From mutation to gene function - résumé

1. Introduction
Les organismes multicellulaires répondent aux blessures de différentes manières. Les animaux utilisent leur
système nerveux pour contrôler de rapides mouvement d’échappement, et des réponses défensives sont
initiées au site de la blessure. La majorité de ces réponses nécessitent une migration cellulaire active. Les
plantes ont évolué différentes stratégies pour répondre aux blessures. Dans le cadre de ce cours, nous allons
étudier ceci en utilisant un screen génétique basé sur le gène JAZ10, qui est induit après une blessure.
Comme pour tout screen génétique, nous devons commencer avec une question, comme par exemple :
« quels sont les gènes qui contrôlent la réponse aux blessures chez les plantes ? ».
Arabidopsis thaliana est un organisme modèle chez qui la réponse aux blessures est typique de celle des
plantes à fleurs. La capacité de défense de ces organismes est principalement dirigée envers les herbivores.
Les protéines anti-herbivores incluent par exemple des inhibiteurs de protéases, qui empêchent la digestion
ou encore des toxines qui inactivent des enzymes et interfèrent souvent avec la fonction nerveuse des
animaux. La production de ces molécules de défense est activée lorsque la plante est blessée. De plus, de
nombreux gènes de défense sont activés à distance de la blessure par des mécanismes de propagation du
signal. Le gène JAZ10 fait partie des gènes induits par les blessures qui codent pour des fonctions
régulatrices.
Quand une plante est blessée, plus de 1000 gènes sont impliqués dans la défense. La plupart de ces gènes
ont pour cible le système digestif de « l’ennemi » et rendent typiquement les feuilles difficiles à digérer. La
protéine la plus abondante chez les plantes est la protéine RubiSco (30%), qui est une très grosse protéine
composée de 8 sous-unités.

2. Designing genetic screens

Un screen génétique est une méthode de génétique classique. La génétique classique consiste à muter un
organisme de manière aléatoire et de sélectionner le phénotype mutant qui nous intéresse pour en déduire
la fonction du gène. Dans ce cas, le chercheur ne sait pas quel gène sera muté. A l’inverse, en génétique
inverse, on commence avec une collection définie de mutants et on cherche à découvrir lesquels présentent
un phénotype intéressant, auquel cas le chercheur sait quel gène est examiné.

• Génétique classique : Identification du gène responsable d’un phénotype mutant donné. Va du

phénotype mutant au gène.
• Génétique inverse : compréhension de la fonction de gènes donnés par l’observation des mutants
correspondants. Va du gène muté au phénotype

Typiquement, la génétique classique demande plus de travail mais est une méthode beaucoup plus
puissante, et c’est celle que nous allons utiliser ici.

Choix du gène d’intérêt

Pour faire un screen génétique, il est nécessaire d’avoir une question précise, comme par
exemple « comment est-ce que les gènes induits par les blessures sont régulés ? ». Nous cherchons donc à
comprendre un mécanisme. Pour pouvoir étudier ce mécanisme, il faut choisir un gène qui soit très sensible
et très hautement induit après une blessure, par exemple pas un gène qui n’est exprimé qu’un tout petit
peu ou alors uniquement après une blessure extrême. Par définition, le gène le plus utilisé pour étudier la
défense des plantes est le gène JAZ10. Ce gène code pour une petite protéine qui réprime la réponse aux

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blessures. Il y a au total 13 gènes JAZ chez A.thaliana. JAZ10 a été choisi car il est énormément exprimé après
une blessure chez la plante et car son transcrit est facilement quantifiable par qPCR.

Choix du gène rapporteur

Pour pouvoir étudier un gène important tout en gardant la plante vivante (ce qui est utilise pour pouvoir
facilement sélectionner des mutants), il faut utiliser un gène rapporteur qui sera basé sur notre gène
d’intérêt. Un gène rapporteur est un gène dont la protéine possède une caractéristique lui permettant d’être
observée en laboratoire, comme par exemple une fluorescence ou une activité enzymatique détectable. Les
gènes rapporteurs sont utilisés pour permettre la visualisation ou la mesure de l’expression d’un gène
d’intérêt. Pour cela, le gène rapporteur peut être fusionné au gène d’intérêt, ou alors mis sous le contrôle
du promoteur de ce dernier.

Il existe trois classes de gènes rapporteurs dont :

1) Les rapporteurs transcriptionnels : pour cela, on utilise un promoteur pour produire une protéine
rapportrice seule (sans protéines associées). C’est cette technique que nous allons utiliser ici en
utilisant le promoteur de JAZ10.
2) Les rapporteurs traductionnels : pour cela, on utilise un promoteur est une protéine pour produire
une protéine rapportrice et une autre protéine.

Des exemples de gènes rapporteurs sont :

• GFP : code pour une protéine fluorescente.

Avantages : non invasive, versatile
Désavantage : nécessite un microscope pour détecter la lumière
• LUC : code pour l’enzyme luciférase qui catalyse l’émission de lumière. Nécessite la luciférine, de
l’oxygène et de l’ATP
Avantages : non invasive, grande sensibilité, protéine + ARN avec des demi-vies courtes
Désavantage : nécessite un microscope pour détecter la lumière

• GUS : code pour l’enzyme bactérienne β-glucuronidase qui converti un substrat incolore X-gluc en
un précipité bleu. Peut être utilisé pour de l’histochimie qui est destructif ou sous forme sécrétée
pour du live staining sans devoir utiliser de microscopie.
• lacZ : code pour l’enzyme β-galactosidase qui métabolise le X-gal et fait apparaître une coloration
bleue.

Dans notre cas, nous avons choisi le gène rapporteur GUS, car sa détection ne nécessite pas de microscopie.
Si on utilise une version sécrétée (extracellulaire) de GUS, alors l’activité de l’enzyme peut être détectée à
l’œil nu, ce qui permet de screener un nombre très grand de plantes. Pour obtenir une version extracellulaire
de ce gène, il faut le modifier avec une séquence sécrétrice pour qu’il puisse sortir de la cellule et être en
contact avec son substrat (X-gluc qui est extracellulaire) et ainsi catalyser la production du précipité bleu. La
version modifiée et extracellulaire de GUS s’appelle GUSsec.

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3. Cloning promoter DNA

Pour pouvoir utiliser le promoteur de JAZ10 pour contrôler l’expression de GUS, il faut tout d’abord cloner
le promoteur de JAZ10. Pour cela, il faut préparer les gDNA pour pouvoir amplifier le promoteur (voir A),
amplifier le promoteur (voir B), cloner le promoteur dans un plasmide (C et D) puis créer des plantes
transgéniques (transformation, voir E).

A. Purification de l’ADN génomique

Pour créer de l’ADN génomique pur pour pouvoir amplifier un promoteur, il faut :

- Prendre du tissu de la plante et l’écraser dans de l’azote liquide

- Dissoudre les membranes avec un tampon à PH8 contenant le détergent CTAB et qui a été préchauffé
à 65 degrés pour pouvoir dénaturer les protéines
- Centrifuger et récupérer le super-nageant
- Ajouter un mélange de chloroforme (hydrophobe) et d’isoamyl alcohol ou de phénol/chloroforme
pour isoler les acides nucléiques (ADN et ARN) des protéines et centrifuger. Cette technique de
séparation repose sur la différence de solubilité des acides nucléiques et des protéines. Après
centrifugation, on aura donc une phase organique (avec le chloroforme et les protéines) en bas et
une phase aqueuse (avec l’ADN) en haut.
- Ensuite il faut prendre la phase aqueuse où se trouve l’ADN génomique et y ajouter de la ribonucléase
A pour pouvoir dégrader les contaminants ARN qui se trouvent encore dans la solution. La RNase A
se fixe à l’extrémité 3’ des chaines qui se terminent par une pyrimidine C ou U et les dégrade. Il existe
aussi d’autres types de RNases qui dégradent d’autres chosent comme par exemple la RNase T1 ou
la RNase H
- Ensuite, après avoir enlevé l’ARN, il faut précipiter l’ADN génomique avec de l’isopropanol froid et
laisser sécher à l’air.
- Finalement, pour vérifier la qualité de notre ADN génomique, il faut mesurer l’absorbance par
spectrophotométrie. Il y a deux ratios qui nous intéressent :
o le ratio 260nm/280nm est sensé être autour de 1.7-2.0 et nous indique la pureté de notre
ADN (si ce ratio n’est pas bon alors cela veut dire qu’on a encore des protéines dans la
solution)
o le ratio 260nm/230nm est sensé être autour de 1.8 et nous indique la présence de
contaminants.

Une méthode alternative pour purifier l’ADN génomique est d’utiliser des kits, qui sont souvent basés sur
des colonnes de silice qui se lient à l’ADN et qui permettent donc de laver les contaminants. Les avantages
des kits sont qu’ils sont rapides, faciles à utiliser et qu’ils procurent de l’ADN de très bonne qualité. Leurs
désavantages par contre sont qu’ils sont chers, que le rendement est faible et qu’on ne sait jamais
exactement ce qu’il y a dans les tampons etc…

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B. Amplification du promoteur du gène d’intérêt

Par définition, le promoteur d’un gène se trouve toujours quelque part à l’extrémité 5’. Il est souvent difficile
de savoir la longueur d’un promoteur donc ce qu’on fait souvent c’est qu’on amplifie 2kb de la région 5’ et
comme ça on est sûr d’amplifier le promoteur.

Pour amplifier l’ADN génomique que l’on a purifié, on utilise la PCR.

On débute ici avec une très longue séquence

d’ADN génomique, avec quelque part le gène
JAZ10.
La première chose à faire pour l’amplification est
de chauffer l’ADN génomique pour le dénaturer.
Ensuite, comme on est intéressé à amplifier le
promoteur de JAZ10, on utilise pour la PCR deux
primers qui sont spécifiques à cette partie de la
séquence. Pour pouvoir par la suite cloner le
promoteur dans des plasmides, il faut que les
primers qu’on utilise possèdent chacun un site de
restriction. On choisit les sites de restriction qu’on
veut mais il faut faire attention à ce que les
enzymes correspondantes ne coupent pas à
l’intérieur du promoteur. Ici on a en l’occurrence
choisi les sites de restriction correspondant aux
enzymes EcoRI et NotI.
Une fois avoir mis les primers contenant les sites de restrictions choisi dans la solution avec le gDNA, on fait
la PCR avec la machine. Ensuite, on met le produit en présence des deux enzymes de restrictions qui
correspondent aux sites de restriction qu’on a choisis pour que la digestion du produit amplifié ait lieu.

Une fois que la région du promoteur de JAZ10 a été amplifiée, il faut le cloner dans un plasmide. Il existe
deux méthodes de clonage : par restriction ou par recombinaison.

C. Clonage par restriction d’ADN dans un vecteur (méthode classique)

La première chose à faire ici est de créer un plasmide dans lequel on pourra cloner notre promoteur. Ce
plasmide aura besoin de plusieurs choses :

- Les deux sites de restrictions EcoRI et NotI qu’on a choisi. Comme ça une fois
le plasmide créé on pourra l’ouvrir en ajoutant les deux enzymes de restriction, puis
on le mettra en présence de notre promoteur qui va pouvoir s’y intégrer puisque les
extrémités correspondent
- Certains plasmides ne seront pas coupés correctement par les enzymes, par
exemple pas coupés du tout ou alors coupés qu’à un endroit. Pour pouvoir
sélectionner seulement les plasmides qui ont été coupés correctement et qui ont
intégré notre promoteur, il faut un marqueur de sélection, comme par exemple un
gène de résistance à un antibiotique
- Pour avoir une double sélection, on rajoute aussi dans notre plasmide le gène LacZ entre les deux
sites de restriction. Le gène LacZ chez E.coli code pour une enzyme galactosidase qui catalyse du X-

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Gal et qui fait un précipité bleu. Ce gène se trouve à deux endroits du chromosome et les deux
sous-unités doivent être réunies pour pouvoir faire la protéine fonctionnelle. Ainsi, si on met ce
gène entre les deux sites de restriction alors si la recombinaison marche correctement il sera coupé
en deux et donc ne sera pas fonctionnel et ne pourra pas produire l’enzyme et donc ne pourras pas
catalyser le X-Gal et ne pas faire de précipité bleu et cela est donc un moyen de sélection. Si les
colonies sont bleues alors c’est que notre promoteur ne s’est pas inséré dans le plasmide.

Après avoir créé notre plasmide avec les trois éléments ci-dessus, on met les
enzymes de restriction pour couper le plasmide, on ajoute notre promoteur, et
on utilise l’enzyme T4 DNA ligase pour refermer le plasmide. On aura ainsi (si tout
a bien été) un plasmide recombinant qui possède notre insert d’ADN (le
promoteur de JAZ10).

Ensuite, pour sélectionner les clones positifs (les plasmides qui

ont bel et bien intégré notre promoteur), on les fait pousser sur
un milieu contenant de l’agar, de l’ampicilline et le substrat X-
Gal, et on sélectionne les colonies qui réussissent à pousser mais
qui ne sont pas bleues.

Un moyen de se simplifier la vie est de prendre un plasmide qui contient déjà un gène codant pour GUS
(notre gène rapporteur) et de faire tout ce qui a été dit ci-dessus.

D. Clonage par recombinaison d’ADN dans un vecteur (méthode Gateway)

Le clonage par recombinaison se base sur la phase lysogénique qu’utilisent les phages lamba pour infecter
les bactéries.
Dans la phase lysogénique d’infection, le phage infecte la cellule et y insère son
génome. Ensuite, son génome forme une structure circulaire qui va pouvoir s’insérer
dans le chromosome de la bactérie par recombinaison via l’enzyme intégrase. Cette
intégration est possible grâce à deux sites similaires, le site attB qui se trouve dans la
bactérie et le site attP qui se trouve dans le phage. L’ADN phagique peut ainsi rester
stable dans la cellule bactérienne pendant un certain nombre de générations, avant
de s’exciser du chromosome via l’enzyme excisionase et entrer en phase lytique.

Dans la phase lytique, le phage infecte la bactérie et y réplique son ADN, synthétise
de nouvelles capsides bactériennes et ensuite lyse la cellule (la tue) pour pouvoir
sortir.

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Le clonage par recombinaison est un système qui peut être exploité pour cloner ce qu’on veut dans un
plasmide. Cette méthode est composée de deux réactions faisant intervenir deux enzymes différentes : la
réaction BP et la réaction LR.

Lors de la réaction BP, on insère aux deux extrémités de notre produit PCR
(le gDNA du promoteur de JAZ10 en l’occurrence) des sites attB, puis on
le met en présence d’un plasmide donneur qui possède les sites attP
correspondants et en présence de l’enzyme BP clonase, qui va induire la
recombinaison des deux éléments. On obtient ainsi un plasmide entrée
qui a intégré notre ADN, ainsi qu’un by-product.

Ensuite, lors de la réaction LR, on met notre plasmide

entrée qui contient les sites attL en présence d’un vecteur
de destination qui contient les sites attR et en présence
de l’enzyme LR clonase, qui va induire la recombinaison des deux éléments. Ceci nous donnera notre
plasmide d’expression qui contient l’ADN et un nouveau plasmide donneur. A nouveau, des gènes de
résistance à des antibiotiques sont utilisés comme marqueurs de sélection.

4. Transformation into Arabidopsis

Une fois que nous avons créé nos plasmides possédant le construit JAZ10p :GUS, il faut créer des plantes
transgéniques qui contiendront ce construit. Pour faire cela, on utilise la bactérie Agrobactérium
tumafaciens.

E. Transformation des plantes avec JAZ10p :GUS en utilisant Agrobacterium

Agrobacterium est une bactérie qui possède un plasmide Ti, qui porte toutes les fonctions nécessaires pour
la transformation des plantes. Une part importante du plasmide Ti d’Agrobacterium est un T-DNA, qui sera
transféré de la bactérie à la cellule végétale et intégré au génome nucléaire de la cellulaire végétale, où il y
exprimera ses gènes et modifiera ainsi le métabolisme de la plante (production de cytokinine, d’auxine et
d’opines) et lui causera une tumeur. Ce système de transformation est exploitable afin d’introduire dans la
plante de l’ADN autre que celui d’Agrobacterium.

Pour faire ça, on va séparer le plasmide Ti en deux pour obtenir un petit plasmide Ti et un grand helper
plasmid qui contient la séquence opéron vir codant pour les gènes de virulence de la bactérie. Le plasmide
helper est maintenu dans Agrobacterium alors que le petit plasmide Ti va
être modifié en replaçant l’espace entre les deux bordures de la séquence
du T-DNA par notre gène d’intérêt (en l’occurrence notre construit) et par
un marqueur de sélection (en l’occurrence un gène codant pour une RFP,
comme ça après la transformation des plantes on pourra mettre les
graines sous la lumière rouge et ne sélectionné que celles qui sont rouges
= celles qui ont intégré le T-DNA modifié). On appellera ce petit plasmide
Ti modifié un « vecteur binaire » car il possède deux transgènes. Ensuite,
on remet le vecteur binaire dans les cellules d’Agrobacterium et on spray
les plantes d’Arabidopsis avec cette bactérie juste avant la floraison. Ainsi,

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une petite proportion des graines produites par ces plantes seront transgéniques et auront donc intégré
notre construit. On pourra sélectionner les graines en utilisant le marqueur de sélection.

5. Characterisation of the reporter line

GUS live staining

Ensuite, pour vérifier l’activité de nos plantes reporteurs (issues des graines ayant été transformées) tout en
les gardant vivantes, on blesse la plante sur le cotylédon puis rapidement on met en présence de X-Gluc dans
un tampon à PH7 (optimal pour l’activité de GUS) et ensuite on remet vite dans un milieu de croissance à PH
5.7 pour ne pas que la plante s’endommage. Ensuite, on regarde si une substance bleue se forme. Si oui c’est
que ça marche correctement. L’endroit où on voit le bleu est l’endroit où le promoteur de JAZ10 se trouve.
Le problème de cette méthode est qu’elle nous permet de voir si les plantes transgéniques fonctionnent
bien, mais qu’elle ne nous permet pas de savoir si le gène JAZ10 naturel fonctionne lui aussi encore.

Pour être sûr que le gène JAZ10 naturel fonctionne toujours correctement dans les plantes modifiées, on
mesure la quantité d’ARN messager produit en effectuant une qPCR, qui est une méthode semi-quantitative.
Ce qu’on fait c’est qu’on mesure cette quantité pour une plante WT et ensuite one le fait aussi pour une
plante reporteur, et ce qu’on aimerait c’est que la quantité d’ARN messager produite par la plante reporteur
soit la même que celle produite par une plante sauvage, ce qui indique que le gène est toujours fonctionnel.

Une qPCR est une méthode permettant de connaître les taux d’ARN d’un gène relativement à ceux d’un ou
plusieurs gènes de référence, dont le choix est crucial. Idéalement, le gène de référence devrait être exprimé
à des niveaux similaires à ceux du gène d’intérêt et ne devrait pas être induit ou réprimé par les conditions
de l’expérience. Dans notre cas, nous avons choisi comme gène de référence le gène UBIQUITIN21.

Typiquement, une qPCR consiste en plusieurs étapes :

1) Isoler l’ARN de la plante https://www.youtube.com/watch?v=0fEqfIiV53w

Il existe deux manières d’extraire de l’ADN de tissu de plante. Une manière est d’utiliser la méthode de
phénol/chloroforme, qui produit de grandes quantités d’ARN et qui est bon marché, mais qui est dangereuse
à cause de ses produits toxiques. La deuxième méthode consiste à isoler l’ARN sur une colonne. Cette
méthode est plus chère mais souvent préférée à la première car elle est moins dangereuse et rapide.

2) Synthétiser des cDNA

Pour pouvoir faire une PCR, il est nécessaire de synthétiser de l’ADN complémentaire à partir de l’ARN qui
nous avons extrait des plantes, car les polymérases ne sont pas capables d’utiliser de l’ARN comme template
et également car l’ARN est moins stable que l’ADN et qu’il fait des structures secondaires. Pour synthétiser
du cADN à partir d’ARN, on utilise la transcription reverse. Pour ça, on prépare une solution avec des oligo
dT primers, l’ARN qu’on a extrait des plantes et de l’eau sans RNases et on chauffe. Cela nous permet de
sélectionner seulement notre ARN d’intérêt, l’ARN messager, car les oligo dT primers y sont spécifiques car
ils reconnaissent sa queue poly-A.

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Ensuite, on prépare une solution avec l’enzyme reverse transcriptase, les dNTPs et un tampon pour la
synthèse du cDNA et également du DTT pour enlever les structures secondaires. On ajoute cette solution à
celle contenant l’ARN messager et on incube pour que l’enzyme procède à la reverse transcription.

3) Procéder à la PCR

Le but de cette réaction est de suivre l’amplification de notre ADN et donc de déduire la quantité initiale
d’ARN présent dans notre échantillon, ce qui indique l’expression de notre gène d’intérêt. Pour faire une
qPCR, il est nécessaire de choisir un gène de référence, car on ne peut pas être sûr que l’extraction d’ARN et
la synthèse de cDNA aient été parfaite. On choisit donc un gène de référence dont l’expression n’est pas
sensée être modifiée par nos conditions expérimentale et on regarde ainsi son expression en tant que
contrôle.

Pour une qPCR, il faut : une polymerase (on utilise souvent Taq qui est rapide et qui permet donc de ne pas
obtenir de grands amplicons), un tampon et des dNTPs, des primers spécifiques qui amplifient notre transcrit
d’intérêt (pour éviter d’amplifier de l’ADN génomique, on utilise généralement des primers qui
reconnaissent des régions situées sur des exons adjacents de notre gène) et un colorant qui nous permet de
suivre l’amplification.

Typiquement, une PCR consiste en trois étapes : dénaturation,

annealing et élongation. Durant la dénaturation, le double brin
d’ADN est séparé en deux simples brins à cause de la haute
température. Ensuite, les primers s’hybridisent à l’ADN et
finalement, la polymérase ajoute de nouveaux nucléotides
complémentaire au brin. A ce stade, on se retrouve à nouveau
avec des doubles brins et le cycle recommence.

Il existe deux différents types de colorants que l’on peut utiliser pour une qPCR : Sybr green et Taqman.

Le Sybr Green est un fluorophore non spécifique qui s’intercale entre la double hélice de n’importe quel brin
d’ADN et produit un complexe fluorescent. Ainsi, la proportion de fluorescence obtenue nous permet de
déduire la quantité d’ADN qu’on a. Sybr green permet de gagner du temps car lorsqu’on l’utilise, les étapes
d’annealing et d’élongation se passent en même temps.

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La méthode Taqman est utilisée quand on veut étudier un gène individuel mais qui fait partie d’une famille
des gènes. Le principe est qu’on a 2 primers et une sonde spécifique qui permet de pouvoir sélectionner un
gène précis parmi une famille de gènes avec des séquences similaires.
La sonde a une taille de 18-22 bases et possède à son extrémité
3’ un groupement phosphate et un groupe Q qui est un quencher
(désactivateur) et à son extrémité 5’ un fluorophore R.
Le principe de la sonde TaqMan repose sur l'activité exonucléase
5´–3´ de la Taq polymérase qui clive une sonde marquée lors de
son hybridation à la séquence complémentaire permettant
l'émission d'une fluorescence2. Comme pour d'autres méthodes
de PCR quantitative, le signal fluorescent résultant permet une
mesure quantitative de l'accumulation exponentielle du produit
au cours des différents cycles de PCR. Cependant la méthode
TaqMan permet une augmentation significative de la spécificité
de la détection.
La sonde TaqMan consiste en un fluorophore attaché de manière
covalente à l'extrémité 5´ d'un oligonucléotide et en un
désactivateur (quencher) à l'extrémité 3´Le désactivateur inhibe
la fluorescence émise par le fluorophore lorsqu'il est excité par la
source de lumière du thermocycleur1. Ainsi, tant que le
fluorophore et le désactivateur sont à proximité l'un de l'autre, le
signal fluorescent est inhibé par le désactivateur.
Chaque sonde TaqMan est conçue de sorte à s'hybrider avec une région d'ADN spécifique amplifiée par une
paire de d'amorces spécifiques (contrairement à la figure, la sonde s'hybride à de l'ADN simple-brin). Alors
que la Taq polymérase élonge l'amorce et synthétise le brin néoformé de l'extrémité 3´ vers 5´ du brin
complémentaire, l'activité exonucléase 5´–3´ de cette même Taq polymérase dégrade la sonde déjà hybridée
au brin matrice. La dégradation de la sonde relargue le fluorophore cassant ainsi la proximité existant avec
le quencher et permettant l'expression de la fluorescence. Ainsi, la fluorescence détectée est directement
proportionnelle au relargage de fluorophore et donc à la quantité d'ADN d'intérêt présent dans le produit
de PCR.

6. Methods of mutagenesis and identification of the mutated gene

Pour étudier la fonction d’un gène, il peut être utile d’étudier des plantes chez lesquelles la fonction de ce
gène est totalement ou partiellement interrompue. Il existe de nombreux moyens d’obtenir des mutants
d’A.thaliana, comme la mutagenèse par T-DNA, les mutations ponctuelles, la transformation avec
Agrobacterium etc…

Le but de la mutagenèse est d’augmenter le taux de mutation à chaque génération sans pour autant tuer les
organismes. Il existe plusieurs moyens de faire de la mutagenèse : méthodes chimiques, physiques ou
biologiques.

- Méthode chimique : utilise de l’EMS qui introduit des mutations ponctuelles (point mutation = type
of mutation that causes a single nucleotide base substitution, insertion, or deletion of the genetic
material), qui n’ont souvent pas un effet très grand car peuvent concerner des régions non codantes
etc… Il faut beaucoup de mutations ponctuelles pour voir un effet sur le phénotype. Cette méthode
est beaucoup utilisée par les biologistes.

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From mutation to gene function - résumé

- Méthode physique : utilise les rayons UVB ou UVC, les rayons X, radiations par neutrons, radiations
β. Cette méthode cause des réarrangements génomiques (insertion/déletion). A un grand effet car
modifie beaucoup l’ADN donc pas trop safe car les mutants ne seront pas forcément viables.

- Méthode biologique : utilise les rétrotransposons, les retrovirus, les T-ADN, CRISPR-Cas9,
recombinaison homologue.

Pour pouvoir travailler avec des lignées mutantes, il est nécessaire que les mutants soient homozygotes.
Donc ce qu’on fait c’est qu’on mute des graines en les mettant dans de l’EMS pendant 8 heures, afin qu’elles
soient mutantes mut/mut. Ensuite, on fait pousser ces graines, et on les fait se reproduire avec des graines
d’une plante sauvage WT/WT. Cela va donner une génération F1 hétérozygote mut/WT, qu’on va ensuite se
laisser autoféconder. Ensuite, selon les règles de ségrégation Mendélienne, ¼ de la descendance F2 sera
homozygote pour la mutation.

Ensuite, pour identifier le gène muté, on extrait de l’ADN génomique des plantes, puis on séquence une
partie du génome (méthode Sanger ou méthode Illumina) et on compare le génome du mutant à celui d’une
plante sauvage, et on essaie de localiser les SNP (dans le cas le plus simple, le gène muté sera le seule avec
une SNP avec une fréquence de 100%).

Extraction de l’ADN génomique

Pour extraire de l’ADN génomique des plantes mutantes il faut :

- Ecraser une feuille de la plante dans un tube
- Incuber avec un tampon de lyse
- Ajouter du NH4Ac pour faciliter la précipitation des protéines (augmente la concentration ionique de
la solution)
- Centrifuger
- Prendre le super-nageant et mettre de l’isopropanol (un dissolvant)
- Centrifuger à nouveau et enlever le super-nageant
- Nettoyer le pellet avec de l’alcool
- Centrifuger encore une fois et enlever le super-nageant
- Re-suspendre le pellet avec du tampon EB. Dans certains cas et particulièrement si on prévoit de
stocker l’ADN pendant un moment, il peut être utile d’ajouter de l’EDTA dans le tampon pour éviter
la dégradation de l’ADN (l’EDTA se lie aux ions calcium dont les DNases ont besoin pour fonctionner).

Sanger sequencing

1) Dénaturer l’ADN en chauffant pour obtenir deux simples brins

2) Annealer un primer au brin modèle
3) Préparer 4 différents tubes auxquels on ajoute :
a. Le brin modèle avec le primer
b. L’ADN polymérase
c. Des dNTP’s (nucléotides libres)
4) Ensuite, dans chacun des tubes, on ajoute une sorte de ddNTP’s (nucléotides modifiés), par exemple
dans un tube des ddATP, dans l’autre des ddTTP, dans l’autre des ddCTP et finalement dans le dernier
des ddGTP. Ces nucléotides sont modifiés et ne possèdent pas de groupe OH à leur extrémité 3’, ce
qui fait que l’élongation par la polymérase va s’arrêter une fois que ce nucléotide aura été ajouté.

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From mutation to gene function - résumé

Les ddNTP’s sont souvent labellé avec un composé fluorescent pour pouvoir détecter la dernière
base de la séquence et sont présents en concentration moins élevée que les dNTP’s pour que
suffisamment de fragments puissent être produits.
5) Ensuite, on fait migrer nos 4 solutions par électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour pouvoir en
séparer les composants selon leur taille, et pour pouvoir détecter la dernière base fluorescente et
ainsi déduire la séquence.

Par définition, les réactions de séquençage peuvent générer des séquences d’environ 600-1000 paires de
bases. Souvent, les gènes sont plus longs que ça et donc pour pouvoir les séquencer entièrement il faut
utiliser plusieurs primers différents qui génèrent des séquences qui se chevauchent et comme ça ensuite on
peut reconstruire la séquence entière à partir des différents fragments qu’on a séquencés.

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Illumina sequencing

La méthode Illumina est utilisée pour séquencer le génome entier, et la principale différence entre cette
méthode et la méthode Sanger est que la méthode Sanger se fait sur phase liquide alors que la méthode
Illumina se fait sur une plaque de verre solide.
La méthode Illumina se fait en trois étapes : préparation de l’ADN, préparation du cluster et séquençage.

1) Préparation de l’ADN

La première chose à faire est de séparer notre ADN génomique en petits fragments longs de 20 à 200 paires
de bases. Ensuite, on ajoute une T4 DNA polymérase pour réparer les
bouts et une ADN polymérase I pour ajouter une base A à l’extrémité
3’ de tous les brins. Ensuite, et pour pouvoir par la suite attacher
notre ADN génomique sur la plaque de verre, on ajoute une T4 DNA
ligase qui va attacher un adaptor à chaque extrémité des doubles
brins d’ADN génomique. Ces adaptors sont homologues aux
oligonucléotides qui se trouvent sur la plaque de verre et donc ils s’y
lient et permettent d’attacher notre ADN génomique sur la plaque
pour le séquençage.

2) Préparation du cluster

Une fois qu’on a préparé notre solution comme ci-dessus, on la

verse sur la plaque pour que les gDNA se lient aux
oligonucléotides via les adaptors. Tous les gDNA ne vont pas
réussir à s’attacher correctement sur la plaque et donc pour se
débarrasser des fragments qui ne se sont pas liés correctement,
il suffit de chauffer.
Ensuite, une fois qu’on s’est débarrassé des gDNA mal attachés,
on lave et on refroidit. Ce qu’il va se passer c’est que les gDNA
simple brin correctement attachés vont se plier et venir s’attacher
via leur adaptor aux oligonucléotides qui sont encore libre sur la
plaque pour former une sorte de pont. Ensuite, on utilise un
primer et une DNA polymérase pour qu’un brin complémentaire
se forme, et pour finalement obtenir à nouveau un double brin.
Ensuite, on chauffe à nouveau pour que les deux brins se
séparent. On arrive donc à ce stade avec le double d’ADN qu’on
avait au début. On refait ensuite ces trois étapes (refroidir, synthèse d’ADN, chauffage pour séparation des
brins) pendant environ 30 cycles pour amplifier l’ADN, puis quand c’est terminé, on peut faire le séquençage.

3) Séquençage

Lors du séquençage, on ajoute des primers qui vont s’attacher à nos brins et on
ajoute aussi des nucléotides fluorescents. Ensuite, ces bases fluorescentes vont
s’attacher à nos brins d’ADN en fonction de la complémentarité des bases. En
utilisant une machine qui détecte la fluorescence, on pourra ainsi tout
simplement connaître la séquence de notre gDNA (la séquence sera
exactement opposée à la suite de couleur qu’on observe).

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From mutation to gene function - résumé

En faisant le séquençage pour nos mutants, on a trouvé qu’un

seul SNP (*) avait une fréquence de 100%. En l’occurrence, on
a trouvé que cette SNP était une mutation dans le gène NINJA
qui créait un codon stop prématuré. On a de cette manière
trouvé 3 différents mutants ninja : ninja1, ninja2 et ninja3.

RNA-sequencing

Au lieu d’étudier l’expression d’un ou de plusieurs gènes en faisant de la qPCR, il est possible d’étudier des
transcriptomes entiers. On peut par exemple comparer l’expression de tous les gènes chez une plante WT
et chez un mutant ninja1, ce qui se fait en faisant du RNA-sequencing. Dans cette méthode, ce sont les copies
ADN de l’ARN messager (les cDNA) qui sont séquencées. Ce qu’il faut donc faire c’est extraire l’ARN des
plantes, le purifier sur une colonne oligo dT pour ne garder que l’ARN messager, puis le convertir en cDNA
en utilisant la transcription inverse (rétrotranscriptase et oligo dT primers). De manière générale, on ne peut
pas faire du séquençage sur de l’ADN simple brin et donc il faut d’abord faire de l’ADN double brin en utilisant
des random primers et en utilisant l’ADN polymérase. Après avoir obtenu de l’ADN double brin on peut faire
la procédure normale de séquençage Illumina. Avec cela on obtient comme résultat l’abondance relative de
cDNA génomique.

Pour explorer les effets de la mutation ninja1 sur Arabidopsis, les transcriptomes du WT et de ninja1 ont été
comparés par RNA-sequencing. Avec cela on a trouvé que 60 gènes du mutant ninja1 sont upregulated, dont
le gène JAZ10.

On en conclut donc que le gène NINJA est un répresseur spécifique du gène JAZ10. A ce stade, plusieurs
questions concernant NINJA peuvent se poser dans le but de comprendre la biologie de la réponse aux
blessures :
- Où est-ce que le gène NINJA est exprimé ? (Dans les racines)
- Où se trouve la protéine codée par NINJA ?

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From mutation to gene function - résumé

7. Which proteins form a signalling complex with NINJA and JAZ10

Pour savoir avec quoi la protéine codée par le gène NINJA interagit, il faut en premier lieu obtenir la protéine
NINJA partiellement pure.

Purification de la protéine NINJA

Pour cela, on utilise E.Coli et l’opéron lac et on transforme NINJA avec un His-tag pour exprimer la protéine
de NINJA. Avec ça on obtient une séquence avec la protéine de NINJA et à la fin 6 résidus Histidine (ce qui
est très rare). Les 6 résidus histidine sont capables de se lier à l’ion Ni2+ et donc on peut donc exploiter ça
pour purifier la protéine de NINJA = pour enlever le His-tag.

Ceci nécessite 2 étapes de purification :

1) Mettre la solution sur une colonne de Nickel pour que la séquence contenant notre protéine et le
His-tag s’y lie et ne soit pas éluée
2) Ensuite il faut séparer la protéine NINJA du His-tag. Il y a dans la séquence entre la protéine NINJA
et les 6 histidine quelques acides aminés formant un protease cleavage site CS. Donc on utilise une
protéase non spécifique TEV (tobacco etch protease) pour cliver au site cs et ainsi libérer la protéine
NINJA du His-tag. Ensuite on remet sur une colonne de Nickel et donc le His-tag va s’y lier et la
protéine NINJA va être éluée et on peut la récupérer et elle sera 90% pure.

Si on veut savoir si la protéine NINJA est monomérique on peut faire de la chromatographie de filtration sur
gel ou alors une électrophorèse.

Ensuite, si on veut savoir avec quelles protéines la protéine NINJA interagit, on utilise une méthode appelée
TAP-tagging.

TAP-tagging

Pour cela, on crée une version tap-tagged de notre protéine d’intérêt

(appelée TP sur la photo). Le Tap tag consiste en un domaine de liaison
d’une proétine A fusionné avec un calmoduline binding peptide CBP et
avec un site de clivage protéasique cs au milieu (voir photo).
Une fois qu’on a préparé le tag, on met notre solution dans une
colonne contenant des immunoglobulines se liant à la protéine A pour
que notre protéine taggée s’y lie et que tout ce qui ne nous intéresse
pas soit élué.
Ensuite, on met un tampon contant une protéase pour que notre
séquence soit clivée au site cs et donc que la partie contenant notre
protéine d’intérêt soit séparée de la partie avec le domaine de la
protéine A.
Ensuite pour être sur qu’on a que la partie qui nous intéresse avec
notre protéine, on met sur une colonne avec de la calmoduline comme
ça le CBP s’y lie et tout le reste est élué.

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From mutation to gene function - résumé

Ensuite, pour récupérer notre protéine d’intérêt on met de l’EGTA qui chelate les ions calcium et donc libère
la protéine et le CBP de la calmoduline.
On obtient donc au final notre protéine d’intérêt avec le CBP et les protéines avec lesquelles elle interagit.
Ensuite on fait une électrophorèse sur gel SDS-PAGE, on coupe le gel obtenu, on traite avec de la trypsine
pour avoir des fragments plus petits et ensuite on fait de la spectrométrie de masse pour identifier les
protéines qui sont liées à NINJA.

En faisant ça, on a trouvé que la protéine NINJA est directement liée avec les protéines JAZ10 et TPL (topless),
pour former un complexe répresseur de la transcription de certains gènes de défense. Pour savoir qu’est-ce
qui donne sa spécificité au complexe, il faut faire un yeast two-hybrid screening.

Yeast two-hybrid screening

La technique de double hybride est une technique de biologie moléculaire

permettant de détecter une interaction physique entre deux protéines. La
technique est la suivante : on utilise une protéine test (telle Gal4) dont une des
extrémités peut se fixer à une séquence activatrice, et l'autre activer la
transcription du gène rapporteur (comme lacZ) mis sous contrôle de cette
séquence. Par génie génétique, on synthétise ensuite deux protéines hybrides :
une constituée de l'une des extrémités de la protéine test fusionnée avec la
première protéine d'intérêt, l'autre formée de l'autre extrémité fusionnée à l'autre
protéine d'intérêt. Si les deux protéines interagissent physiquement, ces deux
hybrides vont se rapprocher et permettre la transcription du gène rapporteur.

Ici ce qu’on fait c’est qu’on exprime un DNA bingind domain BD lié avec un
activation domain AD et on voit que lacZ est exprimé. Ensuite on fait de même mais
lorsque DBD et AD ne sont pas liés et on voit que dans ce cas lacZ n’est pas exprimé.
Pour savoir quelle partie est nécessaire pour l’expression de lacZ, on lie le BD avec
JAZ10, puis on lie AD avec une libraire de cDNA de la plante, qui lui même est lié
avec JAZ10. En faisant ça et en regardant quel cDNA permet l’expression de lacZ, on peut donc trouver d’où
vient la spécificité du complexe. On a en l’occurrence trouvé que c’est le facteur de transcription MYC.

MYC est un facteur de transcription qui active l’expression des gènes de

défense. C’est lui qui donne au complexe répresseur sa spécificité. Quand la
plante n’est pas blessée, MYC est lié a JAZ10 et à NINJA et TPL, et donc
l’expression des gènes de défense est réprimée.

Quand la plante est blessée par contre, JAZ10 est détruit par protéolyse. Ainsi,
le complexe NINJA + TPL se libère de MYC et donc lorsque MYC est seul, il
permet la transcription des gènes de défense.

On a réussi à identifier une partie du complexe protéasique capable de détruire

JAZ10 et donc de permettre l’expression des gènes de défense. C’est COI1. COI1
est activé par le jasmonate, qui est produit par les plantes blessées. Le
jasmonate active COI1 qui se lie à JAZ10 et le détruit et donc NINJA et TPL
partent et MYC permet l’expression des gènes de défense.

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From mutation to gene function - résumé

8. Further methods for the manipulation of nucleic acids

Site-directed mutagenesis using PCR

Dans le cas où on a envie de changer quelques nucléotides dans un gène pour le faire produire une protéine
différente, on peut utiliser une technique de PCR appelée in vitro site-directed mutagenesis.

Pour cela on a besoin de faire 2 PCR. Pour chacune, on utilise

un set de primers différent, avec différents flanking primers
et internal primers. Avec ces deux PCR, on obtient deux
produits différents.

Ensuite on va mixer les produits 1 et 2, les diluer et les

dénaturer pour avoir des brins indépendants, et ensuite on
les ré-annelle et on obtient 4 produits différents (voir
encadré bleu).

Ensuite, on refait une PCR avec ces 4 nouveaux mixed

products en utilisant les 2 flanking primers (voir flèches
noires). On voit que seul le produit rouge (mutated NINJA)
possède les 2 flanking primers et donc c’est le seul qui sera
amplifié et donc le résultat de la troisième PCR est un seul
produit (le mutated NINJA rouge). Ce produit est finalement
prêt pour le clonage.

Certaines techniques très intéressantes pour les chercheurs sont celles permettant de modifier le moment,
l’endroit ou le niveau d’expression des gènes. L’utilisation de ces techniques requiert cependant de la
rigueur. Par exemple, la sur-expression d’un gène peut mener à la sur-production de protéines, ce qui fait
qu’on la voit exprimée partout et qu’on ne peut donc pas déterminer sa localisation réelle.

Gene overexpression

Une information importante quand on cherche à comprendre la fonction d’un gène est sa localisation. Pour
connaître la localisation d’un gène, on peut par exemple fusionner la séquence codante de notre gène
d’intérêt avec la séquence d’un promoteur fort (comme par exemple le promoteur de l’ubiquitine) et avec
celle d’un gène marqueur (comme par exemple la GFP), ce qui induit la sur-expression de notre gène
d’intérêt et la possibilité de visualiser son expression par microscopie à fluorescence.
Pour faire ça, on crée un plasmide qui contient la séquence de notre gène, la séquence du promoteur fort
et la séquence du gène marqueur, on le met dans une cellule d’Agrobacterium pour qu’une recombinaison
ait lieu, et ensuite on trempe nos plantes dans une solution d’Agrobactrium pour que les plantes soient
transformées avec notre plasmide. Ensuite, on observe ces plantes sous microscopie à fluorescence et on
regarde où le gène est exprimé.

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From mutation to gene function - résumé

En plus de l’overexpression, un autre moyen d’étudier un gene est de réduire sélectivement son expression,
ce qui peut se faire à l’aide de deux techniques : RNA interférence et CRISPR interférence.

RNA interference

Un ARN interférent est un acide ribonucléique (ARN) simple ou double brin dont l'interférence avec un ARN
messager spécifique conduit à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en protéine. Dans la mesure
où l'ARN joue un rôle crucial dans l'expression des gènes, l'ARN interférent permet de bloquer celle-ci en
rendant «silencieux» tel ou tel gène. Ce phénomène a été découvert dans les années 1990, valant à Andrew
Z. Fire et Craig C. Mello le prix Nobel de physiologie et de médecine en 2006. Il serait vraisemblablement un
produit de l'évolution permettant aux organismes de se défendre contre l'introduction de génomes
étrangers, notamment viraux, ou encore permettant de moduler l'expression des gènes.
L'interférence par ARN a été découverte fortuitement : en 1990, Jorgensen et ses collaborateurs tentaient
de renforcer la couleur pourpre de pétunias en introduisant un vecteur codant un pigment dans cette plante.
De façon surprenante, certains pétunias devenaient partiellement ou totalement blancs, le gène introduit
éteignant le gène naturel. En 1994, Wassenegger1 montra que l’introduction d’ARN double brin dans des
cellules d’Arabidopsis thaliana déclenche une méthylation de l’ADN correspondant. Ce mécanisme a été
initialement appelé transcriptional gene silencing (TGS).
En 1998, Andrew Z. Fire et Craig C. Mello ont montré que l’on pouvait réduire spécifiquement l’expression
de protéines contenues dans des cellules du nématode Caenorhabditis elegans, en introduisant de l'ARN
double brin dans celles-ci. Ce phénomène fut alors nommé ARN interférence. L’ARN interférent se lie
spécifiquement avec l’ARN messager (ARNm) cible, conduisant à la dégradation de celui-ci et de ce fait à
l'inhibition de l'expression de la protéine correspondante. Ces deux chercheurs ont reçu le 2 octobre 2006
le prix Nobel de physiologie et de médecine pour leurs travaux.
Ce mécanisme d'ARN interférence, qui a probablement été sélectionné au cours de l'évolution comme un
moyen de protection contre l'introduction de génomes étrangers, notamment viraux, a été très utile pour
comprendre la fonction de certains gènes chez le nématode C. elegans ou d'autres organismes : en observant
le phénotype résultant de l'interférence on peut en déduire la fonction du gène. Cependant jusqu'en 2001,
il était impossible d'utiliser cette approche dans les cellules de mammifères. En effet, les mammifères ont
développé une réponse antivirale particulière : la présence d'ARN doubles brins de grande taille induit
l'activation de la voie interféron qui aboutit à la dégradation des ARN cellulaires, quelle que soit leur
séquence. Cette dégradation conduit à la mort de la cellule infectée. Les tentatives effectuées pour utiliser
l'ARN interférence comme on le faisait chez les nématodes conduisaient par conséquent à cette mort
cellulaire sans aucune spécificité.
Cependant, en 2001, Thomas Tuschl, alors chercheur post-doctoral chez Phillip A. Sharp, eut une idée
remarquable : lorsque l'on introduit des ARN double brins longs chez C. elegans, on observe que des petits
ARN doubles brins courts, de 21 à 25 paires de bases sont générés. On sait maintenant que c'est la protéine
éminceuse Dicer qui génère ces petits ARN interférents. L'idée de Tuschl fut d'introduire directement les
petits ARN interférents dans les cellules de mammifères. Cette manipulation provoqua l'interférence par
ARN sans déclencher la réponse interféron non spécifique.
Les perspectives importantes ouvertes par ces travaux ont conduit de nombreux laboratoires à étudier ce
mécanisme. On en a maintenant élucidé le principe général. Les ARN double brins présents dans une cellule
sont tout d'abord pris en charge par une ribonucléase de type III appelée Dicer, l'« éminceuse ». Celle-ci clive
l'ARN double brin toutes les 21 à 25 paires de bases. Dicer transfère alors les petits ARN interférents (pARNi)
à un gros complexe multiprotéique, le complexe RISC (RNA-induced silencing complex). Un des brins du
pARNi, dit passager, est éliminé tandis que l'autre (appelé « guide ») dirige le complexe RISC vers les ARNm
possédant une séquence complémentaire au brin guide. Si la complémentarité entre le pARNi et l'ARNm

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From mutation to gene function - résumé

cible est parfaite, le complexe RISC clive l'ARNm cible qui est alors dégradé et n'est donc plus traduit en
protéine. Quelques bases non complémentaires suffisent pour empêcher le clivage. Ce mécanisme est donc
très spécifique de la séquence du siRNA et de sa cible, l'ARNm. Dans certains cas, on peut choisir un pARNi
capable de cliver un ARNm porteur d'une mutation ponctuelle sans affecter l'ARNm sauvage.
En 2006, plus de 14 000 articles scientifiques faisaient référence à cette technique d'interférence par ARN,
montrant l'extraordinaire intérêt que les chercheurs lui portent. L'utilisation de petits ARN interférents pour
étudier la fonction d'un gène chez les mammifères est devenue en très peu d'années une technique de base,
utilisée par des biologistes de toutes disciplines. Cette technique fait également l'objet de travaux en matière
de biotechnologies végétales, afin de créer de nouvelles sortes d'OGM 2.
Depuis plusieurs années d'autres techniques destinées à inhiber l'expression d'un gène avaient été mises au
point. Les plus connues utilisent des antisens, des ribozymes, des aptamères, des oligonucléotides antisens.
Par rapport à toutes ces techniques, l'interférence par ARN s'est révélée tout à la fois plus efficace et
beaucoup plus souple au niveau du choix de la séquence cible et techniquement simple à mettre en œuvre
au laboratoire ce qui explique sa très grande popularité. De nombreux gènes sont surexprimés ou exprimés
au mauvais endroit ou au mauvais moment dans de nombreuses pathologies. La possibilité de pouvoir
inhiber ces expressions pathologiques est un espoir important pour soigner ces nombreuses maladies, au
premier rang desquelles on trouve les cancers. Il est remarquable de voir que moins de cinq ans après l'article
de Tuschl et coll. des essais cliniques sont déjà en cours chez l'homme pour traiter des pathologies oculaires
(dégénérescence maculaire liée à l'âge) et certaines pathologies virales (virus syncitial respiratoire). Ces
essais n'ont pour le moment révélé aucune toxicité particulière et ont montré une bonne efficacité ce qui
est encourageant mais doit être confirmé par des essais à plus grande échelle.

CRISPR-Cas9 genome editing

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