Chap IV - La Mutagénèséne

UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP
LABORATOIRE DE BIOTECHNOLOGIES
VEGETALES
COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Pour les étudiants de Licence 2 SV
Chapitre II : Les Outils du Génie Génétique
Dr. DIAGA DIOUF

Professeur titulaire
La mutagénèse
La mutagénèse est la modification de la séquence d’ADN soit au

hasard, on parle de mutagénèse aléatoire ou à un endroit précis, on
parle de mutagénèse dirigée.
Mutagénèse Mutagénèse
dirigée
Mutagénèse
aléatoire Mutagénèse
par culture
Mutagénèse
de tissus
par
insertion
Mutagénèse
Mutagénèse chimique
physique
Pr. DIAGA DIOUF- COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Pour les étudiants de Licence 2 BCGS - 2014
Mutagénèse aléatoire
Je veux par exemple identifier le gène responsable de la couleur des
yeux chez la drosophile. Je réalise une mutagénèse aléatoire sur les
œufs et je sélectionne au niveau de la descendance les individus
ayant un défaut de pigmentation des yeux. Je localise la région
mutée puis le gène impliqué dans la coloration des yeux.
Mutagénèse Physique
C’est en 1930 que Muller a observé qu’une mutation pouvait être

induite par des rayons-X. Ils induisent une petite délétion sur les
fragments d’ADN par bombardement aux neutrons ou aux rayons-
γ.
Mutagénèse chimique
Mutagénèse chimique est induite par certain agents chimiques. Le

plus utilisé est l’acide sulfonique éthyl méthane (EMS). Cet agent
alkylant peut induire des modifications chimiques de nucléotides
provoquant des mutations non sens, silencieuse. EMS peut induire
un changement C en T conduisant à une substitution de C/G à T/A
à une faible fréquence, EMS génère une transversion G/C à C/G ou
une transversion A/T à G/C.
On peut utiliser:
-l’hydroxylamine, désamine C
- acide nitreux , désamine C, A, G,
Mutagénèse par insertion
Utilisation
-d’Agrobacterium tumefaciens permet d’insérer d’une manière stable
et au hasard des gènes dans le génome des plantes
- de transposons ou de rétrotransposons ce qui a permis de
caractériser certains gènes
- d’ARNi (ARN interférant)
Mutagénèse par culture de tissus
La culture de tissus peut induire des variations au niveau de la

séquence d’ADN appelée variation somaclonale. Par ailleurs certains
transposons et rétrotransposons sont activés durant la culture de
tissus, conduisant à des mutations.
Mutagénèse dirigée
La mutation est induite à un endroit précis au niveau de la séquence

d’ADN. Elle est induite en utilisant un ADN simple brin ou un ADN
double brin.
Mutation dirigée à partir d’un ADN double brin:
Par PCR inverse
On amplifie avec deux amorces

dont l’une porte une mutation
Après la PCR on réalise une

ligation
Les amplifiats ou bien les amorces sont phosphorylés afin de

permettre la ligation
On réalise deux amplifications séparées, chacune avec un
oligonucléotide externe et un oligonucléotide portant la mutation. Les
deux fragments obtenus séparément sont ensuite amplifiés ensemble
avec les deux amorces les plus externes. On digère ensuite les deux
extrémités par des enzymes de restriction et on ligature dans le plasmide
original.
Application de la mutagénèse
Mutagénèse induite chez le melon

par EMS
Apparition d’albinos
Dahmani-Mardas et al. (2010). PLoS One. Dec 30;5(12):e15776.
Mutagénèse induite chez la Tomate par EMS
Minoia et al. (2010). BMC Research Notes. 3:69
Banque génomique
Une collection d’ADN recombinant, couvrant la totalité du génome
c’est-à-dire séquences codantes, non codantes (introns et séquences
intergéniques) d’une espèce donnée (plante, homme, souris, etc).
Elle est utilisée pour séquencer des génomes ou bien rechercher un
gène d’intérêt.
Extraction de l’ADN
génomique et
purification
Digestion partielle
Digestion du vecteur de l’ADN génomique:
tous les sites ne sont pas
coupés, donc on a de grands
fragments
Introduction dans
E. coli
Calcul de la représentativité d’une banque
Calcul de la probabilité de trouver une séquence donnée dans une

banque.
N=ln(1-P)/ln(1-f)
N: nombre de recombinants
P: probabilité désirée
f: proportion de génome dans un seul recombinant
Ex: 99% de probabilité d’avoir une séquence représentée dans
une banque de fragments de 17kb d’un génome eucaryote
(3.109pb)
N= ln(1-0.99)/ln[1-(1,7.104/ 3.109)] =8,1.105 colonies
Banque d’ADNc
Une banque d’ADN complémentaire ou ADNc est une collection de

tous les ARNm présents dans un tissu (racines, rein, etc.) à une
période donnée. Ces ARNm sont convertis en ADNc.
Construction de la banque d’ADNc
- Extraction des ARN totaux
-Les ARNm étant moins nombreux au niveau de la population
d’ARN, on les retire sélectivement grâce à l’utilisation d’une colonne
d’oligo d(T) qui retient sélectivement les ARNm
- synthèse d’ADNc
- clonage dans un vecteur
- infection de E. coli
- sélection, criblage ou screening des clones intéressants
Reverse transcriptase
dNTP produces cDNA:mRNA
Double stranded cDNA
dans le gène répresseur
CI
Phage λ recombinant
Infection par E. coli étalement

clones sur milieu solide
Les clones sont utilisables pour identifier des gènes spécifiquement

exprimés dans certains organes
Transformation génétique des bactéries et sélection sur milieu
de culture
ADN étranger
Gène de résistance
à un antibiotique
Gène de
Gène d’intérêt
résistance
à un antibio-
tique
Culture sur milieu

+ antibiotique
Plasmide n’ayant
pas intégré
le nouveau gène ADN recombinant
introduire par
Bactérie électroporation
Clonage
chromosome
(multiplication)
Seules les bacéries ayant

l’ADN recombinant
poussent
Clones
Transformation génétique des plantes
Il existe deux méthodes: méthode directe et méthode indirecte
1. Transfert direct d’ADN par canon à particules

Canon à particules
Particule d’or de tungsten enveloppée

d’ADN
Cellule ayant Culture dans un milieu Régénération

Intégré l’ADN de sélection (antibiotique de plante Acclimatation
étranger ou sucre) en serre
2. Transfert indirect d’ADN par Agrobacterium tumefaciens
Chromosome Plasmide
Agrobacterium transfère un fragment d'ADN (l'ADN-T) dans le génome

de la plante
L'infection de la plante par Agrobacterium tumefaciens induit le

développement d'une galle suit au transfert d’un fragment d’ADN (ADN-T)
Plantes hôtes: en majorité les dicotylédones (mais toutes)
Carte du plasmide Ti d’Agrobacterium tumefaciens
Mécanisme de transfert direct de l’ADN-T
Processus d’obtention de plantes transgéniques grâce à A. tumefaciens
Application de la transgénèse végétale
Maïs BT Pyrale (Ostrinia nubilalis)

La pyrale adulte (papillon)
pond des œufs lesquels
évoluent en larves (chenilles)
Pyrale qui ravagent les cultures
Œuf de pyrale Chenille ravageuse

Œuf de pyrale
Dégâts de la pyrale sur le maïs

Transgénèse animale
1. Microinjection
La microinjection est la première technique mise au point pour obtenir
des animaux transgéniques. Elle a été mise au point par Gordon et al.
en 1980. Après injection dans le pronucleus, l’ADN va s’intégrer dans
le génome mais on ne sait pas le site d’intégration du gène étranger
Œuf fécondé
microinjection de l’ADN dans

Pipette aspirante pour tenir Le pronucleus mâle
la cellule
Cellule hôte Implantation

dans l’utérus
de la femelle
Souris transgénique (génétiquement modifiée)

Gordon et al. (1980). Genetic transformation of mouse embryos by
microinjection of purified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 7380–7384.
2. Transfert de gènes dans des cellules souches
Les cellules souches sont des cellules embryonnaires totipotentes (propriété
d’une cellule de se différencier en n’importe cellule pour donner un individu
entier). Elles sont isolées à partir de la masse cellulaire interne d'un
blastocyste
Cellules souches contenant

le gène d’intérêt
Lot de cellules internes
microinjection
blastocyste
Implantation du blastocyste
dans l’utérus d’une femelle
Souris transgénique (génétiquement

modifiée) ayant des cellules provenant
du blasotcyste et des cellules souches
3. Transfection d'embryons précoces avec des vecteurs
porteurs d’un gène d'intérêt
Plasmide
portant Transfert dans l’utérus
un gène d’intérêt d’une souris
Injection dans le noyau
Souris transgénique (génétiquement modifiée)
Applications de la transgénèse animale
Augmentation de la production de lait chez le porc et la

croissance des descendants suite à l’introduction du gène α-
lactalbumine bovine. Augmentation de la production accroît
la survie des petits
Réduction de la pollution par introduction du gène de la

phytase (gène bactérien). Expression spécifique dans les glandes
salivaires d’où digestion de la phytate et moins de pollution par
phosphore de l’environnement.
Réduction du temps d’élevage suite à une croissance rapide
Mieux comprendre le développement de certaines maladies et

dégager des solutions
FIN DU COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE DE L2 SV
MERCI
POUR VOTRE
AIMABLE
ATTENTION !!!!!!!

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COURS DE BIOLOGIE MOLECULAIRE

Chapitre II : Les Outils du Génie Génétique

Dr. DIAGA DIOUF

La mutagénèse est la modification de la séquence d’ADN soit au

C’est en 1930 que Muller a observé qu’une mutation pouvait être

Mutagénèse chimique est induite par certain agents chimiques. Le

Mutagénèse par culture de tissus

La culture de tissus peut induire des variations au niveau de la

La mutation est induite à un endroit précis au niveau de la séquence

On amplifie avec deux amorces

Après la PCR on réalise une

Les amplifiats ou bien les amorces sont phosphorylés afin de

Mutagénèse induite chez le melon

Mutagénèse induite chez la Tomate par EMS

Minoia et al. (2010). BMC Research Notes. 3:69

Calcul de la probabilité de trouver une séquence donnée dans une

Une banque d’ADN complémentaire ou ADNc est une collection de

Double stranded cDNA

Infection par E. coli étalement

Les clones sont utilisables pour identifier des gènes spécifiquement

Culture sur milieu

Seules les bacéries ayant

1. Transfert direct d’ADN par canon à particules

Particule d’or de tungsten enveloppée

Cellule ayant Culture dans un milieu Régénération

Agrobacterium transfère un fragment d'ADN (l'ADN-T) dans le génome

L'infection de la plante par Agrobacterium tumefaciens induit le

Maïs BT Pyrale (Ostrinia nubilalis)

Œuf de pyrale Chenille ravageuse

Dégâts de la pyrale sur le maïs

microinjection de l’ADN dans

Cellule hôte Implantation

Souris transgénique (génétiquement modifiée)

Cellules souches contenant

Lot de cellules internes

Souris transgénique (génétiquement

Souris transgénique (génétiquement modifiée)

Augmentation de la production de lait chez le porc et la

Réduction de la pollution par introduction du gène de la

Réduction du temps d’élevage suite à une croissance rapide

Mieux comprendre le développement de certaines maladies et

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