DR Z.R.

DJAFAR
MAIL : ROMEIS.DJAFAR@GMAIL.COM

LES TECHNIQUES DE TRANSGÉNÈSE

2023/2024
 LA TRANSGÉNÈSE

 Consiste à ajouter un gène étranger au génome d’un organisme vivant ou au

contraire à remplacer très précisément un gène endogène par un autre gène. Cette
dernière opération, qui implique la mise en œuvre d’un processus de recombinaison
homologue, peut conduire en pratique à l’inactivation d’un gène chez l’animal.

 Un animal transgénique est un animal qui a incorporé dans son génome une
séquence d'ADN exogène et qui est capable de le transmettre à sa descendance
HISTORIQUE DE LA TRANSGÉNÈSE
 CARACTÉRISTIQUES DE LA SOURIS

❑ Temps de gestation: 19-21 jours

❑ Taille d'une portée: 3-15 souriceaux, (6 — 8 en moyenne)
❑ L’animal devient adulte au bout de deux mois seulement.
❑ Temps de génération: 10 semaines (5 générations par an)
❑ Génome murin: est séquencé en 2002 et consiste en 3*109 pb réparties sur 20
chromosomes. 23 786 gènes identifiés (chez l'hommes : 23 686 gènes identifiés, 23
chromosomes)
❑ Faciles à manipuler
❑ Un coût relativement modique
 COMMENT FAIRE UN TRANSGÈNE

 Construire un cDNA correspondant (ADN codant pour le gène)

 Un translation starting point (signal de début de transcription) qui forme le site CAP (coiffe) de
l'ARN en 5’
 Un promoteur qui permet la fixation de l'ARNpolymérase : Une boîte TATA (séquence du type
TTATAA)/une boîte CAT (séquence du type CAAAT) ; participe directement à la formation du complexe
de transcription
 Un terminateur: une séquence poly AAA que l'on retrouve sur tous les ARNm : permet le décrochage
du complexe de transcription
 Un enhancer (amplificateur): Son rôle est de recruter des facteurs activateurs de transcription (des
protéines nucléaires)
 un isolateur et ouvreur de chromatine : Les régions éloignées MAR (Matrix Attachment Region), qui
va servir de barrière entre loci et maintiennent la chromatine ouverte
COMMENT FAIRE UN TRANSGÈNE
(SCHÉMA D’UN TRANSGÈNE)

diapositive Louis-Marie Houdebine, INRA

 LES TECHNIQUES DE TRANSFERT DE GÈNES

❑ Tests de « Gain de fonction »

a. par surexpression
- par transgenèse (addition d’un gène)
- par injection d’ARNm

❑ Tests de « Perte de fonction »

a. par délétion/mutation ciblée du gène (« knock-out »)

inactivation complète du gène

b. par diminution de son expression (« knock-down »)

inactivation - partielle
- (presque) complète
 PRINCIPE DE LA TRANSGÉNÈSE CLASSIQUE
(PASSIVE PAR ADDITION)

 Environ 15-25% des animaux analysés seront porteurs du transgène

 Cette méthode ne permet ni le contrôle du site d’intégration (intégration aléatoire),

ni celui du nombre de copies intégrées du transgène.

 Le caractère aléatoire de cette intégration provoque la mutagénèse d’un gène

endogène dans prés de 5% des cas.
 TRANSGÉNÈSE CLASSIQUE OU PASSIVE PAR ADDITION
(LA MICRO INJECTION DIRECTE DU GÈNE)

 Les premiers animaux transgéniques étaient des souris obtenues en

1980.
 Les gènes étaient transférés par micro injection directe de l’ADN dans
les pronoyaux des embryons au stade une cellule.
 L’insertion de l’ADN est un processus aléatoire, et il y a une forte
probabilité que le gène introduit ne s’insérera pas dans un site sur l’ADN
hôte qui permettra son expression
 L’intégration en grande partie aléatoire se traduit par des extinctions
fréquentes des transgènes et une expression influencée par les gènes
voisins du site d’intégration.
 Chez les animaux ovipares, l’ADN ne peut être injecté que dans le
cytoplasme, ce qui se traduit également par une intégration non
contrôlée, avec des rendements très variables selon les espèces.
 LES ÉTAPES DE LA TRANSGÉNÈSE CLASSIQUE
(PASSIVE PAR ADDITION)
 Traitement hormonal des souris femelle (superovulation) et accouplement

 Récupération des œufs fécondés (des embryons) le premier jour après la fertilisation

 Injection dans un pronuclei d’un œuf fécondé des fragments d’ADN que l’on désire intégrer dans le
génome de l’hote (Intégration au hasard de l’ADN du plasmide dans l’ADN de l’œuf (embryons))

 Réimplantation directe de ces œufs (embryons) dans une femelle pseudo-gestante

 Les œufs (les embryons) se développent pour donner naissance à des souriceaux

 Une fois qu’ils sont assez grands, on coupe un petit bout de leur queue

 Génotypage : extraction de l’ADN génomique puis PCR pour mettre en évidence la séquence
d’intérêt
Transgénèse additive par micro-injection pronucléus
Transgénèse additive par micro-injection pronucléaire
 L’INFECTION RÉTROVIRALE : INFECTION LENTIVIRALE

 Les lentivirus sont des rétrovirus ayant une longue période d'incubation (expression transgénique à long
terme).
 Ces rétrovirus peuvent être utilisés pour transporter les séquences géniques intéressantes dans des cellules
embryonnaires.
 Le gène (comme dans le cas de la micro injection), il est inséré au hasard dans le génome,
 Ça donne des descendants mosaïque et une sélection est nécessaire pour obtenir les lignées pures.
 L’utilisation d’un lentivirus nécessite :
✓ La longueur des séquences insérées doivent être inférieure à 10kilobases.
✓ La micro injection de la suspension virale se fait dans l’espace périvitellin des embryons puis Incubation de
tels embryons chez une femelle pseudo-gestante
 LES CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES
(CELLULES ES)

❑ Ces cellules ont la propriété de conserver leur pluripotence au cours de leur croissance in vitro.

❑ En effet, une fois réintroduites par micro injection dans un blastocyste, elles sont capables de
participer à la formation de tous les tissus de l’embryon, y compris la lignée germinale.
LE TRANSFERT DE GÈNES PAR L'INTERMÉDIAIRE DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES
(CELLULES ES)
 LE PRINCIPE DE L’INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »

L’invalidation d’un gène est le remplacement de ce gène, dans le génome de l’organisme, soit par une version
modifiée, inactive, de ce gène, soit par une cassette de sélection (des fragments d’ADN comportants plusieurs
gènes généralement transférés ensemble lors d’opération de transgénèse).
 LE PRINCIPE DE L’INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »

L’invalidation d’un gène est le remplacement de ce gène, dans le génome de l’organisme, par une version modifiée, inactive, de ce
gène.
Dans cet exemple, le gène A est remplacé par un autre gène : lacZ. Ce remplacement est permis par la présence de séquences
identiques entre la construction et le génome de l’organisme, au niveau desquelles peut se réaliser une recombinaison
homologue.
 La technique d’invalidation d’un gène par recombinaison
homologue a été une avancée spectaculaire pour l’analyse
de la fonction des gènes

(University of Utah) (Cardiff University, UK) (University of North Carolina)

 PAR DÉLÉTION/MUTATION CIBLÉE DU GÈNE
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

Expérimentation 1
 Le gène ciblé est le bmp7 : les cellules embryonnaires d'un blastocyste (ES) de souris sont cultivées
 Construction du gène : Les gènes bmp7 clonés sont coupés à l’aide d’une enzyme de restriction et un gène de résistance
à la néomycine est inséré dans la région qui code le site de liaison à l’ADN de la protéine
 NB: le gène de résistance est invalidé par les gènes bmp7
 Ces gènes bmp7 mutants sont électroporès dans des cellules ES (les ES ici résultent de leur Culture en présence de
l’antibiotique)
 Ces cellules sont sélectionnées en fonction de leur résistance à la néomycine
 Les cellules hétérozygotes sélectionnées sont insérées dans la masse cellulaire interne d’un embryon de type sauvage et
le blastocyste est replacé dans l’utérus (tractus génital d’une souris pseudo gestante).
 La souris résultante est une chimère composée de tissus bmp7 hétérozygotes et de tissus bmp7 de type sauvage,
 L’accouplement de la souris chimérique avec une souris de type sauvage produit une progéniture hétérozygote bmp7 si
les cellules ES sont contribuées à la lignée germinale,
 Ces souris hétérozygotes peuvent être accouplées et environ 25% de leur progéniture devrait être homozygote pour le
mutant bmp7,
 MODIFICATION DU GÉNOME DES ES
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

1. Construction du gène invalidé (par clonage en

bactéries)(B)
2. Introduction dans les cellules ES (cellules
totipotentes) (A) (par transfection ) et
recombinaison homologue
3. Implantation des cellules ES dans les
blastocystes
4. Injection d’une quinzaine de Cellule ES
modifiés à l'intérieur de la cavité de l'embryon
5. Sélection des chimères (Sélection Néomycine
/ Gancyclovir pour repérer les bons clones)
6. Identification des animaux hétérozygotes
(Prélèvement puis amplification de ces clones).
7. Génération des homozygotes (Criblage par
PCR puis congélation des clones vrai positif
(5% à 10%))
 PAR DÉLÉTION/MUTATION CIBLÉE DU GÈNE
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

Expérimentation 2
I. Création d’un vecteur portant le gène invalidé :

EX: Ce vecteur est un plasmide bactérien portant le gène lacZ (qui remplace le gène
invalidé), avec, en amont et en aval, des séquences qui entourent le gène à invalider dans le
génome de l’organisme.
 PAR DÉLÉTION/MUTATION CIBLÉE DU GÈNE
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

II. Une fois la construction réalisée, ce vecteur est introduit dans des cellules souches embryonnaires ES (elles sont
totipotentes) par électroporation
 PAR DÉLÉTION/MUTATION CIBLÉE DU GÈNE
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

III. La troisième étape consiste en l’obtention d’animaux génétiquement modifiés :

 injection de quelques cellules ES modifiées dans le blastocœle (cavité) de très jeunes embryons de souris.
 Ces cellules s’intègrent naturellement à la masse cellulaire interne (MCI)
 Les embryons ayant reçu ces cellules ES sont alors réimplantés dans des mères porteuses.
 On obtient ainsi, à la naissance, des souris « mosaïques » dont les tissus dérivent pour partie des cellules de la MCI
« normales », et pour partie de cellules ES modifiées (recombinées)
 PAR DÉLÉTION/MUTATION CIBLÉE DU GÈNE
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

III. La troisième étape consiste en l’obtention d’animaux génétiquement modifiés :

 PAR DÉLÉTION/MUTATION CIBLÉE DU GÈNE
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

IV. Parmi ces individus mosaïques, il est alors

nécessaire de sélectionner ceux dont les
cellules de la lignée germinale dérivent de
cellules ES : eux seuls seront capables de
transmettre le gène invalidé à leur
descendance.

V. L’étape suivante consiste en un croisement

entre les souris mosaïques sélectionnées et
des souris « sauvages » (c’est-à-dire
possédant l’allèle normal, non modifié)

des souris hétérozygotes possédant un

allèle sauvage et un allèle invalidé
 PAR DÉLÉTION/MUTATION CIBLÉE DU GÈNE
(INACTIVATION COMPLÈTE DU GÈNE « KNOCK-OUT »)

VI. La dernière étape consiste alors à croiser ces souris hétérozygotes entre elles pour obtenir (dans une
proportion de 25 %) des souris homozygotes, possédant deux copies du gène invalidé (et donc, logiquement,
aucune copie du gène fonctionnel) :

• Obtention de souris
KO pour un gène

• Obtention d’individus
homozygotes : ce sont
les individus KO, chez
qui le gène a été
invalidé.
 FORMATION DE LA LINE TRANSGÉNIQUE

1. Sélection des chimères (La recombinaison

homologue ne cible qu’un seul des deux

allèles du génome (cellule hétérozygote)).

2. Identification des animaux hétérozygotes

3. Génération des homozygotes

NB : F1: hétérozygotes
Croisement sanguin

F2: 25% d’homozygotes

 PRINCIPE DE LA TRANSGÉNÈSE PASSIVE PAR ADDITION OU TRANSGÉNÈSE
CLASSIQUE

 Traitement hormonal des souris femelle (superovulation) et accouplement

 Récupération des embryons le premier jour après la fertilisation

 Injection à l’aide d’une aiguille un plasmide contenant le gène d'intérêt (l’ADN qu’on désire intégrer dans le
génome de l’hote)

 Intégration au hasard de l’ADN du plasmide dans l’ADN de l’embryon (l’œuf)

 Réimplantation directe de cet embryon (de l’œuf) dans une femelle pseudo-gestante

 L’embryon se développe pour donner naissance à des souriceaux

 Une fois qu’ils sont assez grands, on coupe un petit bout de leur queue

 Génotypage : extraction de l’ADN génomique puis PCR pour mettre en évidence la séquence d’intérêt
INJECTION DES CELLULES ES MODIFIÉES DANS UN EMBRYON
LES TECHNIQUE DE TRANSGÉNÈSE
LA MUTAGÉNÈSE
 INTRODUCTION

 La modification spécifique de l’expression de gènes et la correction ciblée de gènes

impliqués dans de nombreuses maladies (cancer, diabète, etc.) sont devenus des
enjeux majeurs des nouvelles thérapies chez l’homme.
 LES MUTATIONS CONDITIONNELLES UTILISANT DES SYSTÈMES
INDUCTIBLES

 La mutation ou mutagénèse c’est le processus par lequel des gènes passent d’une forme allélique à une autre,
c’est aussi la modification de l’information au niveau d’un gène (elle n’implique donc pas une insertion de
séquence d'ADN au niveau du génome.
 Les variations non pathogène de l’ADN sont appelées polymorphismes et se sont également des mutations

 Les mutations peuvent survenir dans un gène, dans les séquence codantes ou en dehors du gène (càd les
région ou élément qui code le gène)
 Les différents types de mutations sont classées selon : leur mode de survenue, leur localisation cellulaire et
chromosomique, selon les effets phénotypiques … etc.
 LES MUTATIONS SELON LES EFFETS PHÉNOTYPIQUES

Mutation perte de fonction

 Les mutations peuvent être classées selon leurs effets sur la fonction d’un gène ou de la protéine codée par
ce gène.

 Conduit à l’inactivation complète du gène ou à un produit non fonctionnel du gène, aussi appelée Knock-out
ou mutation nulle (EX: Une délétion d’une partie ou de la totalité du gène ou une substitution d’un acide
aminé qui inactive la protéine).

 Les mutations sont appelées conditionnelles quand elles conduisent à des changements du phénotype
uniquement dans certaines conditions environnementales (appelés conditions restrictives). Dans les autres
conditions, (appelés conditions permissives), ces mutations n’ont aucun effet.
 SYSTÈME DE RECOMBINAISON CRE-LOX P
SPÉCIFICITÉ SPATIALE (TISSULAIRE)

 Avant le développement de la technique de Recombinaison Cre-LoxP, il était impossible de réaliser un

KO (knock out) dans un tissu ou un groupe de tissus particuliers.

 Le Système de Recombinaison Cre-LoxP est une technique qui permet une délétion, inversion ou
translocation contrôlée dans l’espace et le temps. Elle est donc employée pour générer des lignées
d’animaux présentant des KO tissu-spécifiques ou inductibles chimiquement en temps voulu et en
observer les effets.
 LE PRINCIPE DU SYSTÈME CRE-LOX P
SPÉCIFICITÉ SPATIALE (TISSULAIRE)

 Cre-LoxP = « Cre » enzyme Recombinase dérivée du Bactériophage P1 et qui a pour fonction d’exciser
(enlever) un fragment d’ADN situé entre 2 séquences LoxP. l’enzyme peut soit catalyser la délétion,
l’inversion ou la translocation de la séquence ciblée selon l’orientation et l’emplacement des sites loxP.

 Sur la base de ces principes de recombinaison Cre-lox, les scientifiques ont développé des constructions
pour activer/désactiver les gènes lorsque Cre est présent. En exprimant Cre à des moments ou à des
endroits spécifiques, vous pouvez contrôler avec précision l’expression de votre gène d’intérêt.
 SYSTÈME DE RECOMBINAISON CRE-LOX P
SPÉCIFICITÉ SPATIALE (TISSULAIRE)

❑ Implique :
 Ciblage d'une séquence spécifique d'ADN (lox)
 Épissage (réunion) à l’aide d'une enzyme appelée la recombinase CRE.
❑ CRE (cyclic recombinase):
 Protéine de 38 KDa (bactériophage P1Lox).
 Catalyse la recombinaison entre deux sites de reconnaissance, les sites Lox.
❑ Lox (locus of X-over P1)
 Séquence d’ADN de 34 pb
 Extrémités 13 nucléotides palindromiques
clivage d’un segment du génome
et son intégration en un autre
site.
SYSTÈME DE RECOMBINAISON CRE-LOX P
SPÉCIFICITÉ SPATIALE (TISSULAIRE)
SYSTÈME DE RECOMBINAISON CRE-LOX P
SPÉCIFICITÉ SPATIALE (TISSULAIRE)
 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

 Pour réaliser des études fonctionnelles génétiques et des applications cliniques plus précises à l'aide
du système CreloxP, il était nécessaire de disposer d'une technique plus sophistiquée contrôlant
l'activation de Cre à un moment précis et dans une cellule spécifique.

 Les systèmes inductibles sont nécessaires lorsqu’on veut activer l’expression d’un gène à un stade
tardif du développement ou au stade adulte.

 Ces systèmes font appel à l’administration d’agents chimiques.

 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

 Un système Cre inductible est contrôlé par des éléments régulateurs spécifiques aux
cellules (promoteurs et amplificateurs) et de manière temporellement inductible par
un inducteur exogène tel que le tamoxifène (tam) ou la tétracycline (tet)
 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

Par Le Tamoxifène (TAM)

 Le système Cre inductible par le tamoxifène est obtenu par une protéine Cre modifiée fusionnée avec le
récepteur des œstrogènes (ER-LBD) contenant un domaine de liaison au ligand muté.
 La protéine Cre fusionnée est appelée CreER recombinase
 En l’absence de tamoxifène, la protéine de fusion Cre-ER se lie à la protéine du choc thermique 90 (HSP90).

 Lors de l’introduction de Tam et sa liaison à ce dernier complexe (Cre-ER – HSP90), l'interaction est perturbée
entre HSP90 et CreER.

 L’interaction de Tam avec ER induit une translocation nucléaire de Cre et donc la reconnaissance et l'interaction
avec les sites loxP et inactivation du gène.

NB: le tamoxifène est administré par injection intra-péritonéale.

 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

Par Le Tamoxifène
(TAM)
 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

Par La Tétracycline (Tet)

 également appelé système Cre inductible par la doxycycline (Dox ; un dérivé de la

tétracycline).

 Ce système est disponible en deux modes, Tet-on et Tet-off, qui permettent

l'activation ou l'inactivation du gène Dox-dépendant
 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

Par La Tétracycline (Tet)

 Tet-on :

1. En absence de « dox », le rtTA inactivé est

incapable de se lier à tet07 (TRE) (une séquence
du gène cre, et donc cette dernière n’est pas
exprimée et donc aucun changement sur le
gène.

2. Suite à l’administration et la présence de

« dox », dox interragit avec la rtTA et permet de
s’activer, la rtTA activé se lie au promoteur
tet07 (TRE) de cre, et donc induit l’expression
de cre
 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

Par La Tétracycline (Tet)

 Tet-on :
absence « Dox » rtTA inactive pas
de liaison avec le promoteur spécifique de la cre
(tet07 « TRE »).
« Dox » présente rtTA activé
liaison avec le promoteur de cre cre
activé

TRE : un élément sensible à la tétracycline

Prot chimérique rtTA : transactivateur inverse contrôlé par la tétracycline
 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

Par La Tétracycline (Tet)

 Tet-off :

1. En absence de « dox », le tTA activé est

capable de se lier à tet07 (TRE) (une
séquence du gène cre), et donc induit
l’expression de cre.

2. Suite à l’administration et la présence de

« dox », le tTA inactivé est incapable de
se lier à tet07 (TRE) et donc la cre n’est
pas exprimée et donc aucun changement
sur le gène.
 SYSTÈME INDUCTIBLE CRE–ER
SPÉCIFICITÉ TEMPORELLE

Par La Tétracycline (Tet)

 Tet-off (le contraire de tet-on) :

« Dox » absente tTA activé liaison
avec le promoteur (la séquence spécifique de la
cre (tet07 « TRE ») cre activé

« Dox » présente rTA inactivé (suite à son

interraction avec « Dox » incapable de se
lier avec le promoteur de cre (tet07) cre
activé

rTA : transactivateur contrôlé par la tétracycline

 ZINC FINGER NUCLEASES
(NUCLÉASES À DOIGTS DE ZINC ZFN)

 Le Zinc Finger nucléase (ZFN) technique utilise des protéines naturelles qui se lient à l'ADN d'une manière séquence-
spécifique, permettant à la nuclease fusionnée à couper en tant que “ciseaux d'ADN’ à cet endroit précis.
 Nucléases à doigts de zinc sont composées de deux domaines bien distincts, un domaine de reconnaissance et de fixation à
l’ADN constitué de 3-4 doigts de zinc, reconnaissant chacun 3pb de l’ADN, et d’un domaine de clivage de l’ADN non
spécifique, celui de l’enzyme.
 LES NUCLÉASES TALE (TALENS)

 La découverte des TALE (transcription activator-like effector) et le développement récent des TALEN (transcription activator-like effector nuclease)
artificiels offrent la possibilité d’éditer les génomes de nombreux organismes modèles de manière rapide, spécifique et efficace. Les TALEN
(nucléase =enzyme= prot) sont des ciseaux moléculaires qui permettent d’induire différentes modifications génétiques en un site choisi du
génome.

 Les TALEN sont des protéines chimériques, qui vont induire une cassure double-brin d’ADN en un site spécifique du génome. La réparation
de la cassure peut alors s’accompagner de mutations.

 Les TALEN combinent les propriétés de liaison à l’ADN des TALE (transcription activator-like effector) et de clivage de l’ADN par
l’endonucléase FokI

 Les TALE sont des facteurs de transcription identifiés chez certains phytopathogènes du genre Xanthomonas, qui entrent dans le noyau et
activent la transcription de gènes cibles chez l’hôte

 La région centrale des TALE est composée d’un nombre variable de répétitions (7 à 30). Chaque répétition est constituée de 34 acides
aminés et se lie à un nucléotide cible unique. Les TALE s’associent alors à l’ADN en formant une hélice qui s’enroule autour de l’ADN où
chaque répétition reconnaît un nucléotide de la séquence cible.
 LES NUCLÉASES TALE (TALENS)

❑ Mode opératoire :

▪ La synthèse artificielle du gène codant pour le TALE

Le TALE : c’est le domaine de liaison à l’ADN

▪ Une fois le TALE construit, elle est combinée au domaine de clivage (domaine nucléase) de Fok1 = cette
combinaison donne naissance à des TALEN
▪ La TALEN ainsi obtenue peut être transférée dans la cellule cible.

▪ Transfection : Une fois l’assemblage des domaines réalisé, ils sont insérés dans des plasmides pour être transfectés
par électroporation dans les cellules cibles, dans lesquelles les TALENs vont s’exprimer et accéder à la séquence
d’ADN à cliver.
 STRUCTURE D’UNE TALEN

Le domaine de clivage de l’ADN est celui de l’endonucléase Fok1

LES NUCLÉASES TALE (TALENS)
 LE SYSTÈME CRISPR-CAS
CLUSTERED REGULARLY INTERSPACED SHORT PALINDROMIC REPEATS

 un système qui permet de corriger ou de modifier l’expression de gènes responsables de maladies héréditaires

 Une technologie récente, appelée CRISPR, dérivée du système immunitaire de bactéries, utilise une nucléase Cas9 et un
ARN guide complémentaire à une séquence de 20 nucléotides d’un gène pour induire des cassures double brin dans l’ADN.
Cela permet de modifier spécifiquement le gène ciblé dans des cellules de plantes, d’animaux et d’humains. Des variantes de
la technique permettent également de réduire ou d’augmenter l’expression d’un gène choisi.

 Cette nouvelle méthode utilisait une nucléase appelée Cas9 (CRISPR-associated protein 9) pour couper l’ADN et permettre
l’édition du génome

 Elle permet de modifier de façon spécifique la séquence des nucléotides d’un gène, ou d’un élément non codant (comme un
microARN), pour les rendre non fonctionnel

NB : La protéine Cas9 la plus utilisée est celle de Streptococcus pyogenes.

 LE SYSTÈME CRISPR-CAS
CLUSTERED REGULARLY INTERSPACED SHORT PALINDROMIC REPEATS

❑ Pour couper un gène avec la méthode CRISPR, il faut : Coupure

par Cas9
 un ARN guide (ARNg) : complémentaire à une séquence de
17 à 20 nucléotides du gène ciblé
 La séquence qui complémente doit être suivi par une
séquence PAM (sur l’ADN)
 L’ARNg forme un complexe avec l’ADN et la nucléase Cas9

 La coupure par la nucléase Cas9 se fait exactement trois

nucléotides avant le PAM
 Les lignes pointillées relient les séquences de nucléotides qui
sont les mêmes avant et après la coupure
 Pour éviter de couper des séquences d’ADN similaires à celle
qui est ciblée, il est possible d’utiliser une nucléase Cas9 non-
fonctionnelle (dCas9) qui est fusionnée avec la nucléase FokI.
 LES PRINCIPAUX SYSTÈMES IMPLIQUÉS DANS LA RÉPARATION
DES CASSURES DOUBLE BRIN CAUSÉES PAR LES NUCLÉASES
ARTIFICIELLES ?

❑ Mécanismes de réparation de l'ADN suite à des cassures double brin induites par des nucléases :

 En l’absence d’un modèle de réparation de l’ADN, la cassure est réparée par une jonction d’extrémités non
homologues (NHEJ) (ligature directement les deux extrémités de la cassure), ce qui est un processus sujet aux
erreurs et peut conduire à de petites insertions ou suppressions.Alternativement, deux cassures adjacentes induites
par des nucléases peuvent être utilisées pour exciser l'ADN chromosomique intermédiaire du génome.

 La réparation dirigée par homologie (HDR) : (la recombinaison homologue (RH) utilise une séquence homologue
pour recopier la région perdue lors de la cassure). Si une matrice de réparation d’ADN est fournie avec une
homologie avec le site cible entourant la cassure, elle sera utilisée pour guider la réparation dirigée par
l’homologie. De cette manière, de petites modifications particulières de la séquence d'ADN ou l'insertion de cassettes
d'expression génique entières peuvent être dirigées vers des sites cibles spécifiques du génome.
 LES INNOVATIONS EN TRANSGÉNÈSE MURINE
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

 Le Knock down est une technique expérimentale par laquelle l’expression d’un ou de plusieurs gènes
d’un organisme est réduite.

 70-80% de réduction de l’expression du gènes.

 Le knockdown est généralement observé 24 à 48 h après la transfection et peut être encore plus
rapide en utilisant le siARN (par rapport au shARN).
 LES ARNI (SI-ARN, SH-ARN…)
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

 L'ARNi implique généralement la génération d'un siARN ou d'un petit ARN en épingle à cheveux
(shRNA) qui dirige le clivage et la dégradation des molécules cibles d'ARNm complémentaires
 Le petit ARN interférent ou siARN est un type de molécule d'ARN double brin de petite
taille ; environ 21 à 25 nucléotides de longueur
 responsable de l’inactivation des protéines en tant que régulation post-transcriptionnelle de
l’expression des gènes.
 Par conséquent, la fonction principale de cet ARN est de participer au silençage de l’ARNm, qui est
une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes.
 le siARN est produit naturellement dans la cellule

 De plus, le siARN peut être utilisé pour l'inactivation à court terme de protéines par application
directe sur la cible
 BIOGENÈSE ET MÉCANISME D’ACTION DES SI-RNA
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

❑ Le Dicer, une enzyme RNase III

spécifique à l'ARNdb (ARN double
brin).

❑ Dicer clive l'ARNdb en siARN.

❑ Ces siARN forment des complexes avec

le RISC (RNA-induced silencing
complex).
 BIOGENÈSE ET MÉCANISME D’ACTION DES SI-RNA
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

 l'ARNdb (soit transcrit, soit introduit artificiellement) est transformé par Dicer (une enzyme RNase III
spécifique à l'ARNdb) en siARN qui est chargé dans le RISC (complexe de silençage).

 L’endonucléase AGO2, qui est un composant de RISC, clive le brin passager (brin sens) du siARN (il va
dégrader le brin sens).

 Le brin guide (brin antisens) reste associé au RISC actif et le guide vers l’ARNm cible.

 La liaison complémentaire complète entre le brin guide du siARN et l’ARNm cible (l’ARNm qui lui est
entièrement complémentaire) conduit au clivage de l’ARNm (son silençage génique = silençage des gènes =
inactivation des gènes = l’inhibition de son expression).
 UTILISATION DES ARNI
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

❑ Les siARN et les miARN visent à réduire au silence les gènes liés au cancer afin d'inhiber la croissance des
cellules tumorales, l'angiogenèse, les métastases et/ou la résistance aux médicaments.

❑ Les oncogènes, les gènes suppresseurs de tumeurs mutés et d'autres gènes qui contribuent à la progression
tumorale sont des cibles potentielles pour le silençage génique

❑ En ciblant l’ARNm des protéines du cycle cellulaire, la croissance des cellules tumorales peut être inhibée.

❑ inhibition d’expression des gènes (dégradation ou blocage de l’ARNm)

 UTILISATION DES SI-ARN
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

Ex : cancer du col de l’utérus

SiARN (CALAA-01)

inhibition

le gène (RRM2) qui code pour la sous-unité M2 de la ribonucléotide réductase

(se sont des gènes pertinents pour la régulation du nombre de cellules tumorales et le processus d’infiltration
lymphocytaire afin de favoriser la progression du cancer du col de l’utérus)

NB: Le CALAA-01 est un SiARN thérapeutique ciblant le RRM2 pour le taitement des tumeurs et la réduction du potentiel
de croissance des cellules cancéreuses in vitro et in vivo
 UTILISATION DES SI-ARN
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

Ex : cancer du pancréas

SiARN (siG12D LODER)

inhibition

oncogène KRAS muté

but
pour le traitement du cancer du pancréas localement avancé et est délivré par une matrice polymère
biodégradable pour une libération prolongée
Différence entre SiRNA et miRNA
Différence entre SiRNA et miRNA
 BIOGENÈSE ET MÉCANISME D’ACTION DES SH-RNA
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

 Les petits ARN en épingle à cheveux (ou short hairpin signifiant « petite épingle à cheveux ») sont
des ARN adoptant une structure en tige et boucle pouvant être utilisé pour réduire l'expression d'un gène cible
via phénomène d'interférence par ARN.
 L'expression des shRNAs peut être obtenue par le biais de plasmides ou de vecteurs bactériens ou viraux.
 L'apport du plasmide à des cellules cultivées in vitro en utilisant la transfection pour obtenir l'expression du
shRNA peut être réalisé grâce à des kits disponibles dans le commerce. Néanmoins cette méthode n'est pas
utilisable in vivo.
 Les plasmides shRNA peuvent induire une inhibition transitoire ou stable du gène cible
 L'utilisation des Particules Lentivirales shRNA a un double avantage :
✓ la possibilité d'introduire des shRNA à tous type de cellules tout en évitant les méthodes de transfection trop
contraignantes.
✓ La biosécurité : Les Particules Lentivirales sont incompétentes à la réplication et sont conçues pour s'auto-
inactiver après transduction et intégration des shRNA dans l'ADN génomique de cellules cibles.
 Biogenèse et mécanisme d’action des SH-RNA Souris Knock-Down (KD)

L'expression des
shRNAs par le biais
de plasmides
 Biogenèse et mécanisme d’action des SH-RNA Souris Knock-Down (KD)

L'expression des
shRNAs par le biais
Particules
Lentivirales shRNA
 UTILISATION DES SH-ARN
SOURIS KNOCK-DOWN (KD)

Ex : Développement d’un vaccin FANG

Prélèvement de cellules tumorales ont été prélevées sur des patients

un plasmide codant le bi-shRNA (un shRNA bifonctionnel) ainsi que le facteur GMCSF
(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) y ont été introduits

Vaccin FANG

dirigé contre les facteurs de croissance immunosuppresseurs TGF β1 et β2

LES TECHNIQUE DE TRANSGÉNÈSE
LE CLONAGE
 LE CLONAGE

❑ le clonage désigne la technique qui consiste à introduire, dans le cytoplasme d’un ovocyte préalablement
énucléé, un noyau d’une cellule issue d’un autre animal. Cette manipulation délicate permet de reconstituer
un embryon qui, une fois transplanté dans une femelle receveuse, pourra se développer à terme. Le jeune
ainsi obtenu possédera le même ensemble de gènes nucléaires que le donneur de cellules avec qui il formera,
par définition, un clone

❑ Le clonage est un processus qui permet la copie d’un organisme en tout ou en partie (ex. gène, cellule, tissu,
etc.).
 LE CLONAGE

❑ Le clone obtenu est généralement génétiquement identique à l’organisme parent. Ceci dit, on peut
effectuer des manipulations génétiques pour obtenir un clone génétiquement modifié.

❑ En laboratoire, il est possible de retirer le noyau d’une cellule prélevée chez l’individu qu’on cherche à
cloner. C’est là que se trouvent les molécules d’ADN qui portent les gènes. Ce noyau est ensuite
transféré dans un ovule dont on a préalablement enlevé le noyau. À partir de cette cellule
artificiellement assemblée, un embryon se développe et forme un individu génétiquement identique à
l’original.
 LE CLONAGE NATUREL

 Lorsque la peau est abimée, celle-ci commence un processus de réparation. Lors de ce processus, les cellules
somatiques de la peau se clonent par mitose afin de remplacer les cellules endommagées, contribuant ainsi à guérir la
plaie.

 Chez les animaux, des processus comme la parthénogenèse ou le bourgeonnement permettent également d’engendrer
des organismes ayant le même bagage génétique.

 Chez les végétaux, des processus de reproduction asexuée (comme le bouturage ou le marcottage) permettent aux
plantes de créer un clone, soit un individu dont le bagage génétique est identique à celui de son parent.

 Les bactéries, les levures et les algues sont des organismes qui comprennent énormément d’espèces unicellulaires
capables de se reproduire par clonage naturel (La bactérie Escherichia coli se reproduit de façon asexuée. Elle engendre
alors un clone. C’est également le cas de la levure Saccharomyces cerevisiae et de l’algue unicellulaire Phacus
pleuronectes).
 LE CLONAGE NATUREL

les cellules
somatiques de la peau se
clonent par mitose afin
de remplacer les cellules
endommagées

Le fraisier produit des stolons,

soit des tiges qui lui
Le dragon de Komodo (reproduction permettent de se reproduire
asexuée à l’aide de la parthénogenèse. par marcottage.
 LE CLONAGE ARTIFICIEL

❑ Il existe plusieurs types de clonage artificiel :

 Le clonage reproductif
 Le clonage thérapeutique
 Le clonage de gènes
 LE CLONAGE ARTIFICIEL

❑ Le clonage animal :

 Clonage reproductif : Donne naissance à un individu génétiquement identique à un autre, (le mouton
Dolly).

 Clonage thérapeutique : Consiste à cloner des cellules et à les utiliser pour recréer tissus ou organes
afin de soigner des malades.

 Clonage de gènes : permet de produire des copies d’un gène (portion d’ADN) ou, plus rarement, des
copies d’ADN complet.
 LE CLONAGE REPRODUCTIF

 Le clonage reproductif est un clonage artificiel qui permet de reproduire un organisme complet.
 Il concerne notamment les animaux et les végétaux.
 Dans le cas des animaux, le clonage reproductif permet d’obtenir un embryon clone qui sera implanté dans une
mère porteuse pour se développer. La mère porteuse donnera naissance à l’individu cloné.
 En 1996, des biologistes écossais ont effectué le clonage du premier mammifère à partir de cellules
somatiques : il s’agit de la célèbre brebis Dolly.
 Il existe 3 techniques :
➢ Le clonage par scission d’un blastocyste
➢ Le clonage par séparation des cellules d’un embryon (la dissociation)
➢ Le clonage par transfert nucléaire
 LE CLONAGE REPRODUCTIF

I. Le clonage par scission d'un blastocyste

« jumelage artificiel » :
Etape 1 : Fécondation in-vitro aboutie à un embryon
qui va se diviser jusqu'au stade blastocyste.
Etape 2 : la section équivalente d’embryon en deux
parties semblables
Etape 3 : Les deux embryons ainsi obtenus sont
transplantés dans l'utérus de mères porteuses jusqu'à
l'accouchement.

NB: Les deux individus issus de cette technique de

clonage sont génétiquement identiques car leur
génome provient de la même fécondation
 LE CLONAGE REPRODUCTIF

II. Le clonage par séparation des cellules d'un

embryon « la dissociation » :
Etape 1 : Obtention d'un embryon in-vitro, comme
dans les autres techniques.
Etape 2 : Lorsqu'il arrive au stade de 2, 4, ou 8 cellules
(beaucoup plus tôt que pour la bissection d'embryon),
l'embryon est scindé en parties égales.
Etape 3 : Chaque partie, identique aux autres,
continue à se développer.
Etape 4 : Puis se continue dans les utérus de mères
porteuses. A l'accouchement, les nouveaux nés sont
identiques.
 LE CLONAGE REPRODUCTIF

III. Le clonage par transfert nucléaire :

Noyau d'une cellule d'un embryon (noyau d’une
cellule souche embryonnaire) :
• Fécondation in-vitro. Lorsqu'il arrive au stade de
morula (après 3 jours), on en prélève une cellule, dont
est extrait le noyau.
• Le noyau pré-extrait est transféré dans ovocyte
énucléé .
• L'embryon est implanté dans l'utérus de mères
porteuses.
• Les nouveaux nés sont génétiquement identiques
 LE CLONAGE REPRODUCTIF

III. Le clonage par transfert nucléaire :

Noyau d'une cellule adulte :
• Une cellule est prélevée sur la personne qui sera
clonée.
• Un ovocyte énuclée.
• Le noyau de la cellule est extrait puis transféré dans
l'ovocyte énuclée.
• L'embryon obtenu se divise.
• Implantation de l’embryon dans l'utérus de la mère
porteuse.
• Le nouveau-né est génétiquement identique à l'adulte
donneur de noyau.
 LE CLONAGE REPRODUCTIF

 Afin de donner naissance à Dolly, les biologistes ont effectué les étapes suivantes :
1. prélever un ovocyte d’une brebis donneuse (brebis n° 1);
2. retirer le noyau de cet ovocyte;
3. remplacer le noyau de cet ovocyte par le noyau d’une cellule somatique d’une autre brebis (brebis
n° 2), afin que ce nouvel ovocyte comprenne un bagage génétique complet;
4. provoquer la division cellulaire de ce nouvel ovocyte afin qu’il puisse engendrer un embryon;
5. implanter l’embryon dans une brebis porteuse qui donnera naissance à Dolly quelques mois plus tard.
 Puisque le matériel génétique de Dolly provient du noyau de la cellule somatique de la brebis n° 2,
Dolly est un clone de cette brebis.
LE CLONAGE REPRODUCTIF
LE CLONAGE DE LA BREBIS DOLLY
 LE CLONAGE REPRODUCTIF
LE CLONAGE D’UNE PLANTE CÉRÉALIÈRE (LE MAÏS)
 LE CLONAGE THÉRAPEUTIQUE

❑ Le clonage thérapeutique est un type de clonage artificiel qui permet de reproduire une partie d’un
organisme (généralement des cellules ou des tissus) à partir de cellules souches.
❑ Une cellule souche est une cellule non différenciée qui a la capacité de générer différents types de cellules
spécialisées (cellule musculaire, neurone). De plus, une cellule souche a une grande capacité à se reproduire.
❑ Afin de cloner une partie d’un organisme par clonage thérapeutique, on procède
généralement comme suit :
1. on prélève des cellules souches (provenant de moelle osseuse, de cordon ombilical, d’embryons clonés ou
de multiples autres sources); les énucléer et leur faire introduire des noyaux de cellules somatiques.
2. on cultive ces cellules souches afin de multiplier leur nombre;
3. on récolte ces cellules souches et on leur fait subir un traitement afin qu’elles produisent un type de cellules
ou un type de tissus spécifiques; c’est ce qu’on nomme la différenciation cellulaire.

NB: Les cellules ou tissus obtenus peuvent ensuite servir à la recherche médicale, à traiter un patient ou à d’autres fins.
 LE CLONAGE THÉRAPEUTIQUE

❑ Pour soigner les maladies (l'injection de cellules souches, issues de cellules seines du malade clonés).
❑ Les cellules du malade clonées enlève le risque de rejet grâce à la compatibilité génétique.
❑ Avantages:
Régler le problème à la pénurie d'organes
Eviter pour le malade opéré la prise de traitements à vie contre le rejet, par son organisme, de l'organe greffé.
❑ Inconvénients: Des problèmes morales liés au clonage et celle du meurtre d'un être vivant cloné.
LE CLONAGE THÉRAPEUTIQUE
 LE CLONAGE DES GÈNES

❑ Le clonage de gènes, aussi appelé clonage d’ADN ou clonage génique, est un type de clonage artificiel qui
permet de produire des copies d’un gène (portion d’ADN) ou, plus rarement, des copies d’ADN complet.

❑ Exemple : Une protéine est connue pour diminuer significativement la taille des caillots sanguins. Afin
d’employer cette protéine en tant que médicament, il faut pouvoir la produire à grande échelle. Pour ce faire,
des chercheurs ont identifié le gène responsable de la synthèse de cette protéine. Le gène d’intérêt est
extrait, puis inséré dans une bactérie. La multiplication rapide de la bactérie au cours de son cycle de vie
permet de cloner le gène en grande quantité. Ce gène permet alors aux multiples bactéries de synthétiser une
quantité significative de la protéine d’intérêt. On peut ainsi procéder à la récolte des protéines et produire les
traitements médicaux nécessaires.
 LE CLONAGE DES GÈNES

Le clonage d’un gène pour l’obtention de traitements médicaux à

base de protéines
 LES DIFFÉRENCES ENTRE CLONES ET JUMEAUX?

❑ Les clones c’est comme les vrais jumeaux sont strictement identiques.
❑ Principale différentiation avec les clones:
 les vrais jumeaux partagent la même mère, la même fécondation, et la même gestation (resté
ensemble durant les neuf mois de grossesse).
 Dans la méthode de scission de blastocyste, le principe est fort similaire, la différence vient du fait que
la séparation n'est pas naturel.
 Les jumeaux restent dans le même utérus, alors les blastocystes issues de clonage sont implantés dans
des utérus différents.
Les avantages et les inconvénients du clonage
 LE CLONAGE DANS LE MONDE

 2016: La chine a construit la plus grande usine de clonage au monde, à Tianjin, pour un montant de 31
millions de dollars.
 Cloner un million de vaches par an pour l'industrie alimentaire
 Aux Etats-Unis, en Argentine, au Canada, au Brésil et en Nouvelle-Zélande, le bœuf cloné est déjà
commercialisé avec l'accord des autorités de santé nationales.
 La Sooam Biotech Research Foundation, basée en Corée du Sud, est devenue leader dans ce domaine.
Elle se targue d’avoir cloné depuis 2006 plus de 800 chiots. Elle prétend aussi effectuer un clonage à
partir d’animaux décédés
 le 26 décembre 2015: le boxer cloné « Chance » à partir des cellules de Dylan mort deux semaines.
 la société Cuddle Clones basée aux USA qui propose de reproduire à l’identique votre animal de
compagnie en peluche.