Expression de protéines végétales

en système hétérologue
En système hétérologue, les cassettes d’expression qui codent les protéines d’intérêt
sont le plus souvent portées par des vecteurs d’expression plasmidiques.
Afin d’accéder à ce type d’outil biologique (les plasmides), les acteurs de la
Recherche scientifique font appel à des dons de collègues, ou s’approvisionnent
auprès des fournisseurs commerciaux.
À ce titre, notre laboratoire a récemment reçu un nouveau vecteur d’expression
plasmidique, sous 2 formats. Le premier format correspond à une boîte de Pétri qui
contient un milieu de culture, avec des clones bactériens distincts à sa surface.
Le second format est une solution de plasmide, préparée à partir d’un des clones
présents sur cette même gélose.

Après avoir vérifié l’intégrité de la construction génique, nous vérifierons si le

plasmide se révèle efficace pour la production de protéines d’intérêt recombinantes
(d’origine végétale), dans un système hétérologue de type bactérien.
Finalement, la protéine recombinante sera comparée à la protéine native
(issue de la plante), afin d’évaluer la qualité des plasmides vecteurs d’expression et
l’authenticité de la protéine recombinante. La réussite de l’expression hétérologue de
la protéine d’intérêt, Rubisco-SSU, sera ainsi évaluée.

Opérations mises en route (classement chronologique)

(1) Identification de clones bactériens transformés par PCR
Chaque colonie bactérienne (aussi appelée « clone bactérien ») isolée, obtenue après
transformation bactérienne suivie d’une culture sur milieu sélectif, correspond
théoriquement à une bactérie ayant intégré une molécule du vecteur d’expression,
s’étant divisée 108 fois. Avant de continuer les manipulations, il est important de
vérifier (a) la présence du vecteur d’expression inductible dans les bactéries,
et (b) l’intégrité de la région ADN qui code la protéine d’intérêt.
Dans ce but, une réaction PCR est effectuée directement sur deux clones bactériens
choisis. Pour chaque binôme :

Identifier 2 microtubes de 0,3 mL (note : aussi appelés tubes PCR).

Déposer 40 µL d’eau ultrapure (UP) stérile dans chaque tube.
Prélever un clone, sans entraîner d’agarose, avec une anse.
Introduire la pointe dans un microtube et homogénéiser quelques secondes en
frottant l’anse contre le tube, avec des mouvements rotatoires, pour resuspendre les
cellules bactériennes. Vortexer 1 min.

Prélever 5 µL de suspension bactérienne et introduire ce volume dans un microtube

de 0,3 mL pour PCR. Conserver les 35 µL restants pour une éventuelle remise en

1
culture ultérieure. Répéter l’opération avec un second clone. Dans un 3ème tube,
introduire 5 µL d’eau ultrapure (contrôle négatif).
Ajouter dans chaque tube 9 µL de Master Mix 2X (contenant le tampon, les
oligonucléotides, l’ADN polymérase thermorésistante et le réactif alourdissant pour le
dépôt dans un puits du gel d’agarose).
Ajouter 4 µL de mélange d’amorces (déjà prêt : 2 µL d’amorce sens [Rbcs_E3fwd :
GTGGCCTCCGATTGGAAAGA] + 2 µL d’amorce anti-sens [Rbcs_E3rev :
ACTTGACGGGTGTTGTCGAA] ; Taille attendue de l’amplicon 321 pb.
Placer les tubes dans le thermocycleur et démarrer le cycle de PCR comme indiqué
dans le tableau ci-après. À la fin de la réaction PCR, les produits d’amplification
seront séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % (TAE 1X), et visualisés à
l’aide d’un appareillage spécifique (plaque à rayons ultra-violets avec caméra).
Pendant la réaction de PCR, transférer les 35 µL de suspension bactérienne restants
dans un microtube de 1,5 mL contenant 1 mL de milieu LB + ATB (carbénicilline,
100 µg/mL). Incuber 16 h, à 37 °C, sous agitation 225 tours par minute (tpm).

Étape 95 °C, 20 min (lyse thermique des bactéries)

1 95 °C, 45 sec
2 56.4 °C, 45 sec
3 72 °C, 30 sec, 34 cycles depuis l’étape 2 (soit 35 cycles au total)
4 72 °C, 5 min
5 15 °C, incubation
Programme LLTPBR2

(2) Transformation de bactéries compétentes, culture et

sélection des transformants
Il s’agit d’introduire un vecteur d’expression plasmidique dans des bactéries
compétentes (Escherichia coli, souche BL21), par choc thermique. Les bactéries
compétentes, conservées à -80 °C, sont décongelées extemporanément et
rapidement, avant d’être conservées sur glace.
Dans 100 µL de bactéries décongelées (microtube de 1,5 mL), ajouter 4 µL de
plasmide (soit environ 100 ng) et homogénéiser en tapotant le tube.
Transférer immédiatement sur glace, et incuber 20 min. Dans le même temps,
préchauffer du milieu LB sans antibiotique à 37 °C.
Incuber à 42°C, pendant 30 sec exactement, au bain-marie.
Transférer immédiatement sur glace, et incuber 2 min exactement.
Ajouter 900 µL de milieu LB liquide préchauffé (37°C) sans antibiotique.
Incuber à 37°C, pendant 40 min, sous agitation.
Étaler 60 µL et 120 µL de suspension bactérienne, en quadrant, sur 2 boîtes de Petri
contenant du LB solide additionné de carbénicilline (100 µg/mL). Identifier les boîtes
de Petri sur le fond et non sur le couvercle (évite les inversions).
Incuber pendant 16 h, à 37°C.

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(3) Préparation d’une gamme étalon pour le dosage des
protéines par la méthode de Bradford
La méthode de Bradford est un dosage colorimétrique, basé sur le changement
d'absorbance (à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de
Coomassie après complexation avec les acides aminés aromatiques (tryptophane,
tyrosine et phénylalanine), et les résidus basiques présents dans la ou les protéines.
Cette méthode permet un dosage simple, rapide, et précis des quantités de protéines
en solution.

Des tubes qui contiennent des solutions de BSA (Bovine Serum Albumin)
à différentes concentrations sont fournis par l’enseignant. À partir de ces solutions de
BSA, 6 points d’étalonnage (+ 1 contrôle négatif, appelé « 1 ») devront être préparés
de manière à obtenir des concentrations comprises entre 0 et 20 µg/mL de BSA,
dans un volume de 800 µL. Compléter le tableau suivant :

Identification 0 (eau) 1 1 3 4 5 6
Etalon BSA (µg/mL) 0 10 20 40 60 80 100
Q finale voulue (µg) 0 2 4 8 12 16 20
VBSA à prélever (µL)
V H2O (qsp 800 µL)
Bradford 5X (µL) 200 200 200 200 200 200 200

Pour chaque binôme, préparer 7 cuves de spectrophotométrie.

Ajouter les volumes d’eau et de BSA adéquats (faire les calculs).
Ajouter 200 µL de réactif de Bradford 5X dans chaque cuve.
Homogénéiser les solutions par pipetage, en commençant par la dilution la plus
importante (donc du moins concentré, vers le plus concentré en BSA).
Laisser incuber 10 min, à température ambiante. Conformément au protocole
« historique » de Bradford, il est inutile de placer les échantillons à l’obscurité.
Homogénéiser à nouveau les cuves par pipetage, et lire l’absorbance à 595 nm.
Avec les valeurs d’absorbance obtenues, tracer la courbe étalon et déterminer la
concentration en protéines des échantillons (suivre les consignes de l’enseignant).

(4) Extraction de protéines solubles

(4.1) Extraction de protéines de bactéries transformées
Des clones bactériens contrôlés positifs pour la présence du vecteur d’expression ont
été cultivés à 37°C jusqu’à l’obtention d’une turbidité de 0,5 (à 600-620 nm).
Certaines cultures ont été induites à l’IPTG (1 mM final) et cultivées 4 h
supplémentaires. Le culot bactérien qui vous est fourni correspond à 10 mL de
culture bactérienne induite ou non induite à l’IPTG. Pour extraire les protéines
solubles, suivez les instructions ci-après.
Sur le culot bactérien, ajouter 1 mL de tampon de lyse (LBA), puis effectuer trois
séries de chocs thermiques (azote liquide). Port de lunettes de sécurité obligatoire.
Respecter les affichages.
Vortexer 1 min, puis faire une sonication sous sorbonne (cycle 40%, puissance à
80%, compter 60 pulsations ; 30 secondes).
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Centrifuger à 15000 tpm, 20 min, à 4°C. Synchroniser les temps de
centrifugation avec les extractions faites sur les feuilles de Vigna.
Transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau microtube de 1,5mL.
Centrifuger de nouveau, 10 min, pour faire une double clarification. Finalement,
prélever le surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 mL, à conserver sur glace.

(4.2) Extraction de protéines à partir de feuilles de plants de Vigna en

sécheresse ou correctement arrosés
Préalablement, des feuilles de plants de Vigna en sécheresse ou correctement
arrosés ont été broyées, dans l’azote liquide. La poudre a été aliquotée, à raison de
200 mg par tube. Les échantillons sont conservés à -80°C, puis distribués
extemporanément pour éviter la dégradation de ces derniers.
Dès la sortie du congélateur, déposer les tubes sur glace, et ajouter dès que possible
1 mL de tampon de lyse (LP). Pensez à homogénéiser convenablement le PVPP juste
avant de prélever le tampon de lyse.
Vortexer, 1 min, pour dilacérer les quelques agrégats résiduels.
Centrifuger à 15000 tpm, 20 min, à 4°C. Synchroniser les temps de
centrifugation avec les extractions faites sur les bactéries. Idem pour la
seconde centrifugation.
Transférer soigneusement le surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
Centrifuger de nouveau, 10 min, pour faire une double clarification. Finalement,
prélever le surnageant dans un nouveau microtube de 1,5 mL, à conserver sur glace.
Ce surnageant constitue l’extrait protéique soluble total.

(5) Dosages des protéines solubles par méthode de Bradford

En reprenant le protocole décrit à l’étape 3 (ainsi que la courbe étalon obtenue),
doser les protéines de l’extrait bactérien et de l’extrait de feuilles (2 cuves / extrait).

Attention : les extraits doivent subir des dilutions avant le dosage.

Le moment venu, suivre attentivement les instructions de l’encadrant.

(6) Séparation des protéines par électrophorèse

(6.1) Préparation du gel
Dans notre cas, la teneur en acrylamide du gel de séparation est de 12 % (m/v). La
teneur en acrylamide du gel de concentration est de 4 % (m/v). Le tampon
d’électrophorèse est composé comme suit : Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1%,
pH 8,3.
Dans la présente manipulation, nous allons préparer extemporanément des gels dits
« stain free » (note : il existe également des gels prêts à l’emploi, disponibles dans le
commerce). Les réactifs sont pré-mélangés, ce qui facilite la mise en œuvre de la
méthode et sa reproductibilité. À titre indicatif, la méthode « historique » consistait à
mélanger un certain nombre de réactifs préparés séparément.

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(6.2) Préparation des extraits protéiques totaux :
Les puits du gel peuvent contenir au maximum 45 µL. Selon la concentration en
protéines de vos échantillons, les volumes déposés seront ajustés afin de déposer
25 µg / puits. Suivez les instructions ci-après.

Prélever un volume d’extrait protéique total contenant 25 µg de protéines.

Mettre ce volume dans un microtube de 0,2 mL.
Compléter à 25 µL avec le tampon d’extraction adéquat (LBA pour les extraits
bactériens, et LP sans PVPP (LPnoPVPP) pour les extraits de plantes).
Ajouter 8,5 µL de tampon de charge (préparé 4 fois concentré).
Chauffer à 95°C pendant 5 min dans un appareil à PCR (fonction incubation).

(6.3) Dépôts des échantillons :

Chaque binôme fera un dépôt de protéines totales bactériennes. Devront également
être déposés, un marqueur de poids moléculaire et un échantillon de la protéine
d’intérêt préalablement purifiée.
Les gels disposant de 15 puits, les derniers puits seront utilisés pour déposer des
extraits de protéines foliaires issus d’une plante de niébé cultivée correctement
arrosée ou en condition de sécheresse.
Après assemblage des gels dans l’appareil à électrophorèse, la migration sera
conduite à 25 mA constants, pendant 1 h 30 environ, à température ambiante.
Attention : il faut impérativement arrêter la migration lorsque le front de
migration est à 3 cm du bord inférieur du gel, sous peine de perdre la
protéine d’intérêt.
Il existe différents moyens de visualiser les protéines séparées sur gel. Une méthode
très répandue est la coloration au bleu de Coomassie. Cette méthode présente
l’inconvénient de ne pas permettre l’utilisation du gel coloré pour la réalisation du
Western-blot. Précédemment, l’utilisation d’un deuxième gel s’avérait indispensable.
Les gels dits « Stain Free », utilisés dans notre cas, présentent l’avantage de
permettre une visualisation des protéines, sans coloration préalable. Un composé
présent dans le gel va réagir avec les tryptophanes des protéines, rendant ainsi
visible ces dernières. Les protéines présentent sur le gel sont ensuite transférées sur
membrane, sur laquelle elles peuvent également être visualisées, permettant ainsi de
s’assurer de la bonne qualité du transfert (absence de bulles, etc.).

(7) Transfert sur membrane (Western-blot, début…)

vvv

Les protéines du gel sont transférées sur membrane de nitrocellulose.

Le transfert sera réalisé par un des intervenants à l’aide d’un appareil (Transblot
Turbo), qui permet un transfert des protéines en quelques minutes dans des
conditions calibrées, reproductibles. Paramètres pour 1 mini gel / cassette de
transfert (programme : 1,5 mm any kDa) : 1,3 A constant, 7 min, 25 V maximum.

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 (8) Révélation de la réaction antigène/anticorps
(Western-blot, …suite et fin)

Étapes Détails
Après transfert, faire 2 lavages rapides de la membrane (2 x 20 sec) à l'eau distillée, puis
Blocage incuber 3 h en TTBS (Tween 20 added Tris Buffered Saline) 1X, 0,2% Tween 20,
5% lait écrémé (m/v). La saturation doit être extemporanée.
Après saturation, faire 1 lavage rapide de la membrane en TTBS 1X, 0,05% Tween 20,
puis incuber la membrane sur la nuit dans la solution d'anticorps primaire formulée
Anticorps primaire
comme suit : anticorps SSU de lapin dilué au 1/5000,
en TTBS 1X, 0,05% Tween 20, 1% BSA (m/v)
2 lavages rapides (2 x 20 sec) en TTBS 1X, 0,2% Tween 20,
Lavage du primaire
puis 4 lavages de 5 min en TTBS 1X, 0,2% Tween 20
Faire 1 lavage rapide de la membrane en TTBS 1X, 0,05% Tween 20, puis incuber la
membrane 1 h dans la solution d'anticorps secondaire formulée comme suit : anticorps
Anticorps secondaire
anti-lapin développé chez rat couplé HRP dilué au 1/5000, en TTBS 1X, 0,05%
Tween 20, 5% lait (m/v)
2 lavages rapides (2 x 20 sec) en TTBS 1X, 0,2% Tween 20,
Lavage du secondaire
puis 4 lavages de 5 min en TTBS 1X, 0,2% Tween 20
Révélation Révéler la membrane selon les consignes de l'intervenant (Clarity ECL, 1 min).

(9) Purification et analyse de la protéine d’intérêt par

chromatographie d’affinité (IMAC)
La protéine d’intérêt sera purifiée sur résine Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid), à
partir de l’extrait de protéines totales. Suivez les instructions ci-après. À la fin,
plusieurs profils protéiques seront comparés, il est donc essentiel de conserver une
partie du volume, à chaque étape (lysat avant passage sur billes, lysat après passage
sur billes, premier et dernier lavages, élution). Ici nous limiterons ses prélèvements.

Equilibrer 120 µL de résine Ni-NTA (1 aliquot), avec 1 mL de tampon de lyse (LBA)

pendant 5 min, sur roue. Centrifuger à 2000 tpm, 1 min, pour culotter les billes.
Eliminer le tampon de lyse par retournement. Recommencer une fois cette étape.
Ajouter 1 mL de lysat protéique bactérien clarifié sur le culot de billes lavées, agiter
sur la roue, 45 min, à 4°C. Centrifuger à 2000 tpm, 1 min, puis prélever le
surnageant (filtrat), le conserver dans un microtube neuf de 1,5 mL.
Ajouter 1 mL de tampon de lavage (Ni-L) sur le culot de résine. Incuber sur la roue,
5 min, à 4°C. Centrifuger à 2000 tpm, 1 min, puis jeter le surnageant par
retournement du tube.
Répéter l’opération de lavage 4 fois (5 lavages au total). Lors du dernier lavage, bien
égoutter le volume résiduel sur le bord du tube, contre du papier absorbant.
Ajouter 120 µL de tampon d’élution (Ni-E) sur le culot de résine. Laisser le tube sur
glace, 10 min, à 4°C (faire une homogénéisation en tapotant très doucement le tube,
toutes les 2 min). Centrifuger à 2000 tpm, pendant 1 min.
Récupérer le surnageant (éluât) dans un nouveau microtube de 1,5 mL.
Vérifier la présence de la protéine purifiée par SDS-PAGE (25 µL d’éluât+8.5µL TP
4X). Pour l’ordre de dépôt et la préparation de vos échantillons, suivez les indications
de l’intervenant. La visualisation de la protéine se fera de la même façon que
précédemment.
6
 Annexe
Milieu de culture des bactéries

Milieu LB liquide Milieu LB solide

Bacto-trypone 10 g Bacto-trypone 10 g
Yeast extract 5g Yeast extract 5g
NaCl 5g NaCl 5g
Ajuster à pH 7 à la soude Agar 20 g
H2O qsp 1 L Ajuster à pH 7 à la soude

Autoclaver à 121 °C, 30 min H2O qsp 1 L

Pour rendre le milieu sélectif, Autoclaver à 121 °C, 30 min

ajouter la carbénicilline Pour rendre le milieu sélectif,
(pour 1 L, 1 mL à 100 mg/mL) ajouter de la carbénicilline
(pour 1 L, 1 mL à 100 mg/mL)

Extraction des protéines bactériennes (LBA)

NaH2PO4 50 mM
NaCl 300 mM
Triton X100 0,05% (v/v)
Imidazole 10 mM
Ajuster à pH 8

Extraction des protéines végétales (LP)

Tris-HCl 100 mM
NaCl 150 mM
EDTA 10 mM
Triton X100 0,05% (v/v)
Ajuster à pH 7,5, puis ajouter :
PVPP 1% (m/v)

7
Purification des protéines recombinantes

Tampon du lavage (Ni-L)

NaH2PO4 50 mM
NaCl 300 mM
Imidazole 25 mM
Ajuster à pH 8

Tampon d’élution (Ni-E)

NaH2PO4 50 mM
NaCl 300 mM
Triton X100 0,05%
Imidazole 250 mM
Ajuster à pH 8

SDS-PAGE

Tampon de migration
TGS 10X 100 mL
SDS 20% 5 mL
H2O qsp 1 L

Western-blot

Tampon de transfert
Tranblot 5 X 200 mL
Ethanol absolu 200 mL
H2O qsp 1 L

Révélation

TBS 10X
dans 4500 mL d'eau, ajouter
Tris base 121 g
NaCl 400 g
Ajuster à pH 7,6
H2O qsp 5 L

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 TTBS 1X - Tween 0,2%, lavage
TBS 10X 100 mL
H2O qsp 1L
Homogénéiser
Tween 20 2 mL

TTBS 1X - Tween 0,05%,

solvant des anticorps
TBS 10X 100 mL
H2O qsp 1 L
Homogénéiser
Tween 20 0,5 mL
Prendre aliquot et ajouter 5% de lait ou 1% BSA pour l’AC primaire

Coloration au Coomassie
(donné à titre indicatif, remplacé par le « stain free »)

Tampon de coloration (50 mL)

Éthanol pur 30% (v/v) 150 mL
Acide acétique glacial (pur) 7% (v/v) 35 mL
Bleu de Coomassie 0,25% (m/v) 1,25 g
Homogénéiser jusqu'à dissolution du pigment.
Filtrer la solution.
H2O qsp 500 mL

Tampon de décoloration (500 mL)

Éthanol pur 30% (v/v) 150 mL
Acide acétique glacial 7% (v/v) 35 mL
H2O qsp 500 mL

Tampon de charge 4X (TC4X)

Tampon de coloration (500 mL)

Tris1.25M pH6.8 11.1 mL
SDS20% (m/v) 11 mL
Glycérol pur 0,25% (m/v) 22.2 mL
Bleu de bromophénol 10mg
H2O qsp 50 mL

Homogéneiser et aliquoter par 900 µL et stockage à -20°C

Avant utilisation, ajouter 100 µL de DTT 1M (Roth 6908.1) dans 900µL de
TC4X. Conservation 24h à 4°C