La transgénèse MEX 2021-2022

1
La transgénèse MEX 2021-2022

2
La transgénèse MEX 2021-2022

Les différentes méthodes de transgénèse

L’obtention d’animaux transgéniques repose, quel que soit la technique utilisée, sur les quatre mêmes
principales étapes.

Ces quatre étapes sont précédées d’une étape qui consiste en une étape d’isolement du gène d’intérêt
(identification, séquençage éventuel).

3
La transgénèse MEX 2021-2022
Étapes expérimentales de production des souris transgéniques par micro-injection
pronucléaire
1. Super Ovulation des femelles: une première injection de PMSG (Pregnant Mare Serum
Gonadotropin) substitue à l'hormone FSH (Folicle-Stimulating Hormone) stimule le
développement des follicules mûrs
une seconde injection de hCG (human Chorionic Gonadotropin). Cette hormone, en mimant
l'effet de la LH (Luteinizing Hormone) parachève la maturation folliculaire et favorise l'ovulation.
2. Deux femelles injectées sont mises avec un mâle ; on a besoin d’au minimum 10 femelles afin
d’avoir suffisamment d’embryons
3. Récolte des oeufs fertilisés . Douze heures après l'accouplement, les femelles sont
sacrifiées
et les oviductes contenant habituellement chacun entre 10 à 15 oeufs sont prélevés. Ainsi, entre
20 et 30 oeufs peuvent être récoltés par souris.
4. Les embryons sont traités avec la hyaluronidase pour éliminer les cellules cumulus qui sont
encore autour de l’embryon.
5. Les embryons sont mis dans un milieu (M2)
6. Micro-injection de l’ADN en solution et sous forme linéaire dans le pronucleus mâle (le
plus
gros et le plus près de la surface)
7. Incubation pendant une nuit : les embryons endommagés meurent et les autres devraient se
diviser.
8. Réimplantation Les embryons sont réimplantés dans l’oviducte d’une femelle pseudo
gestante: -couplé avec des mâles vasectomisés).
9. Au bout de 20 jours les embryons naissent. Les manipulations rendent les embryons moins
viables. On n’a que des portées de 3 ou 4 souriceaux. Parfois les nouveau-nés transgéniques sont
tués par leur mère.

4
La transgénèse MEX 2021-2022

Création de souris chimères par implantation des cellules

ES dans un blastocystes de cellules hôtes

Prix Nobel médecine et physiologie 2007Martin J. Evans (Cardiff University)

5
La transgénèse MEX 2021-2022

Création de mutations nulles: les souris "knockout"

Stratégie pour inactiver un gène par recombinaison homologue

Sélection d'un clone positif

La transgénèse MEX 2021-2022

Création de souris KO par recombinaison homologue

Rôle de Néo
confère la résistance au G418
permet de sélectionner l’intégration du plasmide
peut permettre d’inactiver le gène
Rôle de TK
confère la sensibilité au Ganciclovir
permet de sélectionner la RH

Sélection positive: cassette de résistance aux antibiotiques eucaryotes (néomycine

par ex)
Sélection négative: Thymidine kinase (TK) du virus HSV, qui confère la sensibilité a
des pro-drugs comme le gancyclovir,
Cette enzyme est capable de phosphoryler le gancyclovir qui devient ainsi toxique
pour les cellulesmort de la cellule
 L’intégration aléatoire du plasmide a lieu par ses extrémités et concerne donc la
totalité des séquences introduites.
La cellule, qui possède les deux gènes néo et Hsv-tk, devient résistante au G4 18,
mais elle est détruite par le ganciclovir.
Lors d'un événement de recombinaison homologue, le gène néo est intégré lors du
remplacement des séquences endogènes par les séquences exogènes ;
le gène Hsv-tk n 'est pas intégré car il ne contient pas de région d'homologie avec le
gène cible. La cellule devient donc résistante au G418 et n'est pas détruite par le
ganciglovir. Le gène X a été inactivé.

7
La transgénèse MEX 2021-2022