Université de Bretagne Sud

Licence Sciences et Technologies

Mention SVT - 2ème année
UE BIO1415 Du gène à la protéine

TP1 : Effets de mutations sur l’activité du promoteur P1 de Lactococcus lactis 

L’opéron lacticine 481 de la bactérie Gram positive Lactococcus lactis ADRIA 85LO30 code
pour une bactéricine. Le point d’initiation de la transcription de cet opéron a été identifié
expérimentalement par extension d’amorce et le promoteur P1 correspondant ne semble être
constitué que d’une séquence 10 sans extension (Fig. 1). Il est à noter qu’une séquence
répétée inversée est située en amont de la séquence 10 (Fig. 1, flèches convergentes). Afin
d’identifier des séquences importantes pour le fonctionnement de P1, plusieurs mutants de P1
ont été construits par mutagénèse dirigée. Trois de ces mutants sont montrés sur la Fig. 1. Les
fragments d’ADN contenant P1 et ses mutants ont été indépendamment insérés dans le
vecteur plasmidique pAK80 (Fig. 2), en amont des gènes lacLM qui codent pour une -
galactosidase. Les plasmides obtenus (pAP1, pAP1IR, pAP1D, et pAP1+3 [Fig. 1]) ont été
introduits dans la souche sauvage L. lactis IL1403 et pAP1 a été introduit dans la souche
mutante L. lactis SMBI77.
Les souches résultantes ont été cultivées dans du milieu GM17 contenant 5 g/ml
d’érythromycine pendant une nuit et les bactéries ont été récoltées par centrifugation. Vous
doserez l’activité -galactosidase à partir d’un culot bactérien (obtenu à partir d’1 ml de
culture) de chacune des souches.

Dosage de l’activité -galactosidase

La -galactosidase est une enzyme qui hydrolyse les -D-galactosides comme le lactose. Elle
peut être dosée à l’aide de substrats incolores qui deviennent colorés après leur hydrolyse.
Vous utiliserez l’ONPG (o-nitrophenyl--D-galactoside) qui est hydrolysé en galactose et o-
nitrophenol par la -galactosidase. L’o-nitrophénol est jaune et sa concentration peut être
mesurée par la DO à 420 nm. Si l’ONPG est en excès, la quantité d’o-nitrophénol produite est
proportionnelle à la quantité de -galactosidase présente et à la durée de la réaction

1
enzymatique. La réaction est arrêtée par l’addition de Na2CO3, qui provoque une
augmentation du pH jusqu’à 11. A ce pH, la -galactosidase est inactive.

Protocole

1. Resuspendre chaque culot bactérien dans 1 ml de tampon Z

2. Mesurez la densité optique de chaque suspension bactérienne : placez 200 l de chaque
suspension bactérienne dans une cuvette plastique de spectrophotomètre, ajoutez 800 l
de tampon Z, homogénéisez et mesurez la DO600. Conservez pour la suite.
3. Vous doserez l’activité -galactosidase à partir de 500 l de suspension bactérienne.
4. Ajoutez 50 l d’un mélange acétone-toluène (9 :1) et mélangez au vortex pendant 10 s.
Cette étape perméabilise les bactéries.
5. Incubez 10 min dans l’étuve à 30 °C
6. Ajoutez 100 l d’ONPG (4 mg/ml dans du tampon Z), mélangez au vortex pendant 2 s et
incubez dans l’étuve à 30 °C. Notez précisément l’heure à laquelle l’ONPG a été ajouté.
7. Lorsque la coloration jaune est apparue, ajoutez 250 l de Na2CO3 1 M, mélangez, et
notez précisément l’heure d’arrêt de la réaction.
8. Centrifugez 20 min pour éliminer les débris cellulaires et mesurez la DO420 du surnageant.
9. Calculez l’activité enzymatique :
DO420  1000
Activité (unités Miller) = 
DO600  v  t

v = volume en ml de la suspension bactérienne utilisée lors du dosage

t = temps d’incubation en min

Interprétez les résultats.

2
P1 sauvage
+1

pAP1 GAAATGTGTTGACATTTGTTACTATCTAAACAATCAAAATATTATATAATGATTTG
10

mutants de P1

pAP1-IR GGGGTGTGTTGACATTTGTTACTATCTAAACAATCAAAATATTATATAATGATTTG

pAP1-D GAAATGTGTTGACATTTAGCTCTATCTAAACAATCAAAATATTATATAATGATTTG

pAP1+3 GAAATGTGTTGACATTTGTTACTATCTAAACAATCAAAATATTATATAATGATTTG

GAT

Fig. 1. Séquences du promoteur P1 sauvage et de ses trois mutants.

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 HindIII

polylinker
rbs

Promoterless beta-galactosidase
Erm

pAK80

p15A replicon

EcoRI
SalI

EcoRI
pCT1138 replicon

Fig. 2. Carte du plasmide pAK80. Promoterless beta-galactosidase : gènes lacLM sans

promoteur ; erm : gène de résistance à l’érythromycine ; replicons p15A et pCT1138 :
origines de réplication fonctionnant dans E. coli et L. lactis ; polylinker : sites de clonages
permettant l’insertion de fragments d’ADN en amont de lacLM (Israelsen et al. 1995. Appl.
Environ. Microbiol. 61, 2540-2547).

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 TP2 : Bioinformatique : analyse de la souche mutante Lactococcus lactis SMBI77.

Lors du TP1, vous avez dosé l’activité du promoteur de transcription P1 dans la souche
sauvage L. lactis IL1403 et dans la souche mutante L. lactis SMBI77. La mutation de la
souche SMBI77 est due à la transposition de la séquence d’insertion ISS1 dans le
chromosome bactérien. Les fragments d’ADN bordant ISS1 dans le chromosome de SMBI77
ont été isolés et séquencés. ISS1 s’est insérée en position 740 dans la séquence d’ADN qui
vous est donnée (cette séquence n’inclus pas ISS1).
Vous rechercherez quel gène est interrompu par ISS1 dans la bactérie mutante puis vous
tenterez d’identifier la fonction de la protéine codée en interrogeant les banques de données.
Vous disposez d’un fichier texte (.txt) contenant la séquence appelée SMBI77.

1. Recherche des gènes.

Vous utiliserez divers sites internet permettant l’analyse des génomes.
A l'aide de l'application ORFinder trouver tous les cadres ouverts de lecture. Combien d'ORF
obtient-on ? Quel est le plus probable ? Retenez celui-ci (www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf).
Pour analyser la séquence SMBI77, copiez cette séquence à partir du fichier .txt et collez-la
dans le cadre approprié. Vous rechercherez les régions codantes dans les six phases de
lectures de la séquence SMBI77 et en déduirez quel est le gène le plus probable de la
séquence. Cliquez sur la partie verte de l’ORF le plus probable. Cliquez sur ‘Accept’ puis
sélectionnez le format « fasta protein » puis sur ‘view’.
Copiez la séquence protéique et collez-la dans le fichier texte. Sauvegardez le fichier. Faîtes
de même pour le format fasta nucleotide.

Analyses complémentaires :
- détermination du pourcentage de GC dans la séquence d’ADN et nombre de codons :
allez sur http://bioinfo.hku.hk/services/analyseq/cgi-bin/freqsq_in.pl pour utiliser le
programme « FREQSQ ». (question 2 p 8)
- obtention de la séquence du brin complémentaire : allez sur
http://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html pour utiliser
« INVCOMP »
- Carte de restriction : allez sur http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php pour utiliser
« NEBcutter V2.0 ». Rechercher le nombre et la position des sites de restriction
demandés page 4 (question 3a) (utiliser « Custom digest » dans « Main options »).

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Répondez aux questions 3b et 3c.

2. Recherche de la fonction de la protéine.

a) Interrogation des banques de données pour rechercher des protéines homologues.
Utilisez le site du National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Institutes
of Health (NIH), USA (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) :
Cliquez sur « BLAST » sur le bandeau, puis sur « Protein – protein BLAST (blastp) », coller
la séquence protéique au format FASTA dans le cadre, puis cliquer sur « BLAST ! ».
Observez les domaines conservés (en cliquant sur show conserved domain) et cliquez sur ces
domaines pour obtenir plus d’informations.

b) Recherches bibliographiques.
Pour mieux déterminer la fonction de la protéine, réalisez une recherche bibliographique en
allant sur la page d’entrée du site NCBI, dans Search « Pubmed » for « votre mot clé » puis
cliquez sur « Go ».
Si vous utilisez un plusieurs mots clé, ajoutez « AND » (en majuscules) entre chaque mot clé.

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Binôme : Groupe :

1 atagtgcgcc agcagttgta attgtttgga taatatacta tcttattcac ggtaaacatc

61 aaaaatcaag ctctgaagtt tgatttaaat gatttacata aaacatgtta taataaaggg

121 gttacagccc tgtatatggc gaaataaatg aataaaaaat agcgagtaga tgagttttaa

181 aatgaaagaa atggcaaacg taaacattga atatctaatc aatacactgg aacaaaaaaa

241 agtgagtgtt gtaacacgca aaaaacatag ttatatcatg tatcaaggga ttgaatcaga

301 atatatctat gtactcaaag atggtgtagc gaagattagc aatattttaa gagatggtcg

361 tgaatttaat attgcttatg ttgcggagcc agactttgtt tctttattgg aagagaaaca

421 aaacgatgga atttcagcat tatttaatgt acgaattgag tctccaacag ccagttttta

481 caaaatttca cgcagtgatt tttggaattg ggttcgtgag gatttgaatt tattcagagt

541 tgttgatgac ttttataaac gaagactagc acttaattta gaaattcttc aaaagatgac

601 aatcaatggt aagaagggag cggtttgcgc ttgccttcac agtttgattg atgatttcgg

661 aataagaaaa aaagatggaa ttctgattga ttttaccgtc actaatgaag atattgcagg

721 tttttgtggt atttctacac gaaatagtgt taaccgtatt cttcatgatt taaaggatga

781 aaaagtaatt ggagtgattg ataataaaat tatgatttat aatcctcaat acttagaaga

841 atatattagt taatataaat aaataaaaaa gctactttaa gtagcttttt tgctataat

Fig. 1. Séquence d’ADN dans laquelle ISS1 s’est transposée pour donner la souche L. lactis
SMBI77.

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1. Annotez la séquence d’ADN en indiquant le codon d’initiation de la traduction et le codon
stop. Précisez le nombre de codons.
2. Quel est le pourcentage en GC de la séquence ?
3. Indiquez sur la séquence d’ADN la position des sites de restriction EcoRI, HincII, AluI,
RsaI et BamHI.
4. Quelles enzymes de restriction pouvez-vous utiliser pour :
a. Obtenir un fragment d’ADN contenant le gène entier, de façon à ensuite cloner ce
fragment dans un plasmide, au niveau d’un site de restriction SmaI donnant des
extrémités franches ?
b. Créer une délétion interne au gène ?

5. Quelle est la fonction probable de la protéine codée par le gène inactivé de L. lactis
SMBI77 ?
6. A la lumière de ces informations, interprétez les résultats que vous avez obtenus lors de la
première séance de TP.