1.

Méthodes

2.1. Activité larvicide

2.1.1. Préparation des extraits aqueux de racines

Les racines de chacune des deux espèces sont préalablement lavées à l’eau de robinet,
puis séchées pendant 24 heures. Ces racines sont ensuite broyées à l’aide d’un mortier jusqu’à
l’obtention d’une poudre. Une quantité de 25 g de cette poudre est diluée dans 250 ml d’eau
distillée préalablement portée à l’ébullition, puis laissée refroidir sous agitation magnétique
pendant 30 minutes. Le mélange obtenu est filtré à l’aide d’un papier Whatman. Le filtrat
récupéré représente une solution stock initiale à 25 g par 250 ml, soit une concentration égale
à 10 %.

2.1.2. Préparation des extraits aqueux des feuilles

Les feuilles de chacune des deux espèces préalablement séchées à l’air libre sont broyées à
l’aide d’un mortier jusqu’à l’obtention d’une poudre. Une quantité de 25 g de cette poudre est
diluée dans 250 ml d’eau distillée préalablement portée à l’ébullition, puis laissée refroidir
sous agitation magnétique pendant 30 minutes. Le mélange obtenu est filtré à l’aide d’un
papier Whatman. Le filtrat récupéré représente une solution stock initiale à 25 g par 250 ml,
soit une concentration égale à 10 %.

2.1.3. Tests de toxicité

A partir de l’extrait initial (solution stock 25g/250 ml ou 10%) des racines et des feuilles de
chacune des deux espèces et de l’eau de gite larvaire, des concentrations de 5%, 2%, et 1%
ont été préparées.

Les tests sont réalisés dans des boites de pétri contenant chacune 10 ml de solution et 5 larves
de même espèce et de même calibre (stade 4). Le même nombre de larves est placé dans une
boite de pétri témoin contenant 10 ml d’eau de gite larvaire. Trois répétitions sont effectuées
pour chaque concentration ainsi que pour le témoin.

Le nombre des individus morts est calculé pour chaque concentration et pour chaque
répétition après 1 heures, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 12 heures et 24 heures d’exposition
des larves. Les concentrations létales CL50 sont déterminées, après 24 heures d’exposition.
 2.2. Extraction et teneur des composés phénoliques

La détermination des composés phénoliques : polyphénols totaux (PPT), flavonoïdes

totaux (FV) et tannins condensés (TC) présents au niveau des différentes parties des plantes

étudiées a été réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible de type Cary 50.

 Réactifs chimiques

Une série de produits chimiques ont été utilisés pour doser les composés phénoliques

des différents extraits des plantes. Le réactif de Folin-Ciocalteu est fourni par VWR

international (France), l’acide gallique, la catéchine, le nitrite de sodium (NaNO 2) et la

vanilline sont fournis par Sigma-Aldrich Chimie (France), le carbonate de sodium (Na 2CO3),

le trichlorure d’aluminium (AlCl3) et l’hydroxyde de sodium (NaOH).

 Extraction

Le matériel végétal récolté est séché à l’ombre, à une température de 25° C. D’autre
part la coupe fine du matériel (feuilles et racines) et son broyage sont réalisés à l’aide d’un
broyeur pour l’obtention d’une poudre. On pèse 2 g de la poudre, on les mélange avec 20 ml
d’éthanol (80%), on filtre sur un entonnoir recouvert de gaze puis on centrifuge le filtrat à
2000 xg pendant 15 minutes et enfin on récupère les extraits (surnageant) obtenues.

2.2.1 Teneur des polyphénols totaux

Le dosage des polyphénols totaux dans les extraits des feuilles et des racines des deux
espèces étudiées est effectué selon la méthode de Folin-ciocalteu (Biozot et Charpentier,
2006). Le réactif utilisé est constitué d’un mélange d’acide phosphotungstique (H₃PW₁₂O₄₀)
et de l’acide phosphomolybdique (H₃PMo₁₂O₄) de couleur jaune. Le principe de cette
méthode est basé sur l’oxydation des composés phénoliques par ce réactif, qui entraine la
formation d’un nouveau complexe d’oxydes métalliques de tungstène et de molybdène de
couleur bleu. L’intensité de la coloration, dont l’absorption maximum est comprise entre 725
et 750 nm, est proportionnelle à la quantité des polyphénols présents dans les extraits
végétaux (Ribéreau-Gayon, 1968). En effet, 100 µl d’extraits ont été versés dans un tube à
essai contenant 6 ml d’eau distillé, et 500 µl de réactif phénolique de Folin-ciocalteu a été
ajouté au mélange et secoué. Après 5 minutes, 100 ml de solution de Na₂CO₃ (7%) ont été
ajouté au mélange. Puis on mélange et on place les tubes à température ambiante pendant 60
minutes. L’absorbance est ensuite lue à 750 mm par un spectrophotomètre UV/visible. Les
analyses quantitatives des phénols totaux, ont été déterminées à partir de l’équation de la
régression linéaire de la courbe d’étalonnage, tracée en utilisant l'acide gallique comme
standard (Figure 4). Les valeurs obtenues sont exprimés en mg équivalent d’acide gallique par
gramme de matière sèche EAG/g MS.

Figure 1 : Droite d’étalonnage de l’acide gallique

2.2.2 Teneur des Flavonoïdes totaux

Pour le dosage des flavonoïdes totaux, la méthode utilisée est celle développée par

Zhishen et ses collègues (1999) avec quelques modifications.

La méthode consiste à placer dans des tubes à essais et d’une manière successive, 250

µl de l’extrait étudié et 1 ml d’eau distillée. A un temps initial (0 minute) on ajoute 75 µl

d’une solution de NaNO2 (5%), après 5 minutes 75 µl de AlCl3 (10%) sont ajoutés. 6 minutes
après 500 µl de NaOH (1N) sont ajoutés ainsi que 2,5 ml d’eau distillée. L’absorbance de

chaque mélange obtenu est directement mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 510 nm.

Les taux des flavonoïdes des extraits ont été calculés à partir de la courbe d’étalonnage, tracée

en utilisant la Catéchine comme standard (Figure 5). Les résultats obtenus sont exprimés en

mg équivalent de la catéchine par gramme de matière sèche (EC/g MS).

Figure 2 : Droite d’étalonnage de la Catéchine

2.2.3 Teneur des Tannins condensés

Pour doser les tannins condensés, la méthode de la vanilline a été utilisée (Scalbert,
1992, Sun et al., 1998, Schofield et al., 2001). Au cours de cette réaction, la vanilline va
réagir avec les tannins condensés pour donner des complexes colorés qui absorbent à 500 nm.

Pour cela, 5 g de matière sèche de chaque échantillon a été lixivié dans le n-hexane, le
résidu obtenu est séché à température ambiante. Ensuite, un mélange formé de 0,5 g de résidu
avec 15 ml d’une solution de méthanol-HCL (1 %) est préparé. Le mélange obtenu est placé
dans un tube à essai, vortexé puis placé dans un bain marie à 35 C° pendant 20 minutes. Après
incubation le tube est centrifugé à 1532 x g puis et le surnageant est récupéré. 1 ml du
surnageant est mélangé avec 3 ml d’une solution de la catéchine. Cette dernière est formée de
4 g de catéchine et 100 ml de méthanol-HCL (8%). Toutes les solutions ainsi que les blancs
sont préparés dans les mêmes conditions. Les tubes obtenus sont de nouveau incubés à 35°C
pendant 20 minutes. Après cette deuxième incubation l’absorbance de chaque solution
obtenue est directement mesurée au spectrophotomètre UV-visible à 500 nm. Le dosage des
quantités de TC et réalisé à partir d’une courbe d’étalonnage de l’absorbance en fonction de la
concentration en catéchine. La courbe d’étalonnage présente un coefficient de corrélation de
0,995. Les taux des TC des extraits en utilisant la Catéchine comme standard (Figure 6). Les
résultats obtenus sont exprimés en mg équivalent de la catéchine par gramme de matière
sèche (EC/g MS).

Figure 3 : Droite d’étalonnage de la catéchine pour le dosage des tannins condensés

2.2.1.

2.3. Analyse statistique

Les résultats obtenus ont été analysés statistiquement en utilisant le programme

X.L.STAT. Les résultats obtenus, concernant l'activité larvicide, ont été traité à l'aide d'une

analyse de la variance (ANOVA) à deux facteurs contrôlés qui sont l'origine du matériel

végétal et la concentration des extraits aqueux.