Cours J.

Bodart 12/10/23 (2 intervention 4h)

Plan du cours
1 – Transgénèse et Implications de l’expérimentation animale
2 – Méthodes de transfert de gènes
3 – Modèle théoriques
4 – Application : l’animal en tant que source de matériel biologique

1 - Transgénèse

• Transfert artificiel et stable d’un gène en provenance d’une espèce étrangère chez un
animal ou une plante.
=> Organisme pluricellulaire, dont au moins une partie de la population cellulaire abrite un
fragment d’ADN supplémentaire, introduit de manière expérimentale.

=> transmission ou non à la descendance en fonction de la nature de la population

• Stabilité du transgène (gènes rapporteurs, gènes de sélection)
• traçabilité du transgène (ADN non intégré est dégradé)

Idée : bénéfice de l’expression du transgène

• Production et sélection (agro-alimentaire)
• Reproduction de pathologies : compréhension, thérapie

Altère un gène et établit une causalité

Le gros animal est l’animal anormal

qui surexprime l'hormone de croissance
 Génétique expérimentale :
Repose sur un postulat : les animaux présentent des similitudes suffisantes pour être des
modèles expérimentaux.
• Proximité phylogénétique (Humain, porcin, murin)
• Conservation des mécanismes moléculaires

Mais
L'évolution complexe des organismes et des organes ne garantit pas les analyses causales
Modèles animaux :
• Bons modèles analogiques hypothétiques
• Potentiellement, pauvres modèles analogiques de causalité

Ces modèles animaux demeurent des « modèles fondamentaux »

Les problèmes éthiques

Prémisse 1 : Il est mal de tuer l’un des nôtres

Prémisse 2 : L’animal est l’un des nôtres
Prémisse 3 : L’expérimentation scientifique implique nécessairement le sacrifice d’animaux

travailler sur amphibien => animalerie agréée, pas protégée, diplôme pour travailler sur anx
Si protocole douloureux => déclaré en préfecture

Règle des 3 Rs (Russel & Burch, 1959)

Réduire (réduire le nombre d’animaux employés)
Remplacer (privilégier les méthodes alternatives)
Raffiner (méthodologie, points limites - diminution du stress / bien-être animal)

=> Soit on diminue sa douleur par médoc, soit on le tue

2 – Méthodes de transfert de gènes

=> rendement faible

=> dépend du modèle animal

=> analyse 3 cas

→ gamètes
→ zygote
→ cellules somatiques et embryonnaires (déjà différenciées)

GAMÈTES
=> ovocyte (utilisation des vecteurs rétroviraux)
=> spermatozoïdes
=> produire des gamètes à partir de cellules souches
=> ovocytes

la cellule la plus grosse des gamètes => permet d’injecter beaucoup d’ADN et qu’il s’intègre

Si ADN linéaire => s’intègre pendant la réplication (ovocyte fait pas la réplication, pas de
transcription non plus/peu) donc la si met de l’ADN linéaire => s’intègre pas

Rétrovirus => bicouche lipidiques, ARN monocaténaire et enzyme

(protéase, reverse transcriptase)

Exemple Covid
=> une fois que le virion reconnais la mb s’ouvre et libère son contenue, permet de produire
un ADN double brin => ADN double brin s’intègre grâce à une intégrase

=> intérêt transgénèse => cycle permet d’intégrer de l’ADN dans une cellule hôte

=> plusieurs ARN éléments :

- deux séquences terminale LTR répétée et inverse
- 5’ en aspiration
- 3 gène de structure:
- gag (code la polyprotéine structurale du virus)
- pol (code transcriptase inverse permet l'intégration d'ADN bicaténaire
viral dans l'ADN de l’hôte-cellule + protéase qui clive les domaines de Gag et Pol pdt
maturation, une endonucléase + une RNase H)
- env (code protéines de l’enveloppe)

Pour être utilisables dans le cadre de la réalisation d'animaux transgéniques, les vecteurs
viraux doivent être dépourvus des gènes clés qui assurent leur propagation

Les délétions offrent un espace pour l’intégration d’un gène d’intérêt à transférer
=> faut créer les cellules transcomplémentante => transférer avec gag pol et env

cellules transcomplémentation qui assurent la production de particules virales(virion) vides

produits de manière continue (gag pol et env) => virion vide => font des paquets vides
particule viral vide => sans ARN monocaténaire

ARN monocaténaire => permet former ADN double brin etc on à donnée tt pour ca mais on
à pas de quoi pour qu’il se reproduise

Fonctionne surtout sur ovocytes de bovin et singes => les deux modèles en ciblant ovocytes
 => spermatozoïdes

super transporteur d’ADN

s’associent très rapidement à la mb externe

quand y’à fécondation ADN pas intégré

=> fait que les transporter <=

L’électroporation des spermatozoïdes (chez le poisson)

permet d’obtenir des animaux transgéniques, cependant sans obtention de lignées stables.

électroportative : choc électrique faible, fait trou temporaire, permet de passer à l’intérieure
ADN bien intégré mais il ne reste pas dans les lignées suivantes => 1 génération intéressant

=> faible rendement chronophagie coûte cher, donc on veut des lignées stable donc pas ouf

1 méthodes qui fonctionne => amphibien Xenopus laevis => pipidé

En une matinée capable de générer des centaines d’embryon transgéniques

Intérêt du modèle => pas mosaïque ni chimère => toutes les cells porte le transgènes car
intégration avant fécondation
chimère : coexistence de 2 populations cellulaires de génotypes diffs

=> produire des gamètes à partir de cellules souches

Reposent sur la capacité contrôler la différenciation de cellules souches pluripotentes en

gamètes.

3 techniques

Alternativement, chez la souris,obtention de souriceaux transgéniques en injectant une

solution d’ADN directement dans des testicules dits adoptifs, au niveau des tubes
séminifères
=> faut sélectionner par un triture de cells, les cells qui ont intégré le transgène
 ZYGOTE

=> Injection dans le pronucleus

=> Injection dans le cytoplasme

=> Injection dans le pronucleus

zygote présente cytoplasme et pronucleus mal et femelle

rendement 1 à 5% souris transgénique pas 100%

Taux d’intégration de 1 à 20% selon les espèces

cellules sauvages et d’autres qui auront intégrée le transgène

=> stimulation ovarienne, obtient ovocyte fécondé,

=> pronucleus mal + gros, permet de mettre plus de copies

Forte ADN injectée => + de mortalité !!

La méthode fonctionne chez d’autres modèles

Bovins vaut pas le coups, chez la souris si

Existence d’animaux mosaïques : l’ADN étranger est intégré à un stade ultérieur et conduit à
la juxtaposition de deux positions cellulaires

=> Injection dans le cytoplasme

modèles animaux où les oeufs sont télolécithes ou hétérolécithes

le cytoplasme compartiment volumineux où le volume injecté peut être + important

Cette technique permet d’augmenter le nombre de copies (fréquence d’intégration)

mais si rendement augmente, la fréquence des embryons mosaïques augmente aussi
=> le taux de transcription est d’autant plus faible

1/3 animaux transgéniques sont mosaïques moitié ne transmettons pas le transgène

 CELLULES SOMATIQUES ET EMBRYONNAIRE

=> cellules souches embryonnaires

=> cellules germinales primordiales
=> clonage par transfert de noyau

=> cellules souches embryonnaires

- prélèvement cells du bouton embryonnaire, mise en culture (ESC)

- intégration du transgène

- culture blastocyste receveur

→ implantation dans une femelle pseudo gestante

- obtention de chimères tétra parentales

avec 2 populations cellulaires
(une population porteuse du transgène, une population sauvage)

- croisements entre les chimères : obtention de 2 types de lignées

en fonction de la participation du transgène aux lignées germinales :

(1) Si absence de participation aux cellules germinales:

obtention d’individus sauvages après le croisement.

(2) Si participation aux cellules germinales : obtention d’individus hétérozygotes pour le

transgène après le croisement

- Obtention d’un % d’individus homozygotes après croisement entre hétérozygotes

=> capacité de régulation des excédents

chimère tetra parentale => jusqu'à 3 emb pour donner hexa parentale => plasticité

=> régulation des déficiences :

=> régulation des excédents

CSA => manipulable dans culture in vitro peut intégrer un transgène

Chimère génomes juxtaposé mais ne se mélangent pas

=> cellules germinales primordiales

en dehors de l’oiseau

Objectif : créer un individu chimère dont les cellules germinales portent le transgène.
Ce dernier sera transmis à toutes les cellules de la génération suivante

=> clonage par transfert de noyau

transfert de noyau est une technique biologique proche du clonage

- retirer l'ADN d'un ovocyte non fécondé (énucléation)

-y injecter en remplacement un noyau contenant l'ADN
que l'on désire cloner, ou l’ADN qui a été modifié

cellules somatiques ou embryonnaires sont mises en culture, modifiées génétiquement.

Une cellule est ensuite fusionnée par choc électrique

le noyau injecté dans une ovocyte énucléé

L’injection/fusion permet la déprogrammation du noyau de la cellule

et le redémarrage d’un programme embryonnaire
Le premier clonage => fin des années 50’ dans le xénope (pas Doly)

Cell intestinale pour noyaux + ovocyte de xénope

Intégration du noyaux => injecte intégralement ou chaos électrique

Cellules histocompatibilité avec les nôtres, gros problème éthique de cette méthode =>
devient un OGM + tue quelqu’un car embryon ?? Dépend si considère comme un individu

3- modèles théoriques
Stratégie : indirect et direct
- indirect : ne vise pas directement le gène d’intérêt.
La stratégie vise néanmoins à réussir à modifier l’expression génique
- directe : ciblera directement le gène d’intérêt (recomb homologue) abordée ensuite
=> 2 strat recombinaison hétérologue et homologue
HÉTÉROLOGUE => adn linéaire dans cell et s’intègre (aléatoirement !!)
HOMOLOGUE => cible séquence précise d’ADN => CO

SiRNA
• Utilisation d’ARN double brin ou de l’association ADN-ARN
=> stimule l’activité de RNases qui détruisent des ARNm cibles.

• introduit dans cells de mammifères des ARN dbl brins → pris en charge par 2 mécanismes
en fonction de la longueur du dsRNA :
-un mécanisme non spécifique, qui conduit à la destruction de tous les ARNm et l’arrêt de la
synthèse protéique
-un mécanisme spécifique, qui conduit à la destruction typique et spécifique d’un ARNm
particulier

=> ARNm empêche d’être traduit (SIRNA et ribozymes)

=> protéiques (protéines dominantes négative
=> stratégie de type leur => détruit toutes les cellules du gène d’intérêt sélective

SIRNA => cell normal pas d’ARN double brin

=> deux techniques mise en route

Si plus petit qu’une 30aine de paire de base ARN

double brin, pas système risque

Contient plusieurs protéines RISC

=> désassemble l’ARN double brin
garde l’un des deux ARN double brin comme matrice

celui la de 25 nucléotides
=> tt ce qui s’exprime et est reconnue
va être détruit => système de destruction sélective
de l’ARNm

M’intéresse car permet d’être spécifique

peut introduire dans la cellule des amorces

Association des dsRNA de petite taille, avec plsrs protéines pour constitue complexes RISC
siRNA (dsRNA) dirige le RISC vers les molécules complémentaires

complexe RISC clive tous les ARNm qui s’hybrident/s’associent avec les brins du dsRNA
=> réduisant ainsi spécifiquement un gène au silence.
Le transgène contient des séquences complémentaires qui lorsqu’elles sont transcrites,
conduisent à la formation d’une structure en épingle à cheveux
 Cre lox

La recombinaison Cre-Lox : technologie de recombinase site-spécifique, pour effectuer des

délétions, des insertions, des translocations et des inversions à des sites spécifiques dans l'ADN
des cellules.

=> pour contrôler les événements de recombinaison spécifiques à un site dans l'ADN
génomique
prof

Cre Lox => Cre-LoxP

Deux éléments : une recombinase, Cre, & deux sites les séquences Lox-P

=> Cre-Low système de recombinaison utilisable chez les eucaryotes supérieures:

- Le recombinaison Cre interagit avec l’ADN et excise l’ADN compris entre deux
séquences Lox-P
- Les séquences Lox-P sont des séquences “palindromique” reconnues par la
recombinase, importance de l’orientation des séquences
inversion : séquences Lox-P inversée
délétion : séquences Lox-P dans le même sens
translocation : le séquences sont sur les chromosomes différents

● Quels sont les éléments du système Cre-LoxP

● Quelle est la nature exacte de ces éléments ?

● Ou ont-ils été identifiés et possèdent-ils des analogues

● Comment fonctionnent ces éléments

● Quelles applications utilisent ces éléments