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Manuel suisse des denres alimentaires

Chapitre 56

Microbiologie
Membres de la sous-commission 21

W. ETTEL (Prsident), Chimiste cantonal, Steinhausen ZG Dr. A. BAUMGARTNER, Office fdral de la sant publique, Liebefeld-Berne Dr. H.P. BHLER, Laboratoire cantonal, Berne Dr. J.L. CORDIER, Centre de recherche Nestec SA, Lausanne J.M. DUCOMMUN, Laboratoire cantonal, Neuchtel M. GRAND, Office fdral de la sant publique, Liebefeld-Berne Dr. T. JEMMI, Office fdral vtrinaire, Liebefeld-Bern Dr. M. JERMINI, Laboratoire cantonal, Lugano TI Dr. G. SCHNELL, Qualis Laboratorien, Rubigen Dr. H. SPILLMANN, Institut des sciences alimentaires, ETH-Zentrum, Zrich Dr. J. VETTERLI, Laboratoire cantonal, Frauenfeld TG

Nouvelle publication 2000 Rvision partielle 2004

MSDA 2000

56 Microbiologie

Sommaire

Microbiologie
Sommaire
A. B. C. D. E. E.1 E.2 E.3 E.4 E.5 E.6 E.7 E.8 E.9 E.10 E.20 E.21 E.22 Introduction Directives pour l'chantillonnage et la prparation de lchantillon pour essai Evaluation des dnombrements Expression des rsultats Mthodes de recherche et de dnombrement Dnombrement des germes arobies msophiles Dnombrement des Enterobacteriaceae Dnombrement dEscherichia coli Dnombrement de Pseudomonas aeruginosa Recherche dEnterococcus spp. Dnombrement des staphylocoques coagulase positive Dnombrement de Clostridium perfringens Dnombrement de Bacillus cereus Dnombrement de Listeria monocytogenes Dnombrement des levures Recherche de Salmonella spp. Recherche de Listeria monocytogenes Recherche des Campylobacter spp. thermotolrants

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A. Introduction

A.

Introduction
Conformment l'Ordonnance sur l'hygine du 26 juin 1995, les contrles portant sur le respect des valeurs maximales pour les micro-organismes doivent tre effectus avec les mthodes de recherche et de dnombrement du Manuel Suisse des Denres Alimentaires (MSDA). Cette obligation accorde une valeur de rfrence aux mthodes dcrites dans le chapitre Microbiologie. Il faut plutt donner au terme de rfrence, des notions telles que ayant fait ses preuves prouv, indubitable, reconnu sur le plan international, exact, conventionnel etc. Il en rsulte la ncessit pour les mthodes de rfrence du MSDA d'tre bien acceptes et compatibles au niveau international. Les mthodes des organisations internationales doivent donc tre tudies en premier lieu en vue de leur adoption comme rfrence. De ce fait, les mthodes de rfrence ne peuvent pas tre reprsentatives de l'tat des connaissances analytiques les plus rcentes. Le chapitre microbiologie a t dit dans sa dernire version en 1985 et rvis partiellement en 1988. Une rvision totale a t dcide en 1994, sur la base des proccupations suivantes: choisir la structure du chapitre et llaboration des diffrents lments, de telle sorte que leur mise jour soit la plus facile possible; adapter le contenu formel au niveau des personnes qui ont reu une formation spcifique de bonne qualit, et donc renoncer aux lments suivants Rgles de base des mthodes de travail microbiologique Indications sur lassurance qualit Aspects pidmiologiques Prcisions sur les micro-organismes Instructions sur les examens spcifiques du produit; nadmettre dans cette compilation que les mthodes ncessaires au contrle du respect des valeurs maximales lgales tablies; prsenter sparment les mthodes dchantillonnage et de prparation de lchantillon, les mthodes dvaluation des dnombrements et les mthodes dexpression des rsultats; rdiger chaque mthode de recherche et de dnombrement comme une instruction complte en soi, selon une trame identique. La prsente collection de mthodes se fonde en outre sur les principes suivants: les mthodes de rfrence portent uniquement sur la marche suivre et sur l'valuation des essais. Chaque mthode de rfrence se rapporte une publication principale (en rgle gnrale une norme internationale) et aux travaux qui ont conduit d'ventuelles modifications de cette mthode.

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A. Introduction

la dfinition des germes recherchs est tablie uniquement l'aide des critres qui sont examiner et valuer selon la mthode de rfrence. le cas chant, toute modification d'ordre technique ainsi que toute adaptation individuelle, toute simplification relve de l'apprciation de l'utilisateur et doit tre entreprise dans le respect du principe de l'assurance-qualit. pour une catgorie d'aliments, les questions ayant trait l'chantillonnage et aux buts de l'analyse sont traites dans les chapitres spcifiques du MSDA.

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B. Directives pour l'chantillonnage

B.

Directives pour l'chantillonnage et la prparation de lchantillon pour essai


Objectifs Le prsent document tablit les exigences auxquelles doit satisfaire l'chantillonnage (1) destin lexamen microbiologique et dcrit la mthode de prparation de lchantillon pour essai. Il sert de rfrence dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Dfinitions Echantillon: denre alimentaire ou objet usuel prlev dans le commerce; Echantillon pour essai: partie de lchantillon utilise pour lexamen.

3 3.1

Matriel et ractifs Solution de thiosulfate de sodium (2) Na2S2O3 . 5H20 (248.18 g/mol) Eau 24.8 1000 g ml

3.2

Solution de peptone-sel (3) NaCl Peptone de casine, pancratique Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.0 0.1 8.5 1.0 1000 g g ml

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B. Directives pour l'chantillonnage

Echantillonnage Lchantillon doit tre prlev et si ncessaire conserv de telle manire que le statut microbiologique ne puisse tre fauss. Pour leau potable, il faut inactiver les ventuels rsidus de dsinfectants en y ajoutant du thiosulfate de sodium. A cet effet, on ajoute aux flacons dessai avant la strilisation, 0,1 ml de solution de thiosulfate de sodium pour 100 ml de volume dchantillon.

Prparation de lchantillon pour essai Dgeler les chantillons congels aussi vite que possible, 37C maximum, et les analyser de suite. Pour les chantillons inhomognes, il faut tenir compte lors du prlvement des diffrentes proportions des composants (ex. fromage pte molle avec crote consommable : Crote 10% et pte 90%).

5.1

Recherches Pour les recherches au moyen de mthodes denrichissement, il faut prlever lchantillon pour essai de faon dtecter les germes pathognes recherchs avec la plus grande probabilit. La quantit dchantillon pour essai est fixe dans lOrdonnance sur lhygine.

5.2

Dnombrements Pour les chantillons non homognes (solides ou liquides), il faut prlever entre 40 g et 100 g dchantillon pour essai et les homogniser avec la mme quantit de solution peptone-sel. 20 g de cet homognat doivent alors nouveau tre homogniss avec 80 g de solution peptone- sel. La srie de dilution est tablie partir de cette solution mre (= dilution 10-1). Pour les chantillons solides homognes, il faut homogniser directement au moins 10 g dchantillon pour essai avec une quantit 9 fois plus leve de solution peptonesel. La srie de dilution est tablie partir de cette solution mre (= dilution 10-1). Les chantillons liquides homognes peuvent directement tre utiliss comme solution mre.

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B. Directives pour l'chantillonnage

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent.

Bibliographie 1. 2. 3. Anonym (1984): Verordnung vom 4. Juni 1984 ber die Probenerhebung von Lebensmitteln und Gebrauchsgegenstnden. EDMZ, Bern. Anonym (1996): Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammuntersuchung. Verlag Chemie, Weinheim. Baumgart, J. (Grundwerk 1994 / 4. Ergnzungslieferung 1997): Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln. Behrs Verlag, Hamburg.

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C. Evaluation des dnombrements

C.
1

Evaluation des dnombrements


Objectifs Ce document dcrit le mode de calcul utilis et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Dfinitions Les units formant des colonies (ufc) ayant pouss sur des botes de Petri ou des membranes, dont les caractristiques sont identifiables lil nu et reconnues comme typiques, sont dsignes comme ufc prsumes, lorsquelles doivent tre soumises des tests de confirmation ufc confirmes, lorsque des tests de confirmation ont confirm l'identification prsume ou en revanche ne sont mme pas ncessaires; Le nombre de colonies spcifiques est la somme des ufc prsumes ou confirmes qui ont pouss sur une bote de Petri ou une membrane; Le nombre total de colonies est la somme de toutes les ufc qui ont pouss sur une bote de Petri ou une membrane; Le rsultat est le nombre dufc confirmes, rapport l'unit de grandeur de rfrence (g, ml) dfinie dans les valeurs maximales lgales.

Conventions Les sries de dilution se font par paliers dcimaux; Pour chaque dilution, une seule bote de Petri est ensemence; Les essais de confirmation sont effectus sur toutes les ufc prsumes jusqu un max. de 5 par bote ou membrane. Si le nombre dufc prsumes est suprieur 5, celui-ci est multipli par le quotient n/5 (n: ufc confirmes, 5: ufc examines), ce qui donne par extrapolation le nombre dufc par bote ou membrane; La scurit statistique du dnombrement est lie de la manire suivante au nombre de colonies : la limite du nombre maximal total des colonies "nt" (limites fixes dans les diffrentes mthodes); la limite du nombre maximal des colonies spcifiques "ns" (limites fixes dans les diffrentes mthodes); la limite infrieure du nombre de colonies spcifiques (0 pour les chantillons non dilus et 10 pour les chantillons dilus).

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C. Evaluation des dnombrements

Mode de calcul et expression des rsultats Pour les chantillons non dilus, comme leau de boisson, le lait Pour les chantillons dilus aller en 4.1 aller en 4.2

4.1 Pour lapprciation et lvaluation des botes de Petri, les critres dlimination sont considrer dans l'ordre suivant: a) Le nombre total de colonies nexcde pas la limite (nt): aller en 4.1.1 b) Le nombre total de colonies excde la limite (nt): Des ufc prsumes ou confirmes sont dcelables: aller en 4.1.2 Plus aucune ufc prsume ou confirme nest dcelable: le rsultat indiqu est non valuable . 4.1.1 Le nombre dufc confirmes n est = 0: le rsultat indiqu est nd (non dcelable) par quantit examine. Le nombre dufc confirmes n est > 0, mais la limite suprieure (ns) du nombre de colonies spcifiques: le rsultat indiqu est n par quantit examine. Le nombre dufc confirmes n est > que la limite suprieure (ns) du nombre de colonies spcifiques: le rsultat indiqu est > ns par quantit examine. 4.1.2 Le nombre dufc confirmes n est = 0: le rsultat indiqu est non valuable . Le nombre dufc confirmes n est > 0: le rsultat indiqu est n par quantit examine.

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C. Evaluation des dnombrements

4.2 Pour lapprciation et lvaluation des botes de Petri, les critres dlimination suivants sont dterminants, dans lordre: a) Le nombre total de colonies nexcde pas la limite (nt): Le nombre dufc prsumes ou confirmes n est 10: Le nombre dufc prsumes ou confirmes n est < 10: aller en 4.2.1 aller en 4.2.2

b) Le nombre total de colonies excde la limite (nt): Des ufc prsumes ou confirmes sont dcelables: aller en 4.2.3 Plus aucune ufc prsume ou confirme nest dcelable: le rsultat indiqu est non valuable . 4.2.1 Le nombre dufc confirmes n est 10, mais la limite suprieure (ns) du nombre de colonies spcifiques: dans le cas o une seule dilution rpond ces critres: Le rsultat indiqu est n * d par g ou ml, d tant le taux de dilution. Exemple: Dilution 3: n = 48, Dilution 4: n = 7 Calcul: 48 * 103 ; rsultat: 4.8 * 104 dans le cas o deux dilutions rpondent ces critres: On calcule la moyenne arithmtique pondre en faisant la somme des ufc confirmes, que lon multiplie par le taux de dilution de la dilution la plus faible et que lon divise par 1.1. Exemple: Dilution -3: n = 128; Dilution -4: n = 15; Calcul: (128 + 15) * 103 / 1.1; rsultat: 1.3 * 105 Le nombre dufc confirmes n est > que la limite suprieure (ns) du nombre de colonies spcifiques: Le rsultat indiqu est > n * d par g ou ml, d tant le taux de dilution.

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C. Evaluation des dnombrements

4.2.2 Le nombre dufc confirmes n est compris entre 0 et 3: Le rsultat indiqu est < d par g ou ml, d tant le taux de dilution (1). Exemple: Dilution -3: n = 2; rsultat: < 103 Le nombre dufc confirmes n est compris entre 4 et 9: Si lensemencement provient de la solution mre, le rsultat indiqu est > d par g ou ml, d tant le taux de dilution (1). Exemple: Dilution -1: n = 5; rsultat: > 10 Si lensemencement provient de la srie de dilutions, le rsultat indiqu est < 10 * d par g ou ml, d tant le taux de dilution. Exemple: Dilution -2: n = 5; rsultat: < 103 4.2.3 Le nombre dufc confirmes n est = 0: Le rsultat indiqu est non valuable . Le nombre dufc confirmes n est > 0: Le rsultat indiqu est n * d par g ou ml, d tant le taux de dilution.

5.

Bibliographie 1. Anonyme (1996): Microbiologie des aliments Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme ISO 7218; Annexe A: Limites de l'intervalle de confiance pour l'estimation des petits nombres.

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D. Expression des rsultats

D.
1

Expression des rsultats


Objectifs Ce document donne des indications sur lexpression des rsultats, dans le cadre de la surveillance officielle des denres alimentaires et tablit la relation entre les rsultats et les valeurs maximales des micro-organismes dfinies lgalement.

Expression des rsultats La manire de prsenter les rsultats (par ex. arrondi) dans les rapports de contrle incombe au responsable du rapport. A linverse, les rgles pour lvaluation des dnombrements ont un caractre contraignant.

Valeurs maximales dfinies lgalement La dispersion inhrente la mthode est dj prise en compte dans les valeurs maximales de micro-organismes fixes dans la lgislation, si bien que chaque rsultat suprieur une valeur maximale signifie toujours un dpassement de celle-ci.

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E.1

E. E.1

Mthodes de recherche et de dnombrement Dnombrement des germes arobies msophiles


Technique de lensemencement dans la masse

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement des germes arobies msophiles et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions Les germes arobies msophiles sont des bactries, des levures ou des moisissures, qui forment des colonies dans les conditions dfinies dans cette mthode.

Principe Mlanger des quantits connues dchantillon pour essai dans des botes de Petri avec un milieu de culture liqufi. Aprs incubation, procder au comptage des colonies apparues dans et sur le milieu et au calcul du nombre de germes arobies msophiles par g ou ml dchantillon.

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E.1

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi, disponibles dans le commerce; des produits chimiques, qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer le nombre de colonies.

5.2

Plate Count Agar Peptone de casine, pancratique Extrait de levure D-glucose Agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.0 0.2 * conformment aux indications du fabricant. 5.0 2.5 1.0 918 1000 g g g g* ml

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Introduire l'aide d'une pipette 1 ml de lchantillon, de la solution mre ou de chacune des dilutions correspondantes dans des botes de Petri. Couler ensuite le Plate Count Agar liqufi, refroidi 461C, jusqu obtenir une couche dau moins 2 mm dpaisseur.

6.2

Incubation Incuber en atmosphre arobie pendant 3 jours 301C

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E.1

6.3

Evaluation et apprciation Compter toutes les colonies dcelables lil nu. Examiner les petites particules la loupe pour savoir sil sagit de colonies.

6.4

Confirmation Aucune

6.5

Points critiques Les botes de Petri doivent tre protges dun desschement pendant lincubation.

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit la section C Evaluation des dnombrements . Pour une bote de 9 cm, la limite suprieure du nombre total de colonies nt est de 300 ufc.

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits de germes arobies msophiles formant des colonies par g ou ml dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent.

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E.1

10

Statut Cette mthode correspond une mthode normalise (1).

11

Bibliographie 1. Anonyme (1991): Microbiologie Directives gnrales pour le dnombrement des micro-organismes Mthode par comptage des colonies obtenues 30C. Norme ISO 4833; Organisation internationale de normalisation.

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E.2

E.2

Dnombrement des Enterobacteriaceae


Technique densemencement dans la masse avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement des Enterobacteriaceae et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions Les Enterobacteriaceae ne possdent pas de cytochrome oxydase et forment des colonies typiques dans les conditions dfinies dans cette mthode.

Principe Mlanger des quantits connues dchantillon pour essai dans des botes de Petri avec un milieu de culture liqufi. Aprs incubation, procder au comptage des colonies prsumes, un test de confirmation et au calcul du nombre dEnterobacteriaceae par g ou ml dchantillon.

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E.2

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques, qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance des Enterobacteriaceae; un test de loxydase disponible dans le commerce.

5.2

Violet Red Bile Glucose Agar (glose VRBG) Peptone (peptone de viande pancratique et papanique) 7.0 Extrait de levure 3.0 D-glucose 10.0 Sels biliaires (sels biliaires purifis) 1.5 NaCl 5.0 Rouge neutre 0.03 Violet cristallis 0.002 Agar-agar 9-18* Eau 1000 * conformment aux indications du fabricant Dissoudre et faire bouillir en agitant. Ne pas striliser lautoclave. pH: 7.4 0.2

g g g g g g g g ml

5.3

Glose Tryptone soja (TSA) Peptone de casine, pancratique Peptone de soja NaCl Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.3 0.2 15.0 5.0 5.0 9-18* 1000 g g g g ml

*Conformment aux indications du fabricant

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E.2

6 6.1

Mode opratoire Ensemencement des botes de Petri Introduire la pipette 1 ml de lchantillon, de la solution mre ou de chacune des dilutions correspondantes dans des botes de Petri. Puis couler la glose VRBG liqufie et refroidie 46 1C, jusqu obtenir une couche dau moins 2 mm dpaisseur. Aprs solidification de la glose, recouvrir les botes de 10 ml d'une deuxime couche de glose VRBG refroidie 46 1C.

6.2

Incubation Incuber en atmosphre arobie pendant 24 h 37 1C.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des Enterobacteriaceae prsumes, les colonies rouge fonc rouge violet, dun diamtre suprieur 0,5 mm.

6.4

Confirmation Repiquer toutes les colonies prsumes, jusqu' un maximum de 5 sur TSA. Incuber pendant 18-24 h 37 1C et effectuer le test de l'oxydase.

6.5

Points critiques Aucun

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit la section C Evaluation des dnombrements . Pour une bote de 9 cm, la limite suprieure du nombre total de colonies nt est identique celle du nombre de colonies spcifiques ns (nt = ns) = 150 ufc.

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E.2

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits dEnterobacteriaceae formant des colonies par g ou ml dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande est la souche Escherichia coli ATCC 25922.

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: Le test doxydation-fermentation nest pas effectu.

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Bibliographie 1. Anonyme (1993): Directives gnrales pour le dnombrement sans revivification des Enterobacteriaceae. Norme ISO 7402; Organisation internationale de normalisation.

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E.3

E.3

Dnombrement dEscherichia coli


Technique densemencement dans la masse ou de filtration sur membrane avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement dEscherichia (E.) coli et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinition Dans les conditions dfinies dans cette mthode, E. coli forme des colonies de coloration rouge bleue typique.

Principe Technique de lensemencement dans la masse: Mlanger des quantits connues dchantillon pour essai dans des botes de Petri avec le milieu de culture slectif liqufi. Aprs incubation, procder au comptage des colonies de coloration typique et au calcul du nombre dE. coli par g ou ml dchantillon. Technique de dnombrement sur membrane pour leau de boisson: Filtrer des quantits connues dchantillon dessai travers une membrane filtrante. Transfrer alors celle-ci sur un milieu de culture non slectif pour revivifier les E. coli. Aprs incubation, transfrer la membrane sur un milieu slectif, puis lincuber nouveau. Evaluer alors les colonies typiques.

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E.3

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance des E. coli.

5.2

Glose Tryptone Bile Glucuronide (TBX) (1) Peptone de casine, pancratique 20.0 Sels biliaires, raffins 1.5 Acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronique (sel de cyclohexylammonium (521.79 g/mol)) 0.075 Agar-agar 9-18* Eau 1000 *Conformment aux indications du fabricant Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.2 0.2 g g g g ml

5.3

Glose Tryptone soja (TSA) Peptone de casine, pancratique Peptone de soja NaCl Agar-agar Eau *Conformment aux indications du fabricant Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.3 0.2 15.0 5.0 5.0 9-18* 1000 g g g g ml

5.4

Membrane filtrante Pour la filtration, utiliser des membranes impression quadrille dont la taille des pores est de 0,45 m.

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E.3

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Mthode densemencement dans la masse: Introduire l'aide d'une pipette 1 ml de lchantillon, de la solution mre ou de chacune des dilutions correspondantes dans des botes de Petri. Puis couler la glose TBX liqufie, refroidie 46 1C jusqu obtenir une couche dau moins 2 mm dpaisseur. Mthode de dnombrement sur membrane pour leau de boisson: Filtrer sur membrane lchantillon ou la dilution dcimale, transfrer la membrane sur le TSA pour revivifier les germes, lincuber puis la transfrer enfin sur la glose TBX et lincuber.

6.2

Incubation Technique densemencement dans la masse: 18 24 h 44 1C en atmosphre arobie Technique de dnombrement sur membrane pour leau de boisson: TSA 2 - 4 h 37 1C et glose TBX 18 24 h 44 1C, en atmosphre arobie.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme E. coli, les colonies de coloration bleue.

6.4

Confirmation Aucune

6.5

Points critiques Protger les botes dun desschement pendant lincubation. Filtrer au moins 10 ml dans la technique de dnombrement sur membrane, afin d'obtenir une rpartition rgulire des colonies la surface de la membrane. La temprature maximale dincubation ne doit pas excder 45C.

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E.3

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit dans la section C Evaluation des dnombrements . Pour une bote de 9 cm, la limite suprieure du nombre total de colonies nt est identique celle du nombre de colonies spcifiques ns (nt = ns) = 150 ufc. Pour le contrle de leau de boisson, la prsence dune seule colonie typique est suffisante pour supprimer l'valuation numrique statistique.

Expression des rsultats Technique de lensemencement dans la masse: indiquer le nombre dE. coli dcels par g dchantillon. Technique de dnombrement sur membrane pour leau de boisson: indiquer la mise en vidence ou non dE. coli dans le volume dchantillon examin. Exprimer le rsultat par prsence ou absence dE. coli par 100 ml dchantillon.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande pour le contrle de la croissance est la souche E. coli ATCC 25922.

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: le solvant sulfoxyde de dimthyle n'est pas utilis et la revivification pour la technique de recherche sur membrane se fait sur TSA (2,3).

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E.3

11

Bibliographie 1. Anonyme (1999): Microbiologie des aliments: Mthode horizontale pour le dnombrement d'Escherichia coli prsums Partie 1: Technique de comptage des colonies 44C au moyen de membranes et d'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D glucuronique. Partie 2: Technique de comptage des colonies 44C au moyen d'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D glucuronique. Norme ISO/DIS 16649-1 et 2; Organisation internationale de normalisation. Bissonnette G., Jezeskin K.J.J., McFeters G.A. and Stuart D.G. (1977): Evaluation of recovery methods to detect coliforms in water. Appl. Environ. Microbiol. 33: 590595. Jermini M., Domeniconi F. and Jggli M. (1994): Evaluation of C-EC-agar, a modified mFC-agar for the simultaneous enumeration of faecal coliforms and E. coli in water samples. Lett. Appl. Microbiol. 19: 332 335.

2.

3.

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E.4

E.4

Dnombrement de Pseudomonas aeruginosa


Technique de dnombrement sur membrane avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement de Pseudomonas (P.) aeruginosa et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et objets usuels filtrables.

Dfinitions P. aeruginosa forme des colonies de coloration typique dans les conditions dfinies dans cette mthode, pousse 42C et possde une cytochrome oxydase.

Principe Filtrer des quantits connues dchantillon pour essai travers une membrane. Transfrer celle-ci sur un milieu de culture slectif. Aprs incubation, soumettre les colonies prsumes des essais de confirmation et calculer le nombre de P. aeruginosa par g ou ml.

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E.4

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques, qui prsentent au moins un degr de "puret pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance de P. aeruginosa; un test de loxydase disponible dans le commerce.

5.2 5.2.1

Glose au ctrimide et lacide nalidixique (CNA) Milieu de base Peptone de glatine, pancratique Hydrolysat de casine K2SO4 (174.27 g/mol) MgCl2 (95.22 g/mol) Agar-agar Eau * conformment aux indications du fabricant Dissoudre, ajouter 10 ml de glycrine et striliser 15 min. 121C. pH: 7.3 0.2 16.0 10.0 10.0 1.4 9-18* 1000 g g g g g ml

5.2.2

Supplments Ctrimide Eau strile Acide nalidixique Eau strile Dissoudre en chauffant lgrement. 4.0 20.0 0.3 20.0 g ml g ml

5.2.3

Milieu complet Immdiatement avant lemploi, ajouter les supplments au milieu de base (5.2.1) dans les proportions suivantes: Solution de ctrimide Solution dacide nalidixique 1.0 1.0 ml ml

MSDA 2000

2/5

56 Microbiologie

E.4

5.3 5.3.1

Bouillon de ctrimide (BC) Milieu de base Peptone de glatine, pancratique Hydrolysat de casine K2SO4 (174.27 g/mol) MgCl2 (95.22 g/mol) Eau pH: 7.3 0.2 16.0 10.0 10.0 1.4 1000 g g g g ml

Dissoudre, ajouter 10 ml de glycrine et striliser 15 min 121C

5.3.2

Supplment Ctrimide Eau strile Dissoudre en chauffant lgrement. 4.0 20.0 g ml

5.3.3

Milieu complet Immdiatement avant lemploi, ajouter le supplment au milieu de base (5.3.1) dans les proportions suivantes: Solution de ctrimide 1.0 ml Rpartir raison de 5 ml dans des tubes essai

5.4

Membrane filtrante Pour la filtration, utiliser des membranes impression quadrille dont la taille des pores est de 0,45 m.

5.5

Lampe UV Lampe avec une mission de lumire de 360 nm.

MSDA 2000

3/5

56 Microbiologie

E.4

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Filtrer lchantillon ou la dilution dcimale travers la membrane et transfrer celle-ci sur le CNA.

6.2

Incubation Incuber en atmosphre arobie pendant 24 48 h, 37 1C.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des P. aeruginosa prsums, toutes les colonies pigmentes en vert, bleu ou rouge et/ou celles qui sont fluorescentes sous lumire UV (366 nm) et prsentent lodeur typique de la souche tmoin.

6.4

Confirmation Raliser le test de l'oxydase avec toutes les colonies prsumes jusqu un maximum de 5. Cultiver ensuite les souches qui disposent dune cytochrome oxydase dans le bouillon de ctrimide en atmosphre arobie 42 0.5C pendant 24 heures. Une croissance confirme la prsence de P. aeruginosa.

6.5

Points critiques Afin dobtenir une rpartition rgulire des colonies la surface de la membrane, il faut recueillir et filtrer un volume dchantillon pour essai dau moins 10 ml lors de la mthode de dnombrement sur membrane. Lincubation du bouillon de ctrimide doit se faire 42 0.5C (par ex. au bain-marie).

MSDA 2000

4/5

56 Microbiologie

E.4

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit dans la section C Evaluation des dnombrements . La limite suprieure du nombre total de colonies nt est identique celle du nombre de colonies spcifiques ns (nt = ns) = 25 ufc. Pour le contrle de leau de boisson, la prsence d'une seule colonie confirme est suffisante pour supprimer l'valuation numrique statistique.

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits de P. aeruginosa formant des colonies par g ou 100 ml dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande pour le contrle de la croissance sur la glose slective est la souche P. aeruginosa ATCC 27853.

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: la glose KingB et le test de lactamide sont supprims. La croissance est contrle dans une preuve de confirmation supplmentaire, 42C.

11

Bibliographie 1. Anonyme (1997): Qualit de leau - Dtection et dnombrement de P. aeruginosa dans les eaux embouteilles. Europische Norm prEN 12780.

MSDA 2000

5/5

56 Microbiologie

E.5

E.5

Recherche dEnterococcus spp.


Technique de dnombrement sur membrane avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit la recherche dEnterococcus spp. et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique leau de boisson.

Dfinitions Les Enterococcus spp. ne disposent pas de catalase et forment des colonies typiques qui hydrolysent lesculine, dans les conditions dfinies dans cette mthode.

Principe Filtrer des quantits connues dchantillon pour essai travers une membrane. Transfrer celle-ci sur un milieu de culture slectif. Si des colonies prsumes ont pouss aprs lincubation, transfrer la membrane sur un deuxime milieu slectif et lincuber encore pendant un court laps de temps. Soumettre les colonies typiques des essais de confirmation.

MSDA 2000

1/5

56 Microbiologie

E.5

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance dEnterococcus spp.;

5.2

Glose m-Enterococcus Peptone de casine, pancratique Peptone de soja, papanique Extrait de levure D-glucose KH2PO4 (136.09 g/mol) NaN3 Chlorure de triphnyl-2,3,5-ttrazolium (334.81 g/mol) Agar-agar Eau * conformment aux indications du fabricant Dissoudre et faire bouillir en agitant (cf. 6.5 Points critiques ) pH: 7.2 0.2 15.0 5.0 5.0 2.0 4.0 0.4 g g g g g g

0.1 g 9-18* g 1000 ml

5.3

Glose bile esculine (Bile Esculin Agar) Extrait de viande 3.0 Peptone de viande 5.0 Bile de buf, dshydrate* 40.0* Citrate de fer (III) monohydrat (262.97 g/mol) 0.5 Esculine, anhydre 1.0 Agar-agar 9-18 ** Eau 1000 ** conformment aux indications du fabricant Dissoudre et faire bouillir en remuant (cf. 6.5 Points critiques ). pH: 6.4 0.2 g g g g g g ml

* certains fabricants utilisent des sels biliaires la place de la bile de buf

MSDA 2000

2/5

56 Microbiologie

E.5

5.4

Membrane filtrante Pour la filtration, utiliser des membranes impression quadrille dont la taille des pores est de 0,45 m.

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Filtrer lchantillon ou la dilution dcimale travers la membrane et transfrer celle-ci sur la glose m-Enterococcus.

6.2

Incubation Incuber en atmosphre arobie pendant 48 h 371oC.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des Enterococcus spp. prsums, les colonies rose clair rouge brun dun diamtre suprieur 0,5 mm. Consigner leur position sur une feuille de rapport en reproduisant limpression quadrille de la membrane ou en la marquant sur le fond de la bote de Petri.

6.4

Confirmation Transfrer la membrane de la glose m-Enterococcus sur la glose bile esculine, lincuber en atmosphre arobie 4 h 37 1oC. En prsence de colonies prsumes entoures dun halo brun fonc (hydrolyse de lesculine), effectuer le test de la catalase en versant une goutte dH2O2. Les colonies prsentant une hydrolyse de lesculine positive et une raction de la catalase ngative, sont considres comme des Enterococcus spp.

MSDA 2000

3/5

56 Microbiologie

E.5

6.5

Points critiques La glose m-Enterococcus et la glose bile esculine perdent de leur slectivit par surchauffe et doivent donc tre seulement bouillies et non strilises lautoclave. 10 ml au moins doivent tre filtrs pour obtenir une rpartition rgulire des colonies la surface de la membrane. Les membranes comportant plus de 30 colonies dEnterococcus spp. prsumes, ne peuvent tre values avec fiabilit sur le plan quantitatif.

Evaluation quantitative Pour le contrle de leau de boisson, la prsence dune seule colonie confirme est suffisante pour supprimer l'valuation numrique statistique.

Expression des rsultats Indiquer la mise en vidence ou non dEnterococcus spp. dans le volume dchantillon examin. Le rsultat indique la prsence ou labsence dEnterococcus spp. par 100 ml dchantillon.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande pour le contrle de la croissance sur la glose mEnterococcus et pour la vrification du test de confirmation est la souche Enterococcus faecalis ATCC 19433.

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: l'incubation sur la glose Bile Esculine est effectue 37C. Les colonies prsumes Enterococcus sont soumises au test de la catalase (2).

MSDA 2000

4/5

56 Microbiologie

E.5

11

Bibliographie 1. Anonyme (2000): Qualit de l'eau Recherche et dnombrement des streptocoques fcaux. Partie 2: Mthode par filtration sur membrane. Norme ISO/FDIS 7899-2; prENISO 7899-2. Comit europen de normalisation. Figueras, M.J., Inza, I., Polo, F.L., Feliu, M.T., and Guarro J. (1996): A fast method for the confirmation of fecal streptococci from m-Enterococcus medium. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2177-2178.

2.

MSDA 2000

5/5

56 Microbiologie

E.6

E.6

Dnombrement des staphylocoques coagulase positive


Technique densemencement en surface avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement des staphylocoques coagulase positive et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions Les staphylocoques coagulase positive comme le Staphylococcus aureus, forment des colonies typiques dans les conditions dfinies dans cette mthode.

Principe Effectuer un talement en surface sur un milieu de culture slectif, partir de quantits connues dchantillon dessai. Aprs incubation, procder au comptage des colonies typiques et au calcul des staphylocoques coagulase positive par g ou ml dchantillon.

MSDA 2000

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56 Microbiologie

E.6

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance des staphylocoques coagulase positive.

5.2

Tampon phosphate 0,05 M KH2PO4 (136.09 g/mol) Na2HPO4 2 H2O (177.99 g/mol) Eau pH: 7.0 0.1 2.81 5.23 1000 g g ml

5.3 5.3.1

Rabbit Plasma Fibrinogen Agar (RPFA) Milieu de base (Baird-Parker-Agar) Peptone de casine, pancratique Extrait de viande Extrait de levure Pyruvate de sodium L-glycine LiCl (42.39 g/mol) Agar-agar Eau 8.9 4.5 0.9 8.9 10.7 4.5 11-20* 740 g g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 6.9 0.2

MSDA 2000

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56 Microbiologie

E.6

5.3.2

Supplments Fibrinogne bovin, fraction I Eau Tampon phosphate (5.2) 3.7 73 147 g ml ml

Broyer le fibrinogne dans un mortier en porcelaine et lajouter lentement et en petites quantits leau, sans arrter de remuer, afin quil gonfle et se dissolve. Ds que le fibrinogne commence se dissoudre, ajouter 147 ml de tampon phosphate et finir la dissolution. Filtrer par aspiration le mlange (il est recommand d'utiliser trois filtres en papier superposs densit, respectivement rtention croissante). : Puis striliser immdiatement par filtration sans exercer de pression, avec le montage de filtres suivant: 1) Membrane filtrante (mlange d'esters de cellulose) 0.8 m 2) Gaze de sparation en nylon 3) Prfiltre en fibre de verre Inhibiteur de trypsine type I-S, extrait du soja 0.1 Tampon phosphate (5.2) 100 Plasma de lapin avec EDTA, lyophilis, dissoudre selon les indications du fabricant K2TeO3 (253.80 g/mol) Eau 5.3.3 Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.3.1) 45-50C. Striliser les supplments par filtration et les ajouter dans les proportions suivantes en agitant prcautionneusement: Solution de fibrinogne* Solution dinhibiteur de trypsine Plasma de lapin Solution de tellurite de potassium * chauffer 45-50C 220.0 8.4 24.7 2.5 ml ml ml ml 1.0 100 g ml g ml

MSDA 2000

3/5

56 Microbiologie

E.6

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Dposer l'aide d'une pipette 0,1 ml de lchantillon, de la solution mre ou des dilutions correspondantes sur le milieu de culture RPFA pralablement sch et ltaler sur toute la surface.

6.2

Incubation Incuber pendant 18 - 48 h 37 1C en atmosphre arobie.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des staphylocoques coagulase positive, les colonies gris-noir noires, brillantes, convexes, de 1 3 mm de diamtre, entoures dun halo trouble qui se voit le mieux en contre-jour oblique face une surface fonce

6.4

Confirmation Aucune

6.5

Points critiques Filtration du fibrinogne: Si une pression est exerce, la membrane filtrante a tendance se boucher rapidement. On peut filtrer en gnral 1000 ml de fibrinogne avec un filtre de 11 cm de diamtre. Une flore protolytique contaminante peut faire disparatre les halos troubles. Il faut donc contrler les botes une premire fois au bout de 18 - 24 h, compter et marquer les colonies typiques entoures dun halo trouble.

MSDA 2000

4/5

56 Microbiologie

E.6

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit la section C Evaluation des dnombrements . La limite suprieure du nombre total de colonies nt est identique celle du nombre de colonies spcifiques ns pour une bote de 9 cm (nt = ns) = 150 ufc.

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits de staphylocoques coagulase positive formant des colonies, par g dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande est la souche Staphylococcus aureus ATCC 25923.

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: La technique densemencement en surface est utilise et le milieu est prpar de manire strile.

11

Bibliographie 1. Anonyme (1997): Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour le dnombrement des staphylocoques coagulase positive (Staphylococcus aureus et autres espces) Partie 2: _Technique utilisant le milieu glos au plasma de lapin et au fibrinogne. Norme ISO 6888-2; Organisation internationale de normalisation.

MSDA 2000

5/5

56 Microbiologie

E.7

E.7

Dnombrement de Clostridium perfringens


Technique densemencement en surface avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement de Clostridium (C.) perfringens et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions C. perfringens forme des colonies fluorescentes qui produisent une hmolyse complte en prsence de Streptococcus agalactiae sur glose au sang (Blood Agar), dans les conditions dfinies dans cette mthode.

Principe Effectuer un talement en surface sur le milieu de culture slectif, partir de quantits connues dchantillon dessai. Aprs incubation, procder au comptage des colonies prsumes, des examens biochimiques et au calcul du nombre de C. perfringens par g ou ml dchantillon.

MSDA 2000

1/5

56 Microbiologie

E.7

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance des C. perfringens.

5.2 5.2.1

Glose de tryptose-sulfite-cyclosrine (TSC) (1,2) Milieu de base Tryptose Peptone de farine de soja Extrait de levure Na2S2O5 (190.10 g/mol) Citrate de fer (III) ammoniacal Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 15.0 5.0 5.0 1.0 1.0 9-18* 940 g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

5.2.2

Supplments Saccharose Eau D-cyclosrine 4-mthylumbellifryl-phosphate Eau 5.0 50.0 0.4 0.1 10.0 g ml g g ml

5.2.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.2.1) 45-50C. Striliser les supplments par filtration et les ajouter au milieu de base. pH: 7.4 0.2

MSDA 2000

2/5

56 Microbiologie

E.7

5.3 5.3.1

Glose au sang (Blood Agar) Milieu de base (Glose Columbia) Peptone de viande, pepsique Amidon NaCl Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 23.0 1.0 5.0 9 18* 950 g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

5.3.2

Supplment Sang de mouton strile dfibrin 50 ml

5.3.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.3.1) 45-50C. Ajouter le supplment. pH: 7.2 0.2

5.4 5.5 5.6

Peroxyde dhydrogne 3 % Streptococcus agalactiae ATCC 13813 Lampe UV longueur d'onde de 360 nm.

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri

Dposer l'aide d'une pipette 0,1 ml dchantillon, de la solution mre ou des dilutions correspondantes sur le milieu de culture TSC bien sch auparavant et ltaler sur toute la surface.

MSDA 2000

3/5

56 Microbiologie

E.7

6.2

Incubation Incuber en atmosphre anarobie pendant 22 2 h 44 1C

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des C. perfringens prsums, des colonies fluorescentes en lumire UV de 360 nm.

6.4

Confirmation Repiquer toutes les colonies prsumes, jusqu un maximum de 5, sur la glose au sang, les incuber pendant 18-24 h 37 1C en atmosphre anarobie, puis les diffrencier comme suit: Test de CAMP invers: Ensemencer une souche de S. agalactiae par une large strie en travers de la bote de glose au sang et inoculer les colonies tudier perpendiculairement la culture prcdente partir de la priphrie, de telle sorte que les stries sarrtent juste avant celles de S. agalactiae. Incuber en atmosphre anarobie pendant 18-24 h 37 1C. C. perfringens forme une hmolyse complte en forme darc entre les deux stries (3). Catalase: C. perfringens est catalase-ngatif.

Figure 1: Rsultat du test de CAMP invers

Streptococcus agalactiae

Phnomne de CAMP invers

C. perfringens hmolyse complte

MSDA 2000

4/5

56 Microbiologie

E.7

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit dans la section C Evaluation des dnombrements . Pour une bote de 9 cm, la limite suprieure du nombre total de colonies nt est = 150 ufc et la limite suprieure du nombre de colonies spcifiques ns est = 50 ufc.

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits de C. perfringens formant des colonies par g ou ml dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande est la souche de Clostridium perfringens ATCC 3624.

10

Statut Cette mthode a le statut dune mthode scientifique publie (2).

11

Bibliographie 1. 2. 3. Anonyme (1992): Fluoreszenzoptischer Schnellnachweis von Clostridium perfringens. MERCK E. (Schweiz) AG, Diagnostica 4032. Baumgart J., Baum O. und Lippert S. (1990): Schneller und direkter Nachweis von Clostridium perfringens. Fleischwirtschaft 70: 1010-1014. Hansen M.V. and Elliott L.P.(1980): New presumptive identification test for Clostridium perfringens: Reverse CAMP test. J. Clin. Microbiol. 12: 617-619.

MSDA 2000

5/5

56 Microbiologie

E.8

E.8

Dnombrement de Bacillus cereus


Technique densemencement en surface avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement de Bacillus (B.) cereus et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions B. cereus forme des colonies typiques dans les conditions dfinies dans cette mthode, fermente le glucose, rduit le nitrate en nitrite et forme une hmolyse complte sur la glose au sang (Blood Agar).

Principe Effectuer un talement en surface sur un milieu de culture slectif, partir de quantits connues dchantillon dessai. Aprs incubation, procder au comptage des colonies de B. cereus prsumes, l'examen de la proprit hmolytique et au calcul du nombre de B. cereus par g ou ml dchantillon.

MSDA 2000

1/5

56 Microbiologie

E.8

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance de B. cereus; un test de rduction du nitrate disponible dans le commerce.

5.2 5.2.1

Cereus Selective Agar (glose MYP) Milieu de base Extrait de viande Peptone de viande, pepsique D(-)-mannitol NaCl Rouge de phnol Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 1.0 10.0 10.0 10.0 0.025 9-18* 890 g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

5.2.2

Supplment Sulfate de polymyxine B Eau Dissoudre dans leau. 100'000 10 UI ml

5.2.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.2.1) 45-50C. Ajouter les supplments dans les proportions suivantes: Solution de sulfate de polymyxine B Emulsion de jaune duf 100 ml pH: 7.2 0.2 10 ml

MSDA 2000

2/5

56 Microbiologie

E.8

5.3 5.3.1

Glose au sang (Blood Agar) Milieu de base (Glose Columbia) Peptone de viande, pepsique Amidon NaCl Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 23.0 1.0 5.0 9 18* 950 g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

5.3.2

Supplment Sang de mouton strile dfibrin 50 ml

5.3.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.3.1) 45-50C. Ajouter le supplment. pH: 7.2 0.2

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Dposer l'aide d'une pipette 0,1 ml de lchantillon, de la solution mre ou des dilutions correspondantes sur le milieu de culture MYP pralablement sch et ltaler sur toute la surface.

6.2

Incubation Incuber pendant 18-48 h 30 1C en atmosphre arobie.

6.3

Evaluation et apprciation Peuvent tre considres comme des B. cereus prsums, de grandes colonies plates, mates, rugueuses, roses, au bord irrgulier qui sont entoures dun grand halo de prcipit.

MSDA 2000

3/5

56 Microbiologie

E.8

6.4

Confirmation Repiquer toutes les colonies prsumes jusqu un maximum de 5, sur la glose au sang, les incuber pendant 18-24 h 30 1C en atmosphre arobie, puis raliser le test de l'hmolyse: Hmolyse: les colonies de B. cereus forment une hmolyse complte (-hmolyse).

6.5

Points critiques Une teneur leve en micro-organismes fermentant le mannitol peut provoquer la formation dacide et attnuer la coloration rose typique des colonies de B. cereus ou la faire disparatre compltement. Cest pourquoi, il faut faire une premire valuation au bout de 18-24 h. Certaines souches de B. cereus ne prsentent pas ou quun faible halo de prcipit. De telles colonies doivent galement tre confirmes.

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit la section C Evaluation des dnombrements . Pour une bote de Petri de 9 cm, la limite suprieure du nombre total de colonies nt est identique celle du nombre de colonies spcifiques ns (nt = ns) = 25 ufc.

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits de B. cereus formant des colonies par g ou ml dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande est la souche B. cereus ATCC 14579.

MSDA 2000

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56 Microbiologie

E.8

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1).

11

Bibliographie 1. Anonyme (1999): lignes directives pour le dnombrement de Bacillus cereus prsums Technique de comptage des colonies 30C. Norme ISO/CD 7932; Organisation internationale de normalisation.

MSDA 2000

5/5

56 Microbiologie

E.9

E.9

Dnombrement de Listeria monocytogenes


Technique de lensemencement en surface avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement de Listeria (L.) monocytogenes et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions L. monocytogenes forme des colonies typiques dans les conditions dfinies dans cette mthode. Ces bactries gram-positives, en forme de btonnets, produisent une hmolyse complte en prsence de Staphylococcus aureus et prsentent des ractions biochimiques typiques.

Principe Effectuer un talement en surface sur un milieu de culture slectif, partir de quantits connues dchantillon dessai. Aprs incubation, procder au comptage des colonies de Listeria prsumes, des examens biochimiques et au calcul du nombre de L. monocytogenes par g ou ml dchantillon.

MSDA 2004

1/8

56 Microbiologie

E.9

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance de L. monocytogenes; des tests de diffrenciation disponibles dans le commerce.

5.2 5.2.1

Glose ALOA selon Ottaviani et Agosti (ALOA) (1) Milieu de base Digestat enzymatique de tissus animaux 18.0 Digestat enzymatique de casine 6.0 Extrait de levures 10.0 Pyruvate de Sodium 2.0 D-Glucose 2.0 Glycerophosphate de Magnesium (195.36 g/mol) 1.0 MgSO4 (120.37 g/mol) 0.5 NaCl 5.0 LiCl (42.39 g/mol) 10.0 Na2HPO4 (141.96 g/mol) 2.5 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glucopyranoside (408.6 g/mol) 0.05 Agar 12-18* Eau 930** g g g g g g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant ** 925 ml si on utilise lAmphotricine B en lieu et place de la Cycloheximide.

Dissoudre et striliser 15 min 121C.

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56 Microbiologie

E.9

5.2.2

Supplments Sel de Sodium de lacide nalidixique Eau Ceftazidime Eau Sulfate de polymyxine B Eau

0.02 5.0 0.02 5.0 76700 5.0

g ml g ml U ml

Cycloheximide 0.05 g Ethanol 2.5 ml Eau 2.5 ml Diluer dabord la cycloheximide dans lthanol Ou en lieu et place de la cycloheximide : Amphotricine-B 0.01 g HCL 1 mol/l 2.5 ml Dimthylformamide 7.5 ml Diluer lamphotricine dans lHCl/Dmf Supplment denrichissement L--Phosphatidylinositol 2.0 g Eau 50 ml Dissoudre (env. 30 min) et striliser 15 min 121C. 5.2.3 Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.2.1) 45-50C. Striliser les supplments par filtration et les ajouter dans les proportions suivantes: Solution dacide nalidixique Solution de ceftazidime Solution de polymyxine B Solution de cycloheximide 5 5 5 5 ml ml ml ml

Ou en lieu et place de la cycloheximide : Solution damphotricine B 10 ml Supplment denrichissement 50 ml pH: 7.2 0.2

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56 Microbiologie

E.9

5.3 5.3.1

Glose au sang (Blood Agar) Milieu de base Glose Columbia 39.0 Eau 950 Dissoudre et striliser 15 min 121C. g ml

5.3.2

Supplment Sang de mouton strile dfibrin

50

ml

5.3.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.3.1) 45-50C. Ajouter le supplment. pH: 7.2 0.2

5.4 5.4.1

Bouillon L-rhamnose (LRB) Milieu de base Peptone de viande, pepsique Extrait de viande NaCl Pourpre de bromocrsol Eau 10.0 1.0 5.0 0.02 1000 g g g g ml

Dissoudre, remplir en portions de 4,5 ml et striliser 15 min 121C.

5.4.2

Supplment L-rhamnose 5.0 Eau 100 ml g

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56 Microbiologie

E.9

5.4.3

Milieu complet Laisser refroidir le milieu de base (5.4.1). Striliser le supplment par filtration et lajouter: Milieu de base 4.5 ml Solution de L-rhamnose 0.5 ml pH: 6.8 0.2

5.5 5.5.1

Bouillon mthyl--D-mannopyrannoside (MMP) Milieu de base Composition et prparation cf. 5.4.1

5.5.2

Supplment Mthyl--D-mannopyrannoside Eau 5.0 100 g ml

5.5.3

Milieu complet Laisser refroidir le milieu de base (5.4.1). Striliser le supplment par filtration et lajouter: Milieu de base 4.5 Solution de mthyl--D-mannopyrannoside 0.5 pH: 6.8 0.2 ml ml

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Dposer l'aide d'une pipette 0,1 ml de lchantillon, de la solution mre ou des dilutions correspondantes sur le milieu de culture ALOA bien sch auparavant et ltaler sur toute la surface.

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56 Microbiologie

E.9

6.2

Incubation Incuber pendant 24-48 h, (cf. 6.5 Points critiques ) 371C.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des Listeria spp. prsumes, les colonies isoles de couleur bleu-vert, lisses, de 1 1.5 mm de diamtre et entoures dun halo opaque.

6.4

Confirmation Pour des raisons statistiques (cf. section C Evaluation des dnombrements ), une mise en vidence positive nest donne qu partir de 4 colonies confirmes, si bien que la confirmation peut tre abondonne si lon est en prsence de 0 3 ufc prsumes. Dans le cas contraire, repiquer de 4 10 colonies isoles au maximum sur la glose au sang (Blood Agar), les incuber 18-24 h 37 1C en atmosphre arobie, puis les diffrencier comme suit: Coloration de Gram: Les Listeria spp. sont des btonnets ou coccobacilles grampositifs (longueur 0.5 2 m). Hmolyse: L. monocytogenes, L. seeligeri et L. ivanovii produisent des hmolysines qui lysent en totalit ou en partie les rythrocytes de certaines espces animales. Cette hmolyse est complte, cela signifie quil apparat un halo incolore transparent autour des colonies (-hmolyse). Ce halo peut tre trs faible ou peine visible, surtout avec L. monocytogenes et L. seeligeri. Lhmolyse nest souvent visible que lorsquon retire une colonie avec lanse boucle. Test de CAMP: On obtient une augmentation de lhmolyse avec le test de CAMP. L. monocytogenes et L. seeligeri ont la proprit daccentuer lhmolyse partielle de Staphylococcus aureus, ce qui conduit une hmolyse rapide et complte. Ralisation: tirer une souche de Staphylococcus aureus -hmolytique par une large strie en travers dune bote de glose au sang et inoculer les colonies prsumes perpendiculairement la culture prcdente partir de la priphrie, de telle sorte que les stries sarrtent juste avant celles du Staphylococcus aureus. Incuber 1824 h en atmosphre arobie 37 1C. Fermentation du L-rhamnose et du MMP: ensemencer simultanment des tubes essai remplis de bouillon L-rhamnose et de MMP avec des colonies hmolytiques et CAMP-positives et les incuber 18-24 h 37 1C. L. monocytogenes fermente aussi bien le L-rhamnose que le MMP, ce qui entrane un virage dindicateur du violet au jaune. L. seeligeri linverse, ne fermente ni le L-rhamnose ni le MMP.

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E.9

Figure 1: Ractions du test de CAMP de Listeria spp.


L. innocua Pas dhmolyse Pas de phnomne de CAMP

Staphylococcus aureus

L. monocytogenes /L. seeligeri troite bande dhmolyse complte, phnomne de CAMP

Bande -hmolytique de Staphylococcus aureus

L. ivanovii : Nette hmolyse complte Pas de phnomne de CAMP

Tableau 1: Diffrenciation biochimique des Listeria spp. -Hmolyse Raction de CAMP + + Fermentation du L-rhamnose + v v Fermentation du MMP + + +

L. monocytogenes L. seeligeri L. innocua L. ivanovii L. welshimeri v: raction variable

+ + + -

6.5

Points critiques En cas de faible croissance aprs 24 h, incuber les botes pour 24 h supplmentaires.

Evaluation quantitative La mthode gnrale est dcrite la section C Evaluation des dnombrements .

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E.9

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits de L. monocytogenes formant des colonies par g ou ml dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande est la souche L. monocytogenes ATCC 19112 et pour la ralisation du test de CAMP, la souche Staphylococcus aureus ATCC 25923.

10

Statut Cette mthode correspond un projet de mthode internationale normalise (2) comportant les modifications suivantes: Les ractions de confirmation ont t simplifies en raison des grandes slectivit et lectivit du milieu de culture solide.

11

Bibliographie 1. 2. Ottaviani, F., Ottaviani, M., Agosti, M. (1997) Esperienze su un agar selettivo e differenziale per Listeria monocytogenes. Industrie Alimentari, 36, luglio-agosto, 1-3. Anonym (2002): Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection and enumeration of L. monocytogenes Part 2: Enumeration method. ISO Norm 11290-2; revision of ISO 11290:1996; International Organization of Standardization.

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E.10

E.10 Dnombrement des levures


Technique densemencement en surface avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit le dnombrement de levures et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions Les levures, y compris Geotrichum candidum, forment des colonies dans les conditions dfinies dans cette mthode. Elles sont confirmes par examen microscopique sur la base de leur forme cellulaire caractristique. Les cellules de levures sont nettement plus grandes que les bactries. Elles peuvent tre rondes, ovales, allonges, en forme de citron, de cylindre ou d'ogives. Elles prsentent frquemment des bourgeonnements.

Principe Effectuer un talement en surface sur un milieu de culture slectif, partir de quantits connues dchantillon dessai. Aprs incubation, procder au comptage des colonies de levure prsumes, un examen microscopique de confirmation et au calcul du nombre de levures par g ou ml dchantillon.

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E.10

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance des levures.

5.2

Glose lextrait de levure-glucose-chloramphnicol Extrait de levure D-glucose Chloramphnicol Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 6.6 0.2 5.0 20.0 0.1 9-18* 1000 g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

6 6.1

Mode opratoire Inoculation des botes de Petri Dposer l'aide d'une pipette 0,1 ml de lchantillon, de la solution mre ou des dilutions correspondantes sur les botes de glose lextrait de levure-glucose-chloramphnicol, pralablement sches et ltaler sur toute la surface de la glose.

6.2

Incubation Incuber en atmosphre arobie pendant 4 jours 25 1C.

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56 Microbiologie

E.10

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des levures prsumes, les colonies de couleur blanche crme ou occasionnellement pigmentes en rouge, mates brillantes, bord lisse.

6.4

Confirmation La confirmation se fait par apprciation microscopique (prparation directe) du matriel cellulaire des diffrents types de colonies suspectes identifies sur les botes de Petri. Les caractristiques morphologiques observes doivent s'accorder avec les critres fixs dans le paragraphe 3 Dfinitions .

6.5

Points critiques Il est recommand de contrler les botes aprs 3 jours. Au cas o des colonies de moisissures gnantes sont mises en vidence, procder une valuation anticipe. Tenir compte ce moment du mode calcul et de l'expression des rsultats prescrits dans le chapitre C 4.2b. Les botes doivent tre protges dun desschement pendant lincubation.

Evaluation quantitative Le mode de calcul est dcrit la section C Evaluation des dnombrements . Pour une bote de 9 cm, la limite suprieure du nombre total de colonies nt est identique celle du nombre de colonies spcifiques ns (nt = ns) = 150 ufc.

Expression des rsultats Les comptages sont exprims en nombre dunits de levures formant des colonies par g dchantillon, ce nombre tant obtenu par lvaluation quantitative.

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E.10

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande pour le contrle de la croissance est Saccharomyces cerevisiae NCYC 79.

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: La mthode est limite exclusivement aux dnombrement des levures. La technique densemencement en surface est utilise (2). La dure d'incubation est de 4 jours (2).

11

Bibliographie 1. Anonyme (1987): Microbiologie Directives gnrales pour le dnombrement des levures et moisissures Technique par comptage des colonies 25C. Norme ISO 7954; premire dition 1987-11-01; Organisation internationale de normalisation. Engel G. und Rsch N. (1999): Untersuchungen zur Keimzahlbestimmung von Hefen und Schimmelpilzen in Frischkse und Rohmilch. Kieler milchwirtschaftliche Forschungsberichte 51: 145-154.

2.

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E.20

E.20 Recherche des Salmonella spp.


Technique denrichissement en deux tapes avec milieux slectifs

Objectifs Cette mthode dcrit la recherche des Salmonella spp. et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions Les Salmonella spp. sont des bactries gram-ngatives, anarobies facultatives, en forme de btonnets, qui forment des colonies typiques sur les milieux slectifs solides mentionns ci-dessous.

Principe Incuber des quantits connues dchantillon pour essai dans un milieu liquide non slectif. Puis effectuer une deuxime tape denrichissement dans deux milieux liquides slectifs. Aprs incubation, ensemencer deux milieux slectifs solides et les incuber. Soumettre alors les colonies de Salmonella prsumes des examens biochimiques.

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E.20

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance des salmonelles; des tests de diffrenciation disponibles dans le commerce.

5.2

Eau peptone tamponne (Buffered Peptone Water ou BPW) Peptone de viande, pepsique NaCl Na2HPO4.12H2O (358.14 g/mol) KH2PO4 (136.09 g/mol) Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.0 0.2 10.0 5.0 9.0 1.5 1000 g g g g ml

5.3 5.3.1

Bouillon de Rappaport-Vassiliadis Soya (RVS) Milieu de base Peptone de soja, papanique NaCl KH2PO4 (136.09 g/mol) Eau 5.0 8.0 1.6 1000 g g g ml

Dissoudre 70-80C, prparer au moment de l'emploi 5.3.2 Supplments MgCl2.6H2O (203.31 g/mol) Eau Oxalate de vert de malachite Eau 400 1000 0.4 100 g ml g ml

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56 Microbiologie

E.20

5.3.3

Milieu complet Immdiatement avant lemploi, ajouter les supplments au milieu de base (5.3.1) dans les proportions suivantes: Solution de MgCl2 Solution de vert de malachite pH: 5.2 0.2 100 10 ml ml

Rpartir dans des tubes raison de 10 ml par tube et striliser 15 min 115C.

5.4 5.4.1

Bouillon au ttrathionate (TB) Milieu de base Peptone de casine, pancratique Sels biliaires CaCO3 (100.09 g/mol) Na2S2O3.5H2O (248.18 g/mol) Eau 5.0 1.0 10.0 30.0 1000 g g g g ml

Dissoudre et porter bullition, refroidir 45C. 5.4.2 Supplments KI I2 Eau Vert brillant Eau 5.4.3 Milieu complet Immdiatement avant lemploi, ajouter les supplments au milieu de base (5.4.1) dans les proportions suivantes: Solution iodo-iodure Solution de vert brillant pH: 8.4 0.2 20 9.5 ml ml 25.0 30.0 100 0.1 100 g g ml g ml

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E.20

5.5 5.5.1

Glose au vert brillant (Brilliant Green Agar ou BGA) Milieu de base Extrait de viande (buf) Peptone de casine, pancratique Extrait de levure Na2HPO4.2H2O (177.99 g/mol) NaH2PO4 (119.98 g/mol) Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 5.0 10.0 3.0 1.0 0.6 9-18* 900 g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

5.5.2

Supplments Lactose Saccharose Rouge de phnol Eau Vert brillant Eau 10.0 10.0 0.09 100 0.5 100 g g g ml g ml

5.5.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.5.1) 45-50C. Striliser les supplments par filtration et les ajouter dans les proportions suivantes: Solution de sucre et rouge de phnol Solution de vert brillant pH: 7.0 0.2 100 1 ml ml

5.6

Deuxime glose slective Il faut utiliser une deuxime glose slective en plus du BGA. Le choix est par principe laiss au laboratoire danalyse. Le milieu de culture doit toutefois remplir les critres suivants: avoir d'autres supplments slectifs que le vert brillant; tre moins slectif que le BGA; avoir un autre principe de dtection que la fermentation du lactose. La prparation doit se faire conformment aux indications du fabricant.

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E.20

5.7

Glose nutritive (Nutrient Agar) Extrait de viande (buf) Peptone de viande, pepsique Agar-agar Eau * selon les indications du fabricant Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.0 0.2 3.0 5.0 9-18* 1000 g g g ml

5.8

Glose TSI (Triple Sugar Iron Agar) Extrait de viande (buf) Extrait de levure Peptone de viande, pepsique NaCl (58.44 g/mol) Lactose Saccharose Glucose Citrate de fer (III) ammoniacal Na2S2O3.5H2O (248.18 g/mol) Rouge de phnol Agar-agar Eau 3.0 3.0 20.0 5.0 10.0 10.0 1.0 0.3 0.3 0.024 9-18* 1000 g g g g g g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant Dissoudre, rpartir dans des tubes essai raison de 10 ml part tube et striliser 15 min 121C. Laisser refroidir en glose incline avec un culot denviron 2,5 cm. pH: 7.4 0.2 5.9 5.9.1 Glose lure Milieu de base Peptone de viande, pepsique Glucose NaCl (58.44 g/mol) KH2PO4 (136.09 g/mol) Rouge de phnol Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 1.0 1.0 5.0 2.0 0.012 9-18* 950 g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

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E.20

5.9.2

Supplment Ure Eau 20.0 50 g ml

5.9.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.9.1) 45-50C. Striliser le supplment par filtration et lajouter. Rpartir dans des tubes essai raison de 10 ml par tube et laisser refroidir en glose incline avec un culot denviron 2,5 cm. pH: 6.8 0.2

5.10

Bouillon de lysine-dcarboxylase Monohydrochlorure de L-lysine Extrait de levure Glucose Pourpre de bromocrsol Eau 5.0 3.0 1.0 0.015 1000 g g g g ml

Dissoudre, rpartir dans des tubes essai raison de 5 ml par tube et striliser 15 min 121C. pH: 6.8 0.2

5.11

Srum polyvalent agglutinant de type O.

6 6.1 6.1.1

Mode opratoire Enrichissement Enrichissement non slectif Homogniser lchantillon dans le stomacher avec une quantit 9 fois plus leve de BPW pendant 1-2 min. Incuber la suspension pendant 16-20 h 37 1C en atmosphre arobie.

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E.20

6.1.2

Enrichissement slectif Pipetter 0,1 ml du pr-enrichissement dans 10 ml de RVS et incuber 18-24 h 42 1C en atmosphre arobie. Pipetter 1 ml du pr-enrichissement dans 10 ml de TB et incuber 18-24 h 42 1C en atmosphre arobie.

6.2

Isolement Ensemencer une bote de BGA et une deuxime glose slective (cf. paragraphe 5.6) partir des deux enrichissements slectifs de faon permettre le dveloppement de colonies bien isoles. Incuber en atmosphre arobie pendant 24-48 h 37 1C.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des Salmonella spp. prsumes: BGA: de petites colonies roses-blanches, opaques ou lgrement transparentes, brillantes et entoures dun halo rouge lumineux. Deuxime glose slective: selon les indications du fabricant.

6.4

Confirmation Repiquer 5 colonies prsumes provenant du BGA, respectivement de la deuxime glose slective sur la glose nutritive, les incuber 18-24 h 37 1C en atmosphre arobie, puis les diffrencier comme suit (tableau 1): Fermentation du glucose, du saccharose et du lactose ainsi que formation de sulfure de fer: ensemencer la surface et le culot (par piqre) du TSI avec un fil droit. Incuber en atmosphre arobie pendant 18-24 h 37 1C. Une coloration jaune de la surface incline indique la fermentation du lactose et/ou du saccharose, une surface incline rouge ou de couleur inchange indique des ractions lactose-ngatives et/ou saccharose-ngatives. Une coloration jaune de la glose profonde indique la fermentation du glucose, une glose profonde rouge ou de couleur inchange indique une raction glucose-ngative. La formation de gaz dans la fermentation de glucose est indique par lapparition de bulles ou de fissures dans la glose. Une coloration noire de la glose profonde indique la formation de sulfure de fer. Recherche de lurase: ensemencer en surface la glose lure. Incuber en atmosphre arobie pendant 18-24 h 37 1C. Lactivit de l'urase est indique par le virage du rouge de phnol au rose.

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E.20

Recherche de la lysine-dcarboxylase: Ensemencer le bouillon de lysinedcarboxylase. Incuber en atmosphre arobie pendant 18-24 h 37 1C. Lactivit de la lysine-dcarboxylase est indique par le virage du pourpre de bromocrsol au violet fonc. Confirmation srologique: dposer sur une lame propre, une goutte d'antisrum polyvalent de type O et une goutte d'eau physiologique, mlanger chacune d'entre elles avec les cellules d'une colonie et observer lagglutination. Lagglutination avec l'antisrum polyvalent de type O est typique des salmonelles. Les souches autoagglutinantes (agglutination dans l'eau physiologique) sont plutt rares. Tableau 1: Proprits biochimiques des Salmonella spp. (1) Raction positive (en %) 100 92 1 1 92 1 95

Fermentation du glucose Formation de gaz dans la fermentation du glucose Fermentation du lactose Fermentation du saccharose Formation de sulfure de fer Urase Lysine-dcarboxylase

6.5

Points critiques Aucun

Evaluation quantitative Aucune

Expression des rsultats Le rsultat indique la prsence ou labsence de Salmonella spp. par quantit pese dchantillon.

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E.20

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande est la souche Salmonella typhimurium ATCC 14028.

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: Le bouillon au ttrathionate est utilis la place du bouillon au ttrathionate et la novobiocine Lincubation du bouillon denrichissement se fait 42C et non 41,5C Toutes les ractions de confirmation cites dans la mthode normalise ne sont pas effectues. Il est recommand dutiliser les tests de diffrenciation disponibles dans le commerce.

11

Bibliographie 1. Anonyme (1998): Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour la recherche des Salmonella. Norme ISO 6579; revision de l'ISO 6579:1993; Organisation internationale de normalisation.

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E.21

E.21 Recherche de Listeria monocytogenes


Technique denrichissement en deux tapes avec milieux slectifs

Objectifs Cette mthode dcrit la recherche de Listeria (L.) monocytogenes et sert de mthode de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaine dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions L. monocytogenes forme des colonies typiques dans les conditions dfinies dans cette mthode. Ces bactries gram-positives, en forme de btonnets, produisent une hmolyse complte en prsence de Staphylococcus aureus et prsentent des ractions biochimiques typiques.

Principe Incuber des quantits connues dchantillon pour essai dans un milieu slectif liquide. Puis effectuer une deuxime tape denrichissement dans un deuxime milieu slectif liquide. Aprs incubation, ensemencer deux milieux slectifs solides et les incuber. Soumettre alors les colonies de Listeria prsumes des examens biochimiques.

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E.21

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance de Listeria monocytogenes; des tests de diffrenciation disponibles dans le commerce.

5.2 5.2.1

Bouillon Demi Fraser Milieu de base Peptone de viande, pepsique Peptone de casine, pancratique Poudre dextrait de viande Extrait de levure NaCl KH2PO4 (136.09 g/mol) Na2HPO4 . 2H2O (177.99 g/mol) Esculine Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 5.0 5.0 5.0 5.0 20.0 1.35 12.0 1.0 1000 g g g g g g g g ml

5.2.2

Supplments LiCl (42.39 g/mol) Eau 3.0 10 g ml g ml g ml g ml

Sel sodique de lacide nalidixique 0.1 0.05 mol/L NaOH 10 Chauffer lgrement jusqu dissolution Chlorhydrade dacriflavine Eau Citrate de fer (III) ammoniacal Eau 0.25 100 5.0 100

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56 Microbiologie

E.21

5.2.3

Milieu complet Immdiatement avant lemploi, striliser les supplments par filtration et les ajouter au milieu de base (5.2.1) dans les proportions suivantes: Solution de LiCl Solution dacide nalidixique Solution de chlorhydrate dacriflavine Solution de citrate de fer (III) ammoniacal pH: 7.2 0.2 10 1 5 10 ml ml ml ml

5.3 5.3.1

Bouillon Fraser Milieu de base Composition et prparation: cf. 5.2.1

5.3.2

Supplments LiCl (42.39 g/mol) Eau 3.0 10 g ml g ml g ml g ml

Sel sodique de lacide nalidixique 0.2 0.05 mol/l NaOH 10 Chauffer lgrement jusqu dissolution Chlorhydrate dacriflavine Eau Citrate de fer (III) ammoniacal Eau 5.3.3 Milieu complet 0.5 100 5.0 100

Immdiatement avant lemploi, striliser les supplments par filtration et les ajouter au milieu de base (5.2.1) dans les proportions suivantes: Solution de LiCl 10 Solution dacide nalidixique 1 Solution de chlorhydrate dacriflavine 5 Solution de citrate de fer (III) ammoniacal 10 pH: 7.2 0.2 ml ml ml ml

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E.21

5.4 5.4.1

Glose ALOA selon Ottaviani et Agosti (ALOA) (1) Milieu de base Digestat enzymatique de tissus animaux 18.0 Digestat enzymatique de casine 6.0 Extrait de levures 10.0 Pyruvate de Sodium 2.0 D-Glucose 2.0 Glycerophosphate de Magnesium (195.36 g/mol) 1.0 MgSO4 (120.37 g/mol) 0.5 NaCl 5.0 LiCl (42.39 g/mol) 10.0 Na2HPO4 (141.96 g/mol) 2.5 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-glucopyranoside (408.6 g/mol) 0.05 Agar 12-18* Eau 930** g g g g g g g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant ** 925 ml si on utilise lAmphotricine B en lieu et place de la Cycloheximide.

Dissoudre et striliser 15 min 121C. 5.4.2 Supplments Sel de Sodium de lacide nalidixique 0.02 Eau 5.0 Ceftazidime 0.02 Eau 5.0 Sulfate de polymyxine B 76700 Cycloheximide 0.05 Ethanol 2.5 Eau 2.5 Diluer dabord la cycloheximide dans lthanol Ou en lieu et place de la cycloheximide : Amphotricine-B 0.01 HCl 1 mol 2.5 Dimthylformamide 7.5 Diluer lamphotricine dans lHCl/Dmf Supplment denrichissement L--Phosphatidylinositol Eau 2.0 50.0

g ml g ml U g ml ml

g ml ml

g ml

Dissoudre (env. 30 min) et striliser 15 min 121C

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E.21

5.4.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.4.1) 45-50C. Striliser le supplment par filtration et lajouter. Solution dacide nalidixique 5 Solution de ceftazidime 5 Solution de Polymyxine-B 5 Solution de cycloheximide 5 Ou en lieu et place de la cycloheximide : Amphotricine-B 10 Supplment denrichissement 50 pH: 7.2 0.2 ml ml ml ml ml ml

5.5

Deuxime glose slective En plus du milieu ALOA, une deuxime glose slective doit tre utilise. Le choix de cette glose est de la comptence du laboratoire. La prparation de cette glose doit respecter les indications du fabricant.

5.6 5.6.1

Glose au sang (Blood Agar) Milieu de base Glose Columbia Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. 39.0 950 g ml

5.6.2

Supplment Sang de mouton strile dfibrin

50

ml

5.6.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.6.1) 45-50C. Ajouter le supplment. pH: 7.2 0.2

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E.21

5.7 5.7.1

Bouillon L-rhamnose (LRB) Milieu de base Peptone de viande, pepsique Extrait de viande NaCl Pourpre de bromocrsol Eau 10.0 1.0 5.0 0.02 1000 g g g g ml

Dissoudre, rpartir dans des tubes raison de 4,5 ml par tube et striliser 15 min 121C.

5.7.2

Supplment L-rhamnose Eau 5.0 100 g ml

5.7.3

Milieu complet Laisser refroidir le milieu de base (5.7.1). Striliser le supplment par filtration et lajouter: Milieu de base Solution de L-rhamnose pH: 6.8 0.2 4.5 0.5 ml ml

5.8 5.8.1

Bouillon mthyl--D-Mannopyrannoside (MMP-Broth) Milieu de base Composition et prparation: cf. 5.7.1

5.8.2

Supplment Mthyl--D-mannopyrannoside Eau 5.0 100 g ml

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E.21

5.8.3

Milieu complet Laisser refroidir le milieu de base (5.8.1). Striliser le supplment par filtration et lajouter: Milieu de base Solution de mthyl--D-mannopyrannoside pH: 6.8 0.2 4.5 0.5 ml ml

6 6.1

Mode opratoire Enrichissement Homogniser lchantillon avec une quantit 9 fois plus leve de bouillon Demi Fraser dans le stomacher pendant 1-2 min (dilution 1:10). Incuber la suspension pendant 18-24 h 30 1C en atmosphre arobie. Bien agiter, prlever 0,1 ml et l'ajouter 10 ml de bouillon Fraser. Incuber en atmosphre arobie pendant 18-24 h 30 1C.

6.2

Isolement Ensemencer le milieu de culture ALOA provenant du deuxime enrichissement de faon permettre le dveloppement de colonies bien isoles. Incuber pendant 24-48 h, (cf 5.5 points critiques ) 37 1C: Procder de la mme faon pour le deuxime milieu slectif (5.5) en respectant les conditions dincubation.

6.3

Evaluation et apprciation Sont considres comme des Listeria spp. prsumes: Glose ALOA: des colonies bleu-vert de 1 1,5 mm de diamtre, entoures dun halo opaque. Deuxime glose slectives : voir les indications du fabricant.

6.4

Confirmation Repiquer respectivement 5 colonies prsumes de la glose ALOA et du deuxime milieu slectif sur la glose au sang, les incuber 18-24 h 37 1C en atmosphre arobie et les diffrencier comme suit: Coloration de Gram: les Listeria spp. sont des btonnets ou coccobacilles gram-positifs (longueur 0,5 2 m).

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E.21

Hmolyse: L. monocytogenes, L. seeligeri et L. ivanovii forment des hmolysines qui lysent en totalit ou en partie les rythrocytes de certaines espces animales. Cette hmolyse est complte, cela signifie quil apparat un halo incolore et transparent autour des colonies (-hmolyse). Ce halo peut tre trs faible ou peine visible, surtout en prsence de L. monocytogenes et de L. seeligeri. Lhmolyse nest souvent visible que lorsquon retire une colonie avec lanse boucle. Test de CAMP: On obtient une accentuation de lhmolyse avec le test de CAMP,. L. monocytogenes et L. seeligeri ont la proprit daccentuer lhmolyse partielle de Staphylococcus aureus, ce qui conduit une hmolyse complte et rapide. Ralisation: Etirer une souche de Staphylococcus aureus -hmolytique par une large strie en travers dune bote de glose au sang et inoculer les colonies prsumes perpendiculairement la culture prcdente partir de la priphrie de telle sorte que les stries sarrtent juste avant celles de Staphylococcus aureus (fig. 1). Incuber pendant 18-24 h en atmosphre arobie 37 1C. Fermentation du L-rhamnose et du mthyl--D-mannopyrannoside: ensemencer simultanment des tubes essai remplis de LRB et de MMP avec des colonies hmolytiques et CAMP-positives et les incuber 18-24 h pendant 37 1C. Le L. monocytogenes fermente aussi bien le L-rhamnose que le MMP, ce qui entrane un virage dindicateur du violet au jaune. L. seeligeri linverse, ne fermente ni le Lrhamnose ni le MMP.

Staphylococcus aureus

L. innocua pas dhmolyse pas de phnomne de CAMP

L. monocytogenes /L. seeligeri troite bande dhmolyse complte, phnomne de CAMP

Bande -hmolytique de Staphylococcus aureus

L. ivanovii : nette hmolyse complte pas de phnomne de CAMP

Figure 1: Ractions du test de CAMP de Listeria spp.

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E.21

Tableau 1: Diffrenciation biochimique des Listeria spp. -Hmolyse Raction de CAMP + + Fermentation du L-rhamnose + v v Fermentation du MMP + + +

L. monocytogenes L. seeligeri L. innocua L. ivanovii L. welshimeri v: raction variable

+ + + -

6.5

Points critiques Glose ALOA :en cas de faible croissance aprs 24 h, incuber les botes pour 24 h supplmentaires.

Evaluation quantitative Aucune

Expression des rsultats Le rsultat indique la prsence ou labsence de L. monocytogenes par quantit pese dchantillon.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande est la souche L. monocytogenes ATCC 19112 et pour la ralisation du test de CAMP, la souche Staphylococcus aureus ATCC 25923.

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E.21

10

Statut Cette mthode correspond un projet de mthode internationale normalise (2). Pour les ractions de confirmation, le test de fermentation du MMP est utilis la place du test de fermentation du xylose et le contrle de la raction de la catalase est supprim.

11 1. 2.

Bibliographie 1. Ottaviani, F., Ottaviani, M., Agosti, M. (1997) Esperienze su un agar selettivo e differenziale per Listeria monocytogenes. Industrie Alimentari, 36, luglio-agosto, 1-3. Anonym (2002): Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection and enumeration of L. monocytogenes Part 1: Detection method. ISO Norm 11290-1; revision of ISO 11290:1996; International Organization for Standardization.

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E.22

E.22 Recherche des Campylobacter spp. thermotolrants


Technique denrichissement avec milieu slectif

Objectifs Cette mthode dcrit la recherche des Campylobacter spp. thermotolrants et sert de rfrence pour le contrle des valeurs maximales dfinies dans le cadre de la surveillance des denres alimentaires.

Domaines dapplication Cette mthode sapplique aux denres alimentaires et aux objets usuels.

Dfinitions Les Campylobacter spp. thermotolrants sont des bacilles gram-ngatifs, microarophiles, oxydase-positifs, mobiles, fins, incurvs, de 1,5 5 m de longueur, qui forment des colonies typiques 42C sur la glose slective dcrite ci-dessous.

Principe Incuber des quantits connues dchantillon pour essai dans un milieu liquide slectif. Puis ensemencer un milieu slectif solide et lincuber. Soumettre les colonies de Campylobacter prsumes des examens microscopiques et biochimiques.

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E.22

5 5.1

Matriel et ractifs Composants de base Il est recommand dutiliser: des milieux dshydrats ou prts l'emploi disponibles dans le commerce; des produits chimiques qui prsentent au moins un degr de puret "pro analysi"; de leau exempte de substances risquant dinfluencer la croissance de Campylobacter spp.; des tests de diffrenciation disponibles dans le commerce.

5.2 5.2.1

Bouillon d'enrichissement de Campylobacter selon Preston (Campylobacter Enrichment Broth) (1) Milieu de base Extrait de viande 10.0 Peptone de viande, neutre 10.0 NaCl 5.0 Extrait de levure 6.0 Agar-agar 1.5 Eau 940 Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.5 0.2 g g g g g ml

5.2.2

Supplments a: Solution d'antibiotiques Polymyxine B Rifampicine Lactate de trimthoprime Cycloheximide Ethanol 95 % 5000 0.010 0.010 0.100 10 IE g g g ml

b: Sang de cheval lys Lyser du sang de cheval frais, par conglation puis dconglation. 5.2.3 Milieu complet Refroidir 940 ml de milieu de base (5.2.1) 45C. Ajouter 10 ml de supplment a strilis par filtration et 50 ml de supplment b. Remplir de milieu des tubes ou des flacons (voir 6.1) et laisser refroidir temprature ambiante.

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E.22

5.3 5.3.1

Glose slective de Campylobacter selon Karmali (1) Milieu de base (Columbia Agar) Peptone de viande, pepsique Amidon NaCl Charbon actif Agar-agar Eau Dissoudre et striliser 15 min 121C. pH: 7.4 0.2 23.0 1.0 5.0 4.0 9 18* 980 g g g g g ml

* conformment aux indications du fabricant

5.3.2

Supplments a: Solution d'antibiotiques Pyruvate de sodium Vancomycine Cfoprazone Cycloheximide Ethanol 95% b: Solution d'hmine Hmine Eau

0.2 0.04 0.064 0.2 20 0.32 100

g g g g ml g ml

5.3.3

Milieu complet Refroidir le milieu de base (5.3.1) 45-50C. Striliser les supplments par filtration et les ajouter dans des proportions de 10 ml au milieu.

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E.22

6 6.1 6.1.1

Mode opratoire Enrichissement Echantillon filtrable Filtrer lchantillon travers une membrane filtrante dont la taille des pores est de 0,45 m. Transfrer la membrane dans un tube essai rempli de bouillon d'enrichissement de Campylobacter (colonne liquide denviron 10 cm). Incuber en atmosphre arobie pendant 18-24 h 42 1C.

6.1.2

Echantillon non filtrable Peser l'chantillon dans un sachet Stomacher dont l'intrieur est spar en deux parties par une membrane. Ajouter le Campylobacter Enrichment Broth selon Preston raison de 2 fois le volume pes et homogniser 30 sec. Transfrer l'aide d'une pipette le filtrat dans 200 ml d'Enrichment Broth selon Preston (flacon de 250 ml) et incuber, bouchon non compltement viss, pendant 48 h 42 1C en atmosphre arobie.

6.2

Isolement Prlever au moyen d'une anse la culture plusieurs endroits sous la surface du liquide et l'taler de faon obtenir des colonies isoles sur la glose slective Karmali et une deuxime glose slective. Incuber pendant 48 h 42 1C en atmosphre microarophile (85% N2 + 10% CO2 + 5% O2). Les gloses suivantes peuvent tre utilises comme deuxime gloses slectives: Modified Butzler Agar, Skirrow Agar, Charcoal Cefoperazon Deoxycholat Agar ou Preston Agar.

6.3

Evaluation et apprciation Sur la glose Karmali, les colonies gristres, plates et brillantes qui ont tendance s'taler sont considres comme des Campylobacter spp. prsums.. Sur la glose Preston, les Campylobacter forment des colonies incolores gristres, brillantes et ont tendance s'taler le long de la strie. Sur les gloses Butzler et Skirrow, les colonies sont gristres bruntres. Des ractions de confirmation doivent tre ralises sur les colonies prsumes.

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E.22

6.4

Confirmation Effectuer le test de loxydase et une coloration de Gram sur 5 colonies prsumes. Tester la mobilit des cellules dans la solution peptone-sel (voir B 3.2) au microscope en contraste de phase. Les cellules Gram ngatives, oxydase positives et mobiles, avec une morphologie typique sont considres comme des Campylobacter thermotolrants.

6.5

Points critiques Les Campylobacter spp. sont sensibles loxygne et ne doivent donc tre soumis des conditions arobies que durant une courte dure. Scher les botes de gloses avant l'emploi afin d'liminer tout film d'eau sur la surface.

Evaluation quantitative Aucune

Expression des rsultats Le rsultat indique la prsence ou labsence de Campylobacter spp. thermotolrants par quantit pese dchantillon.

Contrle de qualit Les mesures gnrales dassurance qualit sappliquent. La souche tmoin recommande pour la vrification des milieux slectifs et des tests de confirmation est la souche Campylobacter jejuni ATCC 29428.

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E.22

10

Statut Cette mthode correspond une mthode internationale normalise (1) comportant les modifications suivantes: Il n'est procd aucun enrichissement spcifique aux cellules stresses. le milieu d'enrichissement semi-solide contient 0.15% et non 0.1% d'agar-agar. le milieu d'enrichissement semi-solide permet une incubation en milieu arobie. le nombre de tests de confirmation a t rduit.

11

Bibliographie 1. Anonyme (1995): Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour la recherche des Campylobacter thermotolrants. Norme ISO 10272; Organisation internationale de normalisation.

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