Modèles eucaryotes techniques (tableau comparatif)

Levure génétique classique

Crible génétique par : mutagénèse chimique (mutant conditionnels)

Test de complémentation possible
Analyse de tétrade
Clonage par : complémentation, cartographie et séquençage

Levure génétique inverse

Recombinaison homologue très efficace

transformation par plasmides ou recombinaison homologue
surexpression : par plasmides ou promoteurs inductibles
CRISPR/Cas9 utilisable
approche systématique : collection de délétions

Drosophile génétique classique

Crible génétique par : mutagénèse chimique (parfois mutant conditionnel) et transposon

Test de complémentation possible
Clonage par : cartographie, séquençage, séquençage du site d'insertion

Drosophile génétique inverse

Transposon : fréquent
recombinaison homologue possible
transformation par éléments P et transposase
surexpression : par GAL/UAS ou promoteurs inductibles
ARNi utilisable
CRISPR/Cas9 utilisable
approche systématique : collection d'insertions

C.elegans génétique classique

Crible génétique par : mutagénèse chimique ou transposon

Test de complémentation possible
Clonage par : cartographie, séquençage, séquençage du site d'insertion

C.elegans génétique inverse

Transposon : possible
recombinaison homologue non efficace
transformation par ADN extrachromosomal ou intégration aléatoire, aussi insertion des transposons
surexpression : promoteur inductibles heat-shock
ARNi utilisable
CRISPR/Cas9 utilisable
approche systématique : collection d'insertions, collection de délétions, ARNi systématique

Arabidopsis génétique classique

Crible génétique par : mutagénèse chimique, transposon ou T-DNA

Test de complémentation possible
Clonage par : cartographie, séquençage, séquençage du site d'insertion

Arabidopsis génétique inverse

Transposon : possible
T-DNA possible
transformation par Agrobacterium, plasmide Ti ADN-T

1
surexpression : possible par T-DNA
ARNi possible
CRISPR/Cas9 utilisable
approche systématique : collection d'insertions (ADN-T, transposon), ARNi systématique

Souris génétique classique

Crible génétique par : mutagénèse chimique

Test de complémentation possible
Clonage par : cartographie, séquençage, séquençage du site d'insertion

Souris génétique inverse

Recombinaison homologue : efficace aux cellules souches

transformation par insertion aléatoire de fragments linéaires d'ADN : transgenèse
surexpression : transgénèse efficace
ARNi possible pour inhibitions ciblée
CRISPR/Cas9 utilisable
approche systématique : collection de délétions (collection de mutations par mutagénèse chimique)

Termes dans cette liste (56)

Avantages et caractéristique Arabidopsis

Bracssicacées, dicotylédone, pas de symbiose mychorizes

facilité de croissance à l'intérieur, cycle journée de 16h, temps de génération de 6-8 semaines, ~ 1000 graines par plante, s'auto-
fertilise

Transformation Agrobacterium

Contient un grandplasmide Ti dans lequel une région ADNT s'intègre dans le génome végétal
sur plasmide gènes de production d'auxine, de cytokines et opines
contient une région de virulence (40 gènes en 7 opérons de virA à virG)
l'ADNT s'intègre aléatoirement dans le génome

Quand la bactérie perçoit une blessure

Vir A est activé et il phosphoryle virG (TF) qui active d'autres gènes de virulence et de transfert comme virD1 qui scanne le
plasmide et reconnait les bordures de l'ADN-T. virD2 coupe le plasmide pour exciser l'ADN-T. VirE2 enrobe l'ADN-T simple brin
pour former le complexe ADN simple brin - protéine

ADN-T

Possède 3 régions: synthèse d'opines, cytokines et auxine

ces gènes permettent à la cellule végétale de se diviser indépendamment (tumeur)
les opines sont ensuite utilisés pour alimenter la bactérie qui possède sur son plasmide un gène de catabolisme d'opines

Transformation ADN-T

Les bordures sont essentiels (bordures conservées)

enlève les gènes impliqués dans la synthèse de l'auxine, de la cytokinine et des opines
ajout d'un gène de sélection, un promoteur et un gène d'intérêt
introduit le nouveau T-DNA dans un vecteur binaire
- vecteur binaire : T-DNA inséré dans un plasmide plus petit, qui peut être maintenu et répliqué dans E.coli et A.tumefaciens
- plasmide Ti désarmé : sans T-DNA mais avec tous les gènes vir

Mutagénèse par transposon

2 Types de mutations :
- insertion du transposon

2
- empreinte laissée par le transposon
quand un transposon est excisé, il laisse des empruntes qui peuvent induire des mutations si elles ne sont pas multiples de 3

Isoler un gène par mutant d'insertion

Mutagénèse par transposition

caractérisation du phénotype mutant
identification des séquences adjacentes au transposon ou t-DNA
si plusieurs gènes se sont intégrés, on doit savoir quel gène est responsable du phénotype --> complémentation

Génome d'Arabidopsis

130 Mbp (relativement petit génome et 25000 gènes

la densité de gènes est plus faible vers les centromères
14% est composé de transposon (+ fréquents vers les centromères)
présence du génome mitochondrial et chloroplastes
60% du génome est dupliqué ou plus --> difficulté de la génétique inverse

Génétique inverse Arabidopsis

Recherche de graines portant une mutation d'intérêt (sites spécialisés)

croisement mendélien pour obtenir des homozygotes mutants
caractérisation du phénotype
complémentation pour savoir quel gène est responsable du phénotype

Caractérisation du phénotype

Étape difficile car énormément de gènes sont dupliqué ou plus

il est très compliqué d'obtenir un mutant d'un gène qui est présent 5x dans le génome
en plus on ne sait pas à quoi s'attendre, ou dans quelle condition le phénotype sera révélé

Caractéristiques C.elegans

- organisme multicellulaire simple avec différents types de tissus

- cycle de vie court
- culture facile de bcp d'individus
- petit n de cellules avec un dév stéréotypé
- non parasite
- mange des bactéries

Boom and bust

Cycle de vie modulable selon les conditions environnementales et la quantité de nourriture

- si les conditions sont bonnes, le ver se développe normal
- s'il n'y a pas bcp de ressources, il freine son développement

Organisation c.elegans

1031 cellules pour l'individu mâle et 959 pour l'hermaphrodite

tous les types cellulaires sont déjà présents chez la larve

Cycle de vie c.elegans

les premières divisions cellulaires ont lieu dans le parents (oeuf fécondé dans la spermathèque pour l'hermaphrodite)
l'oeuf est éjecté et les divisions continue et va muer pour atteindre sa phase L1 (9h)
le ver choisi son développement en fonction des ressources à dispo, si c'est ok --> L2, L3, L4, L5 --> jeune adulte (5 mues)

Mutant du développement (2 types) c.elegans

3
Chez c.elegans, on connait le devenir de chaque cellule
mutant hétérochronique: fait des choses au mauvais moment
mutant type cellulaire : la cellule ne fabrique pas le FT qui n'induit pas ce qu'il devait faire

Isolement des mutants chez C.elegans

o De jeunes adultes hermaphrodites sont traité à l'EMS

o Isolement d'hermaphrodites mutagénisés
o Descendance M1 : chaque individu est en moyenne héterozygote pour une mutation
o Culture isolée des individus M1 d'apparence normale
o Analyse de la descendance M2 : 25% des individus présentent un phénotype mutant

Transformation lignée germinale c.elegans

On intègre un ADN dans la zone de maturation des oeufs pour induire des insertions aléatoires dans le génome
sert à : complémentation, utilisation gènes rapporteur, génétique inverse

ARNi dans C.elegans

Les ARNi permettent de supprimer l'activité d'un gène en inactivant son ARNm
la protéine DICER sépare les 2 brins et donne un brin de reconnaissance à la protéine RISK qui va couper l'ARNm correspondant
au brin de reconnaissance
très facile à utiliser : on peut mettre dans la nourriture des vers ou les tremper dans une solution contenant ces ARNi double brin

Mort cellulaire programmée et ses mutants

131 cellules sont programmées à mourir dans le développement, le fait que ce soit tjrs les mêmes indique qu'il y a quelque chose
de génétique
mutant CED3 : les 131 cellules sont en vie --> code pour des protéases
mutant CED9 : trop de cellules meurent par apoptose --> gène de contrôle de la mort cellulaire
ced9 est similaire à BCL2 un gène humain responsable de la protection des lymphocytes B

Cycle de vie drosophile

Devient larve 1 jours après la fécondation - 3 jours supplémentaire pour passer en métamorphose pré-pupe
--> adulte au bout de 10 jours
la femelle peut pondre 100 œufs par jour et vivre pdt 2 mois

Développement embryonnaire drosophile

Les 1ere divisions se font sans cytokinèses, 1 seule cellule polynucléés

à la 10e division les noyaux migrent à la surface
à la 13e division la cellularisation commence

Morphogénèse drosophile

Les ARN maternelles établissent des régions de polarité en exprimant ± certains gènes (GAP)
les gènes gap et les morphogènes détermine le travail des gènes homéotiques qui donnent une identité aux différents segments
apparition des disques imaginaux qui préfigurent les structures adultes comme les ailes ou les antennes

Utilisation drosophile

Étude sur l'immunologie (récepteur toll)

étude sur le rythme circadien : travaux sur la compréhension de l'horloge biologique
étude sur les addictions : notamment l'alcool
étude sur la génétique des insectes
modèle pour des maladies neuronales (syndrome X fragile)

Génome drosophile

4
120 Mbp et 13000 gènes
génome petit et compact avec peu d'introns et peu de pseudogènes
60% de gènes en commun avec l'humain : bcp de gènes responsables de maladies chez l'humain ont des homologues chez la
drosophile

Mutagénèse des mouches

se fait par :
rayons X : grandes insertions ou délétions
agents chimiques
éléments transposables
CRISPR/Cas9

Marqueurs chromosomiques

Séquence d'ADN correspondant à un phénotype particulier permettant de localiser un emplacement particulier sur le chromosome
correspondant
--> permettent de suivre un chromosome qui porte une mutation

Chromosomes balanceurs

Permet d'éviter les recombinaisons ente chromosome homologue

homozygotie balanceur est létale
porte des marqueurs chromosomiques
permet de suivre un chromosome invisible phénotypiquement car chromosome balanceur est visible
utilisé pour maintenir des mutations létales homozygotes

Éléments transposables (2 classe)

Classe I : transposon à ARN (rétrotransposon) : une séquence dupliquée par un ARN se faire retranscrire en ADN et s'insère
classe II : transposon à ADN : la copie est excisée et va s'insérer ailleurs
--> mécanismes permettant l'évolution des génomes

Éléments transposables drosophile

Contient des séquences inversement répétées aux extrémités et une séquence codant pour une transposase permettant l'insertion
on peut modifier ce que contient un transposon pour insérer une marqueur white ou fluorescent
si on insère un marque white+ dans un individu white- on obtient un individu mosaïque

Mutagénèse avec élément P

On peut remobiliser des éléments P dans le génome par injection d'une source de transposase ou avec une source génomique de
transposase
on peut récupérer un gène en utilisant une transposase et une ligase qui va mettre le brun excisé en ADN circulaire que l'on va
mettre dans E.coli

Système GAL4/UAS

Permet d'activer ou inactiver un gène choisi

on a deux transgènes : un porte un gène codant pour GAL4 placé en aval du promoteur d'un gène, le 2e porte une séquence UAS
où peut se lier le FT GAL4 en amont du gène Y
chez le descendant des deux individus portant les transgènes, les 2 peuvent interagir et activer l'expression du gène Y

Système FRT/FLP

Recombinase FLP permet de couper à des sites spécifique

FRT sont des emplacements sur le génome
Si 2 FRT sont placé à différents endroit sur deux chromosomes homologues, FLP va couper aux deux endroits et un brin subira
une duplication et l'autre une délétion

5
SI 2 FRT sont placés au même endroit sur deux chromosomes homologues, même principe que pour un crossing-over
--> permet de faire des délétions précises dans le génome

S.cerevisiae

Responsable de la fermentation alcoolique

aérobique ou anaérobique
division cellulaire par bourgeonnement --> reproduction asexuée
reproduction sexuée : 2 levures haploïde a et alpha fusionnent entre elle pour ensuite effectuer la mitose

S.pombe

division cellulaire par fission médiale

reproduction aséxuée : la levure diploïde effectue une méiose
reproduction séxuée : 2 levure P et M conjuguent pour faire 2 méïose et former 4 spores

Avantages levures

- facile à manipuler
- temps de génération court
- haploïde ou diploïde
- petit génome
- conservation des mécanismes cellulaires fondamentaux

Génome des levures

- compact et simple
- 12 et 14 Mpb
- S.cerevisiae a subi une duplication puis la délétion d'une grande partie de son génome
- les centromères sont différents chez les 2 espèces : plus de similarités avec l'humain pour S.pombe

Cribles génétiques pour mutation conditionnelle

Comme les levures sont haploïdes, une simple mutation est visible par son phénotype
si on veut étudier des processus fondamentaux, les gènes sont essentiels à la survie de la cellule --> on cherche alors des mutations
conditionnelles
ce sont des mutations dont le phénotype est observable uniquement dans une condition particulière

Résultat d’un crible : analyse de mutant levure

Comment savoir si deux mutants possèdent le même gène muté ?

il faut regarder les phénotypes de la descendance des 2 mutants --> analyse de tétrade
exemple de croissement ab x ++ :
- P [ab ab ++ ++] NP[a+ a+ b+ b+] TT[ab a+ +b ++]
- si P = NP, les gènes ne sont pas liés
- si P > NP les gènes sont liés
- si uniquement P --> même gène muté

Classer les mutants

Il est possible de comprendre les liens entre mutants en créant des organismes double mutant et d'observer leur phénotype
certains gènes ont des relations d'épistasie = suppression du phénotype mutant d'un gène par la mutation d’un second gène

Clonage par complémentation levure

pour un mutant cdc thermosensible dont on ne connait pas le gène responsable

on insère dans notre culture de mutant cdc et ura- une banque de plasmide portant un gène URA et des gène de complémentation
on fait pousser le mélange sur un milieu restrictif sans uracil (sélection des insertions réussies) puis on met la culture a 36°C
--> les levures qui y poussent sont celles qui ont été complémentées
on isole le plasmide inséré et on regarde quel gène il portait = gène muté

6
Crible de surexpression levure

le concept est de trouver des gènes pour lesquels une surexpression confère un phénotype particulier
la surexpression d'un gène peut être toxique
on utilise alors des promoteur inductibles sous certaines conditions de croissance comme un facteur biochimique (sucres ou métal)
ou par température
exemple : promoteur GAL, en présence d'un mileu riche en galactose, il permet l'expression du gène dont il est le promoteur

Crible de surexpression : trouver les gènes dont la surexpression est toxique

On crée une souche sauvage mais ura- qu'on mélange avec une banque de plasmides contenant différents gènes sous promoteur
GAL et un marqueur de sélection URA
les colonies observées auront forcément un plasmide intégré
un soumet ces colonies à du galactose
les colonies qui disparaissent possèdent un gène qui devient toxique s'il est surexprimé
on isole le plasmide et on regarde le gène responsable

Délétion par recombinaison homologue

Insertion d'un marqueur de sélection à la place d'un gène

le marque possède des extrémités similaires à celles du gène d'intérêt

Délétion recombinaison homologue d'un gène essentiel levure

plasmid shuffling : on remplace le gène essentiel par un allèle mutant conditionnel

on enlève le gène X par recombinaison homologue et on intègre un plasmide contenant le gène X et un marqueur de sélection
URA
on fait pousser des colonies sur un milieu sans uracil
on insère un 2e plamide avec l'allèle mutant conditionnelle et un marqueur de sélection LEU
on fait pousser les colonies sur un milieu sans leucine pour obtenir les levures ayant l'allèle mutant conditionnel

Double hybride

Permet de tester la capacité de 2 protéines à interagir ensemble

on utilise un marqueur de sélection qui est transcrit seulement si les 2 protéines interagissent physiquement ensemble
on intègre deux plasmide, un contient le gène de la protéine appât et un avec le gène de la protéine proie et un marqueur de
sélection ou un gène rapporteur

Avantages souris

- proximité avec l'humain

- petit mammifère facile à manipuler
- 3 semaines de gestation, 6-8 semaines jusqu'à fertilité et 6-12 petits par portée
- environ 30'000 gènes de la souris ± similaire chez l'humain

Souche outbred

Consanguinité élevée pour que chaque souches soient différentes les une des autres
les souris sont génétiquement uniques

Souches inbred (caractéristiques)

Souches consanguines, croisement frères soeurs pdt 20 gén

souches homozygotes pouvant mettre en avant des mutations récessives
chaque souche est génétiquement unique : mêmes gènes entre souches mais à différents locus
caractéristiques : isogénicité, homozygotie, uniformité phénotypique, stabilité à long terme

F1 hybrides line

7
Croisement de 2 souches inbred
la descendance est génétiquement similaire mais hétérozygote

Advanced intercross

Croisement de F1 hybrides lines ensemble

les recombinaisons permettent de localiser les gènes, ces croisements sont plus précis que les cartes génétiques conventionnelles

Recombinant inbred intercross

Croisement de 2 souches inbred recombinantes qui diffèrent pour le gène recherché

croiser les 2 souches permet d'augmenter le nombre de recombinaisons qui nous intéressent

Spontaneous mutants and chromosomal abberations

Aberrations peuvent être des délétions, des inversions, des duplications ou des translocations
translocations ente chromosomes non-homologues : cassure aux centromères de deux chromosomes acentriques, le plus gros
morceau est transloqué et le petit est perdu

Recombinaison homologue (2 constructions)

knock-out : on fait un loss of function d'un gène d'intérêt dans les cellules souches embryonnaires et on intègre dans un blastocyte
dénoyauté d'une autre souris --> on obtient un hétérozygote mutant

knock-in : on remplace une gène d'intérêt endogène par un autre gène

Tetracycline regulated expression

système Tet-off Tet-on :

l'expression d'un transgène cible dépend de l'activité d'in activateur transcriptionnel inductible
l'expression de l'activateur de transcription peut être régulé de manière réversible et quantitative en exposant les animaux à des
concentrations variables de tetracycline (transcription activée si TC)

Système Cre/lox

les sites lox sont placés de part et d'autres d'un gène pour qu'une prot Cre puisse venir couper à ces endroit et placé le brin d'ADN
excisé en ADN circulaire qui sera perdu

Gènes trap

permettent de forcer la fixation de 2 sous-unités protéiques issues du même transgène mais normalement séparées => induction de
mutations d'insertion
possible grâce à une cassette trap constituée d'un gène rapporteur sans promoteur ou d'un marqueur de sélection