TP BIOL-F104 ou F105 2021-2022

BASES MOLECULAIRES DU VIVANT (BIOL-F104)

BIOLOGIE GENERALE (BIOL-F105)
TRAVAUX PRATIQUES
BAC1 BIO - IRBI
Titulaires : Véronique Kruys – Cyril Gueydan – Mélanie Boeckstaens
Assistants : Vanessa Yaminne, Roxane Beyns ou Valentin Barberoux,
Pascale Van Vooren ou Valérie Martinelli ou Patricia Tebabi ou Philippe Poelvoorde

INFORMATIONS IMPORTANTES :

Tout au long du TP, annotez correctement vos tubes (numéro binôme, …)

Toujours équilibrez les centrifugeuses

Portez des gants et un tablier de laboratoire

Lisez très attentivement le protocole

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EXTRACTION D’ADN GENOMIQUE A PARTIR DE CELLULES EPITHELIALES ET

AMPLIFICATION PAR PCR DE MARQUEURS POLYMORPHIQUES

A) EXTRACTION D’ADN GENOMIQUE PAR LA METHODE « CHELEX 100 »

1. Principe expérimental
Des cellules sont récupérées par frottement de l’épithélium buccal (intérieur de la joue) et
l’ADN est extrait de ces cellules par la méthode « Chelex 100 ».
Les protéines sont digérées par la protéinase K et les cellules sont lysées par une incubation à
100°C. L’ADN est protégé de la dégradation par rétention des ions métalliques sur la résine
Chelex.
Référence : Walsh et al., Biotechniques (1991) Vol.10 p506

Remarques préliminaires :
Les réactions PCR qui seront réalisées à partir de l’ADNg peuvent être contaminées par de
l’ADN présent dans l’environnement. Il est recommandé de porter des gants pendant toute
la durée de l’expérience, de travailler sur une table propre et avec des pipettes nettoyées à
l’alcool.

2. En pratique :
 Mettre 500 µl d’eau déminéralisée stérile dans 1 tube Eppendorf de 1,5ml annoté avec
vos initiales et numéro de binôme.
 A l’aide d’une pointe de type P1000, frotter vigoureusement la face interne de la joue
 Tremper la pointe dans le tube contenant l’eau afin de recueillir les cellules
Notez qu’un assistant préparera un contrôle négatif d’extraction (sans cellule)
 Centrifuger 3 min à 5000 rpm pour collecter les cellules
 Retirer 470 µl d’eau en prenant soin de ne pas aspirer le culot de cellules
 Ajouter 200 µl d’une suspension de billes Chelex 100 (à 5% dans l’eau). Il est important
de bien agiter la suspension de billes juste avant le prélèvement de manière à
prélever une quantité de billes identique lors de chaque expérience.
 Vortexer 10 sec
 Ajouter 2 µl d’une solution de protéinase K
 Vortexer 10 sec
 Incuber 5 min à 56°C sur la plaque chauffante
 Vortexer 10 sec
 Incuber 8 min à 100°C sur la plaque chauffante
 Vortexer 10 sec
 Centrifuger 3 min à 13000 rpm
 Récupérer 120 µl de surnageant (sans toucher les billes/culot) et le transférer dans un
nouveau tube annoté avec vos initiales et numéro de binôme.
 Conserver l’échantillon d’ADNg sur glace jusqu’à son utilisation dans la réaction PCR
puis à -20°C

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B) MARQUEUR POLYMORPHIQUE TAS2R38 ET DETECTION DU GOUT AMER

(PCR1 + RESTRICTION)

1. Principe expérimental :

Rappel : Un polymorphisme d'un seul nucléotide (SNP, single-nucleotide polymorphism en

anglais) est la variation (polymorphisme) d'une seule paire de bases du génome (ADN) entre
individus d'une même espèce.

Le phénylthiocarbamide, aussi connu sous le nom PTC, est un composé organique amer
fabriqué par de nombreuses plantes, comme le brocoli ou le chou de Bruxelles. Il servirait de
répulsif pour protéger les plantes des herbivores.
Dans les années 30, Arthur Fox, chimiste américain, synthétisait du PTC en laboratoire. En
transférant le composé dans une bouteille, il a généré un nuage de poussière de PTC qui a
suscité une réaction spectaculaire chez son collègue. Contrairement à Fox qui ne perçût rien,
son collègue, C. R. Noller, s'est plaint que la poussière était intensément amère. En effet, il
s’avère que seulement une proportion de la population est capable de détecter le PTC.

Nous savons aujourd’hui que la capacité à goûter le PTC est associée à un polymorphisme dans
le gène TAS2R38 qui code pour un récepteur de goût amer qui se trouve dans des cellules à la
surface de la langue. Le SNP en position 785 du gène correspond à un allèle récessif du
récepteur provoquant une mutation faux-sens (mutation de l’alanine 262 en valine) et
conduisant à un récepteur non fonctionnel et donc à l'incapacité de goûter certains composés
amers, tels que le PTC.
L’allèle dominant appelé T (acide aminé A262 codé par GCT) est donc associé à la capacité à
goûter le PTC, tandis que l’allèle récessif appelé t (acide aminé V262 codé par GTT) est associé
à une incapacité à goûter le PTC. Ce SNP a la particularité d’être situé au niveau d’un site de
restriction reconnu par l’enzyme de restriction Fnu4HI :

Par une expérience de PCR suivie d’une restriction de l’amplicon (PCR-RFLP), vous allez
déterminer quels allèles (TT, tt ou Tt) sont présents dans votre génome (= génotype).
L’amplicon synthétisé sera long de 303 pb. Si l’amplicon a été amplifié à partir de l’allèle T,
celui-ci contiendra le site de restriction Fnu4HI et la digestion de cet amplicon par l’enzyme
de restriction conduira à 2 fragments de 238 et 62 pb. Par contre, le site de restriction
n’apparaissant plus au niveau de l’allèle t, le produit PCR résultant de l’amplification de l’alléle
t ne sera pas restreint.

Mémento :
T= A262 (GCT)  capacité à goûter le PTC
t=V262 (GTT)  incapacité à goûter le PTC

- Amplicon non digéré : 303 pb

- Après digestion :
Si T (allèle dominant): 238 pb + 65 pb
Si t (allèle récessif): 303 pb

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Rappel :
Les cellules prélevées sont diploïdes, c’est-à-dire que les chromosomes sont présents par
paire. Votre génome comporte donc 2 copies du gène TAS2R38. Si celui-ci comporte 2
allèles identiques (TT ou tt), on parlera d’homozygotie pour le gène TAS2R38. Si les 2 allèles
sont différents (Tt), on parlera d’hétérozygotie.

Séquence du gène TAS2R38. Le SNP en position 785 est encadré en bleu. Les positions des
amorces utilisées pour la PCR sont indiquées en vert (Forward) et en rouge (Reverse).

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2. En pratique :

2.1. PCR

Pour une réaction de PCR (50 µl), vous avez besoin de:
- 32,5 µl H2O
- 5 µl Tampon 10x
- 1 µl dNTP 10 mM
- 0,5 µl amorce F 5579 (100µM)
- 0,5 µl amorce R 5580 (100µM)
- 0,5 µl Taq Pol
- 10 µl ADNg

Vous avez à votre disposition un mélange réactionnel contenant le tampon, les dNTPs, les
amorces, la Taq et l’eau (tube Eppendorf rouge). Veillez à conserver ce mélange sur glace.

 Dans le tube PCR rose que vous allez annoter, ajoutez 40 µl de mélange
réactionnel
 Ajouter ensuite 10 µl ADNg
Un contrôle négatif sera réalisé par un assistant : l’ADNg est remplacé par le contrôle
négatif de l’extraction ADN

 Vortexer et éventuellement centrifuger 5 sec.

 Démarrer la machine PCR (rouge) avec le programme suivant :
95°C 3min
95°C 30sec
56°C 30sec 35 cycles
72°C 60sec
72°C 7min
4°C ∞

2.2. Restriction de l’amplicon

 Vortexer brièvement le tube de PCR
 Mettre 13,25 µl de la PCR dans un tube Eppendorf rouge annoté et conserver le
reste de la PCR sur glace
 Ajouter dans l’eppendorf rouge 1,75 µl d’un mélange « Tampon (1,5 µl) + enzyme
de restriction Fnu4HI (0,25 µl) »
 Vortexer brièvement et centrifuger 5 sec
 Incuber le tube à 37°C dans la plaque chauffante pendant 1h
 Puis le garder sur glace en attendant le chargement sur le gel d’agarose

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2.3. Analyse des restrictions par électrophorèse sur gel d’agarose

Des gels d’agarose 3 % ont été coulés par les assistants.

1 gel d’agarose est disponible pour 8 ou 9 étudiants. Veillez à noter sur quel
gel et à quelles positions vos échantillons sont déposés.
L’assistant est là pour vous guider.

 Ajouter 2 µl de bleu de charge à l’échantillon restreint R (environ 15 µl)

 Mettre 13,25 µl de la PCR (=échantillon non restreint NR) dans un nouvel
eppendorf rouge annoté « NR » et ajouter 2 µl de bleu de charge
 Mélanger et centrifuger 5 sec si nécessaire
 Déposer précautionneusement les échantillons non restreint NR et restreint R (15
µl) dans 2 puits consécutifs d’un gel d’agarose 3% suivant le plan de chargement
disponible près de l’assistant
Le contrôle négatif et le marqueur de poids moléculaire ont été chargés sur le gel
par un assistant.
 Quand tous les binômes ont chargé, démarrer (200V) la migration et surveiller la
( environ 20 min)
 Le gel est passé au transilluminateur par un assistant et une image du résultat de
l’électrophorèse vous est remise

2.4. Phénotype associé (détection du PTC)

Afin de tester si vous êtes capable de goûter le PTC, une tigette contenant du PTC vous
est fournie dans un eppendorf.
Déposez une extrémité sur le bout de la langue et notez si vous êtes capable ou non
de percevoir un goût amer.

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C) MARQUEUR POLYMORPHIQUE D1S80 ET VNTR (PCR2)

1. Principe expérimental :

Pour certains loci, les allèles se caractérisent par des différences de taille au niveau de l’ADN
liées à l’existence de séquences répétées présentes en nombre variable. On parle alors de
séquences VNTR (Variable Number of Tandem Repeat).
Ces marqueurs VNTR ont dans la plupart des cas des fonctions inconnues mais peuvent être
utilisés pour donner un profil génétique d’un individu. Par exemple, les VNTR sont utilisés en
forensique lors d'enquêtes criminelles ou lors de tests de paternité (empreintes génétiques).
Le locus D1S80 est un VNTR situé sur le chromosome 1. Ce VNTR possède un motif de 16 pb
répété de 16 à 40 fois suivant les individus (25 allèles différents). Il existe donc 625 génotypes
possibles (25 x 25, car 2 copies de chromosomes).

2. En pratique :

2.1. PCR

Pour une réaction de PCR (50 µl), vous avez besoin de:
- 32,5 µl H2O
- 5 µl Tampon 10x
- 1 µl dNTP 10 mM
- 0,5 µl amorce F 2033(100µM)
- 0,5 µl amorce R 2034 (100µM)
- 0,5 µl Taq Pol
- 10 µl ADNg
Vous avez à votre disposition un mélange réactionnel contenant le tampon, les dNTPs, les
amorces, la Taq et l’eau (tube Eppendorf vert ou bleu). Veillez à conserver ce mélange sur
glace.

 Dans le tube PCR vert ou bleu que vous allez annoter, ajoutez 40 µl de mélange
réactionnel
 Ajouter ensuite 10 µl ADNg
Un contrôle négatif sera réalisé par un assistant : l’ADNg est remplacé par le contrôle
négatif de l’extraction ADN

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 Vortexer et éventuellement centrifuger 5 sec.

 Démarrer la machine PCR (Bloc Brachet) avec le programme suivant :
95°C 3 min
95°C 30 sec
66°C 30 sec 35 cycles
72°C 60 sec
72°C 10 min
4°C ∞

2.2. Analyse des amplifications par électrophorèse sur gel d’agarose

Des gels d’agarose 1,2 % ont été coulés par les assistants.
1 gel d’agarose est disponible pour 15-18 étudiants. Veillez à noter sur quel gel
et à quelle position votre échantillon est déposé.
L’assistant est là pour vous guider.

 Ajouter 5 µl de bleu de charge au tube PCR D1S80

 Mélanger et centrifuger 5 sec si nécessaire
 Déposer 15 µl du mélange sur un gel d’agarose à 1,2 % suivant le plan de
chargement disponible près de l’assistant
Le contrôle négatif de la PCR et le marqueur de poids moléculaire ont été chargés
sur le gel par un assistant
 Quand tous les binômes ont chargé, démarrer (200V) et surveiller la migration
(20 min maximum)
 Le gel est passé au transilluminateur par un assistant et une image du résultat de
l’électrophorèse vous est remise

2.3. Calcul du nombre de répétitions de 16 pb aux loci D1S80

 Déterminer la taille approximative des fragments amplifiés
 Déterminer ensuite le nombre de répétitions de 16 pb à chaque locus D1S80
sachant que :

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ANNEXE :

Liste des amorces utilisées lors des PCR :

PTC:
F-PTC (HTO 5579): AACTGGCAGAATAAAGATCTCAATTTAT
R-PTC (HTO 5580): AACACAAACCATCACCCCTATTTT

D1S80:
F-D1S80 (2033): GAAACTGGCCTCCAAAACACTGCCCGCCG
R-D1S80 (2034): GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC

PLANNING :
J1
1. Prise en main des micropipettes (test avec de l’eau et un Bécher)
2. Extraction ADN génomique (A.2)
3. Lancer PCR PTC (TAS2R38- goût amer) (B.2.1)
4. Lancer PCR D1S80 (C.2.1)
Pendant les temps d’attente :
- Test du PTC avec la tigette (B.2.4)
- Entrainement à charger un gel (petite salle TP)
- Compléter la première partie du rapport (à rendre le jour même)
J2
1. Lancer restriction PCR PTC (B.2.2)
2. Charger PCR D1S80 (C.2.2)
3. Révélation Gel PCR D1S80 par l’assistant et analyse du gel
4. Charger PCR PTC (restreint et non restreint) (B.2.3)
5. Révélation PCR PTC par l’assistant et analyse du gel
Pendant les temps d’attente :
- Compléter la deuxième partie du rapport (à rendre le jour même)