'appareil de Golgi que les 2 voies divergent. A partir de la N-acétylglucosamine transférase que les voies di ère Présence d'oligosaccharides typiquement végétaux

:

Di érences au niveau des N-glycosylations :

* Addition de β (1,2)-xylose et alpha (1,3)-fucose (alpha (1,6) fucose chez les mammifères)

* Absence d'acide neuraminique chez les végétaux (résidu terminal fixé sur galactose chez les mammifères)

Quels risques ?

* Quelle utilisation de la protéine recombinante ?

* Allergénicité

Quelles solutions ?

* Modifier la séquence peptidique pour supprimer les N-glycosylations

* Retenir les protéines au niveau du réticulum endoplasmique (KDEL, HDEL)

* Inhiber la N-acétylglucosaminyltransférase

* Exprimer de nouvelles glycosyltransférases pour "humaniser" les protéines produites dans les plantes (ex : galactosyltransferase animale)

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