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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008

Organise
En Collaboration avec le Bureau de Liaison de lOMS Alger

NEUVIEME COURS NATIONAL DHYGIENE ET DE MICROBIOLOGIE DES ALIMENTS UNITE : MICROBIOLOGIE DES EAUX ET DES BOISSONS

du 03 au 14 Juin 2006
MANUEL DE TRAVAUX PRATIQUES DES EAUX

Responsable des Travaux Pratiques : Dr LEBRES IPA


Assistants : Mr Azizi Djamal Mr Boudjellab Badreddine Mr Toaouchichet Belkacem
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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008

SOMMAIRE Analyse des Eaux


Intitul
Recherche et Dnombrement des Microorganismes revivifiables. Mthode par comptage des colonies obtenues 30C, dans les eaux de forage. Recherche et Dnombrement des Microorganismes revivifiables. Mthode par comptage des colonies obtenues 22 et 37C, dans les eaux minrales embouteilles. Recherche et Dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli dans les eaux par filtration. Recherche et Dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli dans les eaux en milieu liquide. Recherche et Dnombrement des Entrocoques intestinaux et Streptocoques fcaux dans les eaux par filtration. Recherche et Dnombrement des Entrocoques intestinaux et Streptocoques fcaux dans les eaux en milieu liquide. Recherche et Dnombrement de Staphylocoques coagulase positive dans les eaux. Recherche et Dnombrement de Pseudomonas aeruginosa par filtration dans les eaux. Recherche et Dnombrement des Anarobies Sulfito-Rducteurs par filtration par comptage des colonies 44C dans les eaux Recherche des Salmonella dans les eaux par filtration. Recherche de Vibrion cholrique dans les eaux.

Codification
MO.MR.EA

Version
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Date
02 / 1 / 06

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MO.CTT.ML

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MO.ST.MS

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MO.ST.ML

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MO.SA.MS

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MO.PA.MS

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MO.ASR.MS

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MO.SL.MS MO.VC.MS

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LE PRELEVEMENT AU ROBINET ASEPTIE MAXIMUM FLAMBAGE - DESINFECTION EVACUATION DES PREMIERS LITRES DEBIT DE REMPLISSAGE VOLUME A PRELEVER

PUITS ET FORAGES CONNAITRE LA NAPPE CONNAITRE L'USAGE DE CES EAUX LE TRANSPORT TEMPERATURE MULTIPLICATION MORTALITE TEMPERATURE DE 4C DELAIS LES PLUS COURTS POSSIBLES EAUX EMBOUTEILLES LE DENOMBREMENT DOIT AVOIR LIEU DANS LES HEURES QUI SUIVENT L'EMBOUTEILLAGE

LES FLACONS NATURE VERRE FLACONS A USAGE UNIQUE STERILISATION PAR LA CHALEUR PAR L'OXYDE D'ETHYLENE PAR LES RAYONS GAMMA CONTROLE DE STERILITE STERILISATION EXTERIEURE NEUTRALISANTS THIOSULFATE DE SODIUM (Pastilles) EDTA
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Mode opratoire / Enregistrement


Code : MO.MR.EM

LOGO

Version : 00 Recherche et dnombrement des Microorganismes revivifiables 22 et 37C Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3 dans les eaux minrales embouteilles. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation.

Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5.

1. Objet et domaine dapplication.


Cette mthode consiste en la recherche et le dnombrement des microorganismes dans les eaux minrales embouteilles destins la consommation humaine par comptage des colonies 22 et 30C.

2. Dfinition.
Dans le sens de cette mthode, on e ntend par microorganismes : Bactries, Levures, Moisissures se dveloppant en arobiose, lorsque lessai est effectu selon la mthode spcifie.

3. Rfrentiels. Norme NF EN ISO 6222 : Dnombrement des micro organismes revivifiables :


comptage des colonies par ensemencement dans un milieu de culture nutritif glos. Norme NF V 08-010 : Rgles gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF EN ISO 6887-1 : Suspension mre et dilutions dcimales ; 1. rgles gnrales. Norme NF V 08-057-2 : Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

4. Mode Opratoire.
A partir de leau analyser (SM = 1) et/ou des dilutions dcimales 10 et 10 , porter aseptiquement 1 ml en double dans deux boites de Ptri vides, numrotes et prpares cet usage comme lindique le schma n2 ci-aprs. Complter ensuite avec environ 19 ml de glose TGEA fondue puis refroidie 45 2C. Le temps qui scoule entre le moment o lon a distribu linoculum dans la boite et celui o le milieu est coul ne doit pas excder 15 minutes. 4
-1 -2

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de 8 pour permettre linoculum de se mlanger la glose, sur une surface frache et horizontale. Laisser solidifier les boites sur paillasse, puis rajouter une deuxime couche denviron 5 ml de la mme glose ou de glose blanche. Cette double couche , a un rle protecteur contre les contaminations externes diverses. Les boites seront partages en deux sries distinctes : La premire srie sera incube 22 2C pendant 68 4 heures , La seconde srie sera incube 36 2C, pendant 44 4C heures.

5. Lecture et interprtation.
Les colonies de microorganismes revivifiables apparaissent en masse sous formes lenticulaires et bien distinctes. Retenir les boites contenant moins de 300 colonies, au niveau de deux dilutions successives. Il faut quune boite renferme au moins 15 colonies. Calculer ensuite la valeur du nombre N, de microorganismes revivifiables 22 2C part et celle du nombre N de microorganismes revivifiables 36 2C part, en tant que moyenne pondre, laide de lquation suivante :

c N= 1,1 x d
o : c : est la somme des colonies dnombres sur deux boites de dilutions successives retenues. d : est le taux de dilution correspondant la premire dilution. Arrondir les rsultats calculs deux chiffres significatifs aprs la virgule. Le rsultat final de microorganismes revivifiables dnombrs 22C et 37C par ml x deau est not par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multipli par 10 o x est la puissance approprie de 10. Exemple : Un dnombrement de microorganismes 37C a donn les rsultats suivants : -2 la premire dilution retenue 10 : on a 158 colonies. la seconde dilution retenue 10
-3

: on a 14 colonies.

c N= 1,1 x d =

158 + 14 = 1,1 x 10
-2

172 = 15636 0,011

Arrondir deux chiffres significatifs, soit 16000 ou mieux encore : 1,6 x 10 microorganismes par ml deau 22C ou 37C
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Mode opratoire / Enregistrement


Code : MO.MR.EM

LOGO

Version : 00 Recherche et dnombrement des Microorganismes revivifiables 22 et 37C Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3 dans les eaux minrales embouteilles.

1 ml

1ml

Eau Analyser 10
-1

10

-2

1 ml

1 ml

1 ml

Ajouter environ 19 ml de glose TGEA Laisser solidifier sur paillasse puis incuber : 22 2C, 68 4 heures 1 ml 1 ml 1 ml

Ajouter environ 19 ml de glose TGEA Laisser solidifier sur paillasse puis incuber : 36 2C, 44 4 heures Dnombrer les colonies lenticulaires ayant pouss en masse dans chacune des boites, puis calculer la valeur de N 22C puis celle de N 36C. Obligatoire Facultatif
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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Escherichia coli et des bactries Coliformes. Mthode par filtration.
1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinitions. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation. Code : MO.CTT.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire :

1. Objet et domaine dapplication.


Il sagit l dune mthode de rfrence qui consiste en la recherche et le dnombrement des Escherichia coli et des bactries Coliformes ventuellement prsents dans les eaux destines la consommation humaine, par comptage des colonies obtenues en milieu solide aprs 24 48 heures dincubation en arobiose 36 2C puis 42 2C. La prsente mthode est recommande pour les eaux peu contamines.

2. Dfinitions.
Au sens de cette mthode, on entend par Coliformes des bacilles Gram ngatifs, arobies ou anarobies facultatifs, non sporuls, ne possdant pas doxydase, capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production dacide et de gaz en 24 48 heures une temprature comprise entre 36 et 37C. Les Coliformes thermo tolrants ont les mmes proprits que les coliformes mais 42 2C. Les Escherichia coli sont des coliformes thermo tolrants ayant la particularit de produire de lindole partir du tryptophane prsent dans le milieu 42 2C.

3. Rfrentiels.
Norme NF EN ISO 9308 1 : Recherche et dnombrement des Escherichia coli et des bactries Coliformes partie 1. Mthode par filtration sur membrane. Norme NF T90-413 : Recherche et dnombrement des coliformes et des coliformes thermo tolrants. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP). Norme NF V 08-051 : Dnombrement des Coliformes par comptage des colonies, mthode de routine. Norme NF V 08-017 : Dnombrement des Coliformes fcaux et d'Escherichia coli (annexe NF V 08-015 et NF V 08-016). Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais. 7

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4. Mode opratoire.
La recherche des bactries coliformes par filtration sur membrane ncessite une prparation au pralable, qui se droule selon les tapes suivantes : Essai standard. Tout dabord, il faudrait striliser lentonnoir gradu en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse laide dun bec bunsen. Les refroidir tout de suite aprs, avec leau analyser si on en dispose en quantit suffisante ou bien avec de leau distille strile. Mettre en place de faon aseptique une membrane de porosit nominale de 0,45 entre la membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile. Fixer ce dispositif avec la pince correspondante. Dposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml deau analyser, selon les types deaux analyser, devant un bec bunsen. Actionner ensuite la pompe vide pour absorber leau travers la membrane. Retirer lentonnoir puis transfrer immdiatement et aseptiquement la membrane laide dune pince bouts arrondis strile, sur la surface dune plaque de glose TTC pralablement prpare. Cette dernire sera incube couvercle en bas 36 2C pendant 21 3 heures voire 44 4 heures et servira la recherche des bactries coliformes, suivie de lidentification biochimique des Escherichia coli. Essai rapide. Un deuxime test dit test rapide peut tre effectu paralllement lessai standard et dans les mmes conditions. Il consiste filtrer une seconde fois 100 250 ml deau analyser selon les types deaux analyser, devant un bec bunsen travers une seconde membrane qui sera place dans un premier temps sur une plaque de glose TSA la casine incuber couvercle en bas dabord 36 2C pendant 4 5 heures puis transfrer la membrane sur glose TBA enrichie en sels biliaires incuber 44 0,5C pendant 19 20 heures. Cette mthode sert la recherche slective des Escherichia coli.

5. Lecture et interprtation.
Essai standard. Aprs la priode dincubation spcifie, dnombrer les colonies caractristiques qui se prsentent sous forme de petites colonies lisses lgrement bombes contours rguliers et pigments en jaune orang ou en jaune (lactose positives). Repiquer de faon alatoire 5 10 colonies des fins de confirmation base sur le test loxydase dune part et la production dindole dautre part. Test loxydase. Pour les besoins de ce test, effectuer tout dabord un repiquage sur glose TSA la casine de 5 10 colonies, incuber 36 2C pendant 21 2 heures, puis effectuer le test de lune des faons suivantes : Imbiber un disque doxydase avec une goutte deau distille strile puis dposer une colonie caractristique. Verser 2 3 gouttes du ractif loxydase prpar extemporanment (Ttramthyl-p-phnylnediamine) sur un papier filtre puis taler dessus une partie de la culture. 8

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Dans les deux cas la raction positive est immdiate et se traduit par un virage au bleu violet fonc. Test lindole. Pour cela, transfrer chaque colonie caractristique sparment (5 10) dans un tube contenant 3 ml de bouillon au tryptophane. Bien triturer la colonie dans le milieu puis incuber ce dernier 44 0,5C pendant 21 3 heures puis rechercher la production dindole en ajoutant 2 3 gouttes du ractif de Kowacs. La prsence dune coloration rouge la surface du bouillon traduit la production dindole partir du tryptophane prsent dans le milieu. En conclusion, Est considre comme bactrie coliforme, toute colonie caractristique (jaune), dpourvue de lenzyme oxydase et non productrice dindole. Est considr comme bactrie Escherichia coli, toute colonie caractristique (rouge), dpourvue de lenzyme oxydase, mais productrice dindole 44C. Calculer ensuite la valeur a du nombre de bactries coliformes lactose positives part celle des Escherichia coli part ; le rsultat final sera exprim selon lquation mathmatique suivante :

b a= A
o :

b : nombre de colonies caractristiques prsumes dans la boite. A : nombre de colonies repiques. C : nombre total de colonies trouves dans la boite.

Essai rapide. Aprs la priode dincubation spcifie, transfrer la membrane sur un papier filtre imbib de ractif de Kowacs puis lirradier sous une lampe UV pendant 10 30 minutes. Sont considrs comme des Escherichia coli, les colonies qui prennent une coloration rouge : dnombrer. Le nombre d Escherichia coli sera rapport 100 ou 250 ml deau analyser.

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Formules des milieux de culture.

1. Glose lactose au TTC et lheptadcylsulfate de sodium : Milieu de base. Lactose 20 g Peptone 10 g Extrait de Levure 06 g Extrait de viande 05 g Bleu de bromothymol 0,05 g Agar agar 15 25 g / l Eau distille 1000 ml Strilisation 121C pendant 15 minutes, rpartition du milieu raison de 225 ml par falcon. pH final aprs strilisation 25C : 7,2 0,1 2. Solution TTC. Chlorure de 2,3,5-triphnylttrazolium (TTC) Eau distille strile 3. Solution dheptadcylsulfate de sodium. Heptadcylsulfate de sodium (Tergitol 72) Eau distille strile 4. Milieu complet. Milieu de base Solution TTC Solution dheptadcylsulfate de sodium 100 ml 05 ml 05 ml

0,05 g 100 ml

0,2 g 100 ml

Strilisation 121C pendant 15 minutes, rpartition du milieu raison de 225 ml par falcon. pH final aprs strilisation 25C : 7,2 0,1

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5. Bouillon au tryptophane. Digestat tryptique de casine L-Tryptophane Chlorure de sodium Eau distille

10 g 01 g 05 g 1000 ml

6. Glose tryptone au soja (TSA). Digestat tryptique de casine 15 g Peptone de soja 05 g Chlorure de sodium 05 g Agar agar 15 25 g / l Strilisation 121C pendant 15 minutes, rpartition du milieu raison de 225 ml par falcon. pH final aprs strilisation 25C : 7,2 0,1 7. Glose tryptone contenant des sels biliaires (TBA). Tryptone 20 g Sels biliaires 1,5 g Agar agar 15 25 g / l Eau distille 1000 ml Strilisation 121C pendant 15 minutes, rpartition du milieu raison de 225 ml par falcon. pH final aprs strilisation 25C : 7,2 0,1 8. Ractif lindole, essai rapide. p-Dimthylaminobenzaldhide 0,5 g Acide chlorhydrique, c(HCI) = 1 mol/l 100 ml Pour tre convenablement utilis, le ractif doit prsenter une coloration jaune clair. 9. Ractif loxydase. Ttramthyl-p-phnylnediamine 0,1 g Eau distille 10 ml Ce ractif nest pas stable, il convient de le prparer juste avant le test. Prendre des prcautions relatives la protection des yeux et de la peau.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Escherichia coli et des bactries Coliformes. Mthode par filtration.
Filtration de 250 ml deau Eau analyser Code : MO.CTT.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Entonnoir Membrane 0,45

Rampe de Filtration 3 postes

A Pompe

Essai standard

Essai rapide

Milieu TTC

Milieu digestat tryptique : TSA

36 2C 21 3 heures

36 2C 4 5 heures

Milieu digestat tryptique + Sels biliaires TBA 44 0,5C, 19 20 heures

TSA
36 2C 21 3 heures

B.Tryp
44 0,5C 21 3 heures

Tests Oxydase

Test lindole

Test lindole sur filtre 12

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli en milieu liquide.
1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinitions. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation. Code : MO.CTT.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 09 Page : 1 / 3

Sommaire :

1. Objet et domaine dapplication.


Cette mthode de routine, consiste en la recherche et le dnombrement des bactries coliformes, coliformes thermo tolrants et des Escherichia coli dans les eaux destines la consommation humaine, en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP).

2. Dfinitions.
Au sens de cette mthode, on entend par Coliformes des bacilles Gram ngatifs, arobies ou anarobies facultatifs, non sporuls, ne possdant pas doxydase, capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production dacide et de gaz en 24 48 heures une temprature comprise entre 36 et 37C. Les Coliformes thermo tolrants ont les mmes proprits que les coliformes mais 42 2C. Les Escherichia coli sont des coliformes thermo tolrants ayant la particularit de produire de lindole partir du tryptophane prsent dans le milieu 42 2C.

3. Rfrentiels.
Norme NF EN ISO 9308 1 : Recherche et dnombrement des Escherichia coli et des bactries Coliformes partie 1. Mthode par filtration sur membrane. Norme NF T90-413 : Recherche et dnombrement des coliformes et des coliformes thermo tolrants. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP). Norme NF V 08-051 : Dnombrement des Coliformes par comptage des colonies, mthode de routine. Norme NF V 08-017 : Dnombrement des Coliformes fcaux et d'Escherichia coli (annexe NF V 08-015 et NF V 08-016). Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais. 13

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4. Mode opratoire.
La recherche et le dnombrement des bactries coliformes, coliformes thermo tolrants et des Escherichia coli dans les eaux, en milieu liquide par la technique du NPP, se fait en deux tapes conscutives : le test de prsomption : rserv la recherche des Coliformes, le test de confirmation : rserv la recherche des Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli. Test de prsomption. A partir de leau analyser, porter aseptiquement : 50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu BCPL D/C muni dune cloche de Durham 5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL D/C muni dune cloche de Durham 5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL S/C muni dune cloche de Durham, comme lindique le schma n 2. Chassez lair ventuellement prsent dans les cloches de Durham et bien mlanger le milieu et linoculum. Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures. Lecture : Seront considrs comme positifs, les tubes prsentant la fois : un dgagement de gaz (suprieur au 1/10 de la hauteur de la cloche), un trouble microbien accompagn dun virage du milieu au jaune (ce qui constitue le tmoin de la fermentation du lactose prsent dans le milieu). Ces deux caractres tant tmoins de la fermentation du lactose dans les conditions opratoires dcrites. La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe. Illustration : Inoculum 1 X 50 ml 5 X 10 ml Test de prsomption + + + + + + Nombre Caractristique 1

5 X 1 ml

Le nombre caractristique est donc 132 ; ce qui correspond sur la table NPP au nombre 14. On considre alors quil y a 14 Coliformes par 100 ml deau analyser. 14

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Test de confirmation. Le test de confirmation est bas sur la recherche de Coliformes thermo tolrants parmi lesquels on redoute surtout la prsence dEscherichia coli. Les coliformes thermo tolrants ont les mmes proprits de fermentation que les coliformes mais 44C. Escherichia coli est un coliforme thermo tolrant qui entre autre : produit de lindole partir du tryptophane prsent dans le milieu 44C, donne un rsultat positif lessai au rouge de mthyl, ne produit pas de lacthyl mthyl carbinol, nutilise pas le citrate comme source unique de carbone. Les tubes de BCPL trouvs positifs lors du dnombrement des Coliformes feront lobjet dun repiquage laide dune se boucle dans tube contenant le milieu Schubert muni dune cloche de Durham, comme lindique le schma n3. Chasser lair ventuellement prsent dans les Cloches de Durham et bien mlanger le milieu et linoculum. Lincubation se fait cette fois-ci au bain marie 44C pendant 24 heures. Lecture : Seront considrs comme positifs, les tubes prsentant la fois : un dgagement gazeux, et un anneau rouge en surface, tmoin de la production dindole par Escherichia coli aprs adjonction de 2 3 gouttes du ractif de Kowacs. La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table du NPP en tenant compte du fait que Escherichia Coli est la fois producteur de gaz et dindole 44C. Illustration En reprenant lexemple prcdent relatif au dnombrement des Coliformes, cela suppose que nous avons 6 tubes repiquer savoir : le flacon de BCPL D/C, 3 tubes sur 5 de BCPL D/C, et 2 tubes sur 5 de BCPL S/C. Inoculum Test de prsomption + + + + + + Nombre Caractristique 1 Test de confirmation Gaz Indole + + + + + + Nombre Caractristique 1

1 X 50 ml 5 X 10 ml

5 X 1 ml

+ 2

+ + 1

Tableau Rcapitulatif 15

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Coliformes fcaux est donc 111 , ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 5. Le rsultat final sera donc de : 14 Coliformes totaux dans 100 ml deau analyser 5 Coliformes fcaux dans 100 ml deau analyser

Remarque : Etant donn que les Coliformes fcaux font partie des Coliformes totaux, il est pratiquement impossible de trouver plus de Coliformes fcaux que de Coliformes totaux.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli en milieu liquide.
Code : MO.CTT.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 09 Page : 1 / 3

Eau Analyser

Test de prsomption

1 X 50 ml

5 X 10 ml

5 X 1 ml

BCPL D/C

BCPL D/C

BCPL S/C

37C, 24 48 heures

+
1

+ +
3

+ +

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolrants et Escherichia coli en milieu liquide. Test de confirmation
Code : MO.CTT.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 09 Page : 1 / 3

Repiquage sur milieu Schubert + cloche

Incuber 44C, 24 heures

Ajouter 2 3 gouttes de ractif de Kowacs par tube

++ 1

++ +1

--

++ +1
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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Entrocoques intestinaux. Partie 2 : mthode par filtration sur membrane.
1. Objet et domaine dapplication. 2. Dfinition. 3. Rfrentiels. 4. Mode opratoire. 5. Lecture et interprtation 1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode de rfrence, consiste en la recherche et le dnombrement des entrocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe D de la classification de Lance Field, ou encore Streptocoques fcaux dans les eaux destines la consommation humaine, par filtration sur membrane. 2. Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par entrocoques intestinaux des bactries qui se prsentent sous forme de cocci Gram positive, sphriques ou ovodes formant des chanettes, ne possdant pas de catalase mais possdant lantigne du groupe D. Ils sont capables de se dvelopper en 24 48 heures 37C sur un milieu slectif lazoture de sodium en donnant des colonies caractristiques rduisant le TTC et qui de plus hydrolysent lesculine en 2 heures 44C aprs repiquage dune colonie sur une glose bilie lesculine et lazoture. 3. Rfrentiels. Norme ISO 7899- 2 et Norme NF T 90-416. Recherche et dnombrement des entrocoques intestinaux. Partie 2 mthode par filtration sur membrane. Norme NF T 90-411. Recherche et dnombrement des Streptocoques du groupe D. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP). Norme NF V 08-051 : Dnombrement des Coliformes par comptage des colonies, mthode de routine. Norme NF V 08-017 : Dnombrement des Coliformes fcaux et d'Escherichia coli (annexe NF V 08-015 et NF V 08-016). Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais. Code : MO.SGD.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Mode opratoire. La recherche des entrocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe D par filtration sur membrane ncessite une prparation au pralable, qui se droule selon les tapes suivantes : Tout dabord, il faudrait striliser lentonnoir gradu en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse laide dun bec bunsen. Les refroidir tout de suite aprs, avec leau analyser si on en dispose en quantit suffisante ou bien avec de leau distille strile. Mettre en place de faon aseptique une membrane de porosit nominale de 0,45 entre la membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile. Fixer ce dispositif avec la pince correspondante. Dposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml deau analyser, selon les types deaux analyser, devant un bec bunsen. Actionner ensuite la pompe vide pour absorber leau travers la membrane. Retirer lentonnoir puis transfrer immdiatement et aseptiquement la membrane laide dune pince bouts arrondis strile, la surface dune plaque de glose SLANETZ et BARTLEY pralablement prpare. Cette dernire sera incube couvercle en bas 36 2C pendant 44 4 heures.

5. Lecture et interprtation Aprs la priode dincubation spcifie, les entrocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe D apparaissent sous forme de petites colonies lisses lgrement bombes contours rguliers et pigmentes en rouge, marron ou rose. Transfrer aseptiquement la membrane du milieu de Slanetz et Bartley sur une plaque de glose Bile esculine azoture (BEA) prchauffe pralablement 44C. Cette dernire sera incube son tour 44 0,5C pendant 2 heures. Les colonies caractristiques prennent alors une coloration noire traduisant ainsi lhydrolyse de lesculine prsente dans le milieu. Compter le nombre de colonies et le rapporter 100 ou 250 ml deau analyser.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Formules des milieux de culture.

1. Milieu de SLANETZ et BARTLEY. Milieu de base. Tryptose 20,0 g Extrait de Levure 05,0 g Glucose 02,0 g Hydrognophosphate dipotassique (K 2HPO4) 04,0 g Azoture de Sodium (NaN3) 0,4 g Agar Agar 08 18 g Eau distille 1000 ml Dissoudre les ingrdients dans leau bouillante jusqu dissolution complte. 2. Solution TTC Chlorure de 2,3,5-triphnylttrazolium 01 g Eau 100 ml Dissoudre lindicateur dans leau par agitation. Striliser par filtration 0,2 . Milieu Complet. Milieu de base Solution de TTC

3.

1000 ml 10 ml

Strilisation 121C pendant 15 minutes, rpartition du milieu raison de 225 ml par falcon. pH final aprs strilisation 25C : 7,2 0,1 Aprs refroidissement 50 ou 60C, ajouter la solution TTC. Ajuster si ncessaire le pH laide dune solution de carbonate de sodium (100g/l) ou dhydroxyde de sodium (40g/l) ou dacide chlorhydrique (36,5g/l). Les boites coules peuvent tre gardes au rfrigrateur pendant 2 semaines. 4. Glose la Bile, lEsculine et lAzoture. Tryptone Peptone Extrait de levure Bile de buf dshydrate Chlorure de sodium (NaCl) Esculine Citrate dammonium ferrique Azoture de sodium (NaN3) Agar Agar Eau 17,0 g 03,0 g 05,0 g 10,0 g 05,0 g 01,0 g 0,5 g 0,15 g 08 10 g 1000 ml

Strilisation 121C pendant 15 minutes, rpartition du milieu raison de 225 ml par falcon. pH final aprs strilisation 25C : 7,2 0,1

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008

Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Entrocoques intestinaux. Partie 2 : mthode par filtration sur membrane.
Code : MO.SGD.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Filtration de 250 ml deau Eau Analyser

Entonnoir Membrane 0,45

Pompe

Rampe de Filtration 3 postes

Glose SLANETZ et BARTLEY 36 2C, 44 4 heures (en cas de colonies caractristiques)

Glose Bile, Esculine, Azoture.


44 0,5C, 2 heures

Compter le nombre de colonies caractristiques et le rapporter 100 ou 250 ml deau analyser.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Entrocoques intestinaux. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation. Code : MO.SGD.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire :

1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode de rfrence, consiste en la recherche et le dnombrement des entrocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe D de la classification de Lance Field, ou encore Streptocoques fcaux dans les eaux destines la consommation humaine, par filtration sur membrane. 2. Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par entrocoques intestinaux des bactries qui se prsentent sous forme de cocci Gram positive, sphriques ou ovodes formant des chanettes, ne possdant pas de catalase mais possdant lantigne du groupe D. Ils sont capables de se dvelopper en 24 48 heures 37C sur un milieu slectif lazoture de sodium en donnant des colonies caractristiques rduisant le TTC et qui de plus hydrolysent lesculine en 2 heures 44C aprs repiquage dune colonie sur une glose bilie lesculine et lazoture. 3. Rfrentiels. Norme NF T 90-411. Recherche et dnombrement des Streptocoques du groupe D. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP). Norme ISO 7899- 2 et Norme NF T 90-416. Recherche et dnombrement des entrocoques intestinaux. Partie 2 mthode par filtration sur membrane. Norme NF V 08-051 : Dnombrement des Coliformes par comptage des colonies, mthode de routine. Norme NF V 08-017 : Dnombrement des Coliformes fcaux et d'Escherichia coli (annexe NF V 08-015 et NF V 08-016). Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Mode opratoire. La recherche et le dnombrement des Streptocoques du groupe D dans les eaux, en milieu liquide par la technique du NPP, se fait en deux tapes conscutives : le test de prsomption : rserv la recherche prsomptive des Streptocoques. le test de confirmation : rserv la confirmation relle des Streptocoques du groupe D . Test de prsomption. A partir de leau analyser, porter aseptiquement : 50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu ROTHE D/C. 5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE D/C 5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE S/C. Bien mlanger le milieu et linoculum. Lincubation se fait 37C pendant 24 48 heures. Lecture : Seront considrs comme prsomptifs les tubes prsentant un trouble microbien ; seulement ces derniers : ne doivent en aucun cas faire lobjet de dnombrement doivent par contre, absolument faire lobjet dun repiquage sur milieu LITSKY EVA dans le but dtre justement confirms. Illustration : Inoculum 1 X 50 ml 5 X 10 ml Test de prsomption + + + + + -

5 X 1 ml

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Test de confirmation.. Le test de confirmation est bas sur la confirmation des Streptocoques du groupe D ventuellement prsents dans le test de prsomption. Les tubes de ROTHE trouvs positifs feront donc lobjet dun repiquage laide dune se boucle dans tube contenant le milieu LITSKY EVA. Bien mlanger le milieu et linoculum. Lincubation se fait cette fois-ci 37C, pendant 24 heures. Lecture : Seront considrs comme positifs, les tubes prsentant la fois : un trouble microbien, et une pastille violette (blanchtre) au fond des tubes. La lecture finale seffectue galement selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe. Illustration En reprenant lexemple prcdent relatif au test de prsomption, cela suppose que nous avons 5 tubes repiquer savoir : 2 tubes sur 5 de ROTHE D/C, et 3 tubes sur 5 de ROTHE S/C. Inoculum Test de prsomptio n + + + + + Test de confirmation Trouble Pastille violette + + + + 2 Nombre Caractristique 0

1 X 50 ml 5 X 10 ml

5 X 1 ml

+ +

+ + -

Tableau Rcapitulatif Le nombre caractristique relatif au dnombrement des Streptocoques fcaux est donc 021 , ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 3. Le rsultat final sera donc de : 3 Streptocoques fcaux dans 100 ml deau analyser

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Entrocoques intestinaux. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Test de prsomption Code : MO.SGD.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Eau Analyser

1 X 50 ml

5 X 10 ml

5 X 1 ml

ROTHE D/C

ROTHE D/C

ROTHE S/C

37C, 24 48 heures

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Streptocoques du groupe D. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP). Test de confirmation
Code : MO.SGD.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Repiquage sur milieu Lytski Eva (1 se)

37C, 24 heures

+ 2

+ 1

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Spores de bactries anarobies sulfitorductrices et de Clostridium sulfitorducteurs. Mthode par incorporation en glose en tubes profonds.
1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation. Code : MO.ASR.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire.

1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode consiste en la recherche et le dnombrement des spores des bactries anarobies sulfito-rductrices et de Clostridium sulfito-rducteurs dans les eaux destines la consommation humaine, par incorporation en glose en tubes profonds. 2. Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par bactries anarobies sulfito-rductrices des bactries qui se prsentent sous forme de bacilles Gram positif et qui en se dveloppant temprature de 36 2C en 24 48 heures en glose profonde de type glose Tryptose Sulfite Cyclosrine ou Tryptose Sulfite Nomycine ou encore glose Viande Foie, donnent des colonies caractristiques qui sont de couleur blanche entoures dune aurole noire. Cette dernire est le tmoin de la rduction du sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en prsence de Fe2+ qui donne FeS (sulfure de fer) de couleur noire. La prsence de spores de bactries ASR dans les eaux, sans flore daccompagnement, constitue gnralement un vritable indice de contamination ancienne. 3. Rfrentiels. Norme NF T 90-415. Recherche et dnombrement des spores de bactries anarobies sulfito-rductrices et de Clostridium sulfito-rducteurs. Mthode gnrale par incorporation en glose en tubes profonds. Norme NF T 90-417. Recherche et dnombrement des spores de microorganismes anarobies sulfito-rducteurs et de Clostridium. Partie.2 Mthode par filtration sur membrane. Norme ISO 6461 2. Recherche et dnombrement des spores de microorganismes anarobies sulfito-rducteurs Clostridia. Mthode par filtration. Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais. 28

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Mode opratoire. A partir de leau analyser : Transfrer environ 25 ml dans un tube strile, qui sera par la suite soumis un chauffage de lordre de 75C pendant 15 minutes, dans le but de dtruire toutes les formes vgtatives des bactries anarobies sulfito-rductrices ventuellement prsentes. Un autre flacon rempli dune autre eau servira de tmoin de temprature. Aprs chauffage, refroidir immdiatement le flacon destin lanalyse, sous leau de robinet. Rpartir ensuite le contenu de ce tube, dans 4 tubes diffrents et striles, raison de 5 ml par tube. Ajouter environ 18 20 ml de glose Tryptose Sulfite Cyclosrine ou Tryptose Sulfite Nomycine ou encore glose Viande Foie, fondue puis refroidie 47 1C, additionne de leurs additifs spcifiques. Mlanger doucement le milieu et linoculum en vitant dintroduire des bulles dair et de loxygne. Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes environ, puis incuber : o 44 4C, pendant 20 4 heures, dans le cas de la glose TSC ou TSN. o 36 2C, pendant 44 4 heures, dans le cas de la glose Viande Foie. 5. Lecture et interprtation. La premire lecture doit absolument tre faite 16 heures car trs souvent les spores des bactries anarobies sulfito-rductrices sont envahissantes auquel cas on se trouvera en face dun tube compltement noir rendant ainsi linterprtation difficile voire impossible et lanalyse sera refaire en utilisant des di lutions -1 -2 dcimales de 10 voire 10 , la deuxime lecture se fera 24 heures et la troisime et dernire 44 4 heures. Dnombrer toute colonie noire de 0,5 mm de diamtre, ayant pouss en masse et rapporter le nombre total des colonies dans les quatre tubes 20 ml deau analyser.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Identification biochimique. Certains auteurs prconisent lidentification biochimique de toute colonie suspecte car trs souvent il y a dveloppement de colonies de Staphylocoques et de Bacillus ct, quon prendrait tord pour des colonies danarobies sulfito-rductrices. Pour cela il sagit de casser le tube laide dune lime mtallique 1 cm au dessus de la colonie suspecte et de prendre exactement le centre de la dite colonie. Le centre de la colonie noire suspecte (qui est en ralit blanche mais entoure dune aurole noire) sera alors dpos soigneusement dans un tube contenant du bouillon T G Y ou T Y pralablement rgnr 80C pendant 15 minutes. Placer ensuite ce tube dans un agitateur (Vortex) pour bien mlanger la colonie dans le milieu puis lincuber 36 2C en anarobiose pendant 24 48 heures. Aprs la priode dincubation, constater le trouble du milieu, puis raliser les tapes suivantes : Etat frais. Coloration de Gram. Sil sagit de bacilles Gram positifs, faire un isolement sur deux boites de au sang de mouton frais : o lune sera incube 36 2C en arobiose, o lautre sera incube 36 2C en anarobiose. Aprs 24 48 heures dincubation : o o o o o slectionner les boites ayant pouss strictement en anarobiose, noter le type dhmolyse, faire une coloration de Gram puis une raction catalase, sassurer quil sagit bien dune souche pure, sinon purifier, puis ensemencer une Galerie biochimique Api 20 A incuber 36 2C en anarobiose. o Lecture et identification. glose

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Spores de bactries anarobies sulfitorductrices et de Clostridium sulfitorducteurs. Mthode par incorporation en glose en tubes profonds.
Code : MO.ASR.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Eau Analyser

25 ml deau analyser

Chauffage 75C, 15 minutes Refroidissement brutal sous leau de robinet Rpartir raison de 5 ml par tube dans 4 tubes

Ajouter environ 18 ml de glose TSC, TSN ou VF fondue puis refroidie 47 2C Laisser solidifier puis incuber selon protocole

+ 3 + 2 + Soit 12 Spores dASR dans 20 ml

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Spores de bactries anarobies sulfitorductrices. Mthode par filtration.
Code : MO.ASR.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5. 1. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation.

Objet et domaine dapplication. Cette mthode consiste en la recherche et le dnombrement des spores des bactries anarobies sulfito-rductrices et de Clostridium sulfito-rducteurs dans les eaux destines la consommation humaine, par incorporation en glose en tubes profonds.

2.

Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par bactries anarobies sulfito-rductrices des bactries qui se prsentent sous forme de bacilles Gram positif et qui en se dveloppant temprature de 36 2C en 24 48 heures en glose profonde de type glose Tryptose Sulfite Cyclosrine ou Tryptose Sulfite Nomycine ou encore glose Viande Foie, donnent des colonies caractristiques qui sont de couleur blanche entoures dune aurole noire. Cette dernire est le tmoin de la rduction du sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en prsence de Fe2+ qui donne FeS (sulfure de fer) de couleur noire. La prsence de spores de bactries ASR dans les eaux, sans flore daccompagnement, constitue gnralement un vritable indice de contamination ancienne.

3.

Rfrentiels. Norme ISO 6461 2. Recherche et dnombrement des spores de microorganismes anarobies sulfito-rducteurs Clostridia. Mthode par filtration. Norme NF T 90-415. Recherche et dnombrement des spores de bactries anarobies sulfito-rductrices et de Clostridium sulfito-rducteurs. Mthode gnrale par incorporation en glose en tubes profonds. Norme NF T 90-417. Recherche et dnombrement des spores de microorganismes anarobies sulfito-rducteurs et de Clostridium. Partie.2 Mthode par filtration sur membrane. Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais. 32

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Mode opratoire . La recherche des spores des bactries anarobies sulfito-rductrices par filtration sur membrane ncessite une prparation au pralable, qui se droule selon les tapes suivantes : Tout dabord, il faudrait striliser lentonnoir gradu en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse laide dun bec bunsen. Les refroidir tout de suite aprs, avec leau analyser si on en dispose en quantit suffisante ou bien avec de leau distille strile. Mettre en place de faon aseptique une membrane de porosit nominale de 0,2 entre la membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile. Fixer ce dispositif avec la pince correspondante. Dposer ensuite aseptiquement 100 ml, devant un bec bunsen. Actionner ensuite la pompe vide pour absorber leau travers la membrane. Retirer lentonnoir, enlever la membrane laide de pinces striles puis la placer dans une boite de faon ce que la face quadrille adhre au fond de la boite tout en vitant les bulles dair sous le filtre. Verser par la suite environ 18 ml de glose TSC, TSN ou dfaut glose VF, fondue puis refroidie 47 1C. Remarque : si on utilise de la glose VF, il faudrait au pralable chauffer leau une temprature de 75C pendant 15 minutes dans le but dliminer les formes vgtatives. Aprs solidification sur paillasse, cette boite sera incube couvercle en bas 36 2C pendant 20 4 heures puis 44 4 heures.

5. Lecture et interprtation Compter les colonies caractristiques noires aussi bien aprs la premire priode dincubation soit aprs 20 4 heures quaprs la seconde priode dincubation soit aprs 44 4 heures. Rapporter le nombre total de colonies 100 ml deau analyser.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Spores de bactries anarobies sulfitorductrices. Mthode par filtration.
Code : MO.ASR.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Filtration de 100 ml deau Eau Analyser

Entonnoir Membrane 0,45

Pompe

Rampe de Filtration 3 postes

Dposer la membrane filtrante 0,2 , face quadrille sur le fond de la boite Ajouter environ 18 ml de Glose TSC, TSN ou VF Laisser solidifier sur paillasse Incuber 36 2C, 20 4 h puis 44 4 heures (en cas de colonies caractristiques)

Compter le nombre de colonies caractristiques et le rapporter 100 ml deau analyser.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et Salmonella dans les eaux. Mthode par filtration.
Code : MO.SL.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation.

1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode consiste en la recherche et lidentification des Salmonella prsentes dans les eaux destines la consommation humaine, par filtration. 2. Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par Salmonella, des bactries qui se prsentent sous forme de bacilles Gram ngatif et qui en se dveloppant temprature de 36 2C en 24 48 heures, sur milieu Hektoen, forment de petites colonies, lisses contours rguliers, pigmentes en vert ou en bleu vert centre noir. Les Salmonella se divisent en deux grands groupes : les mineures et les majeures qui sont hautement pathognes (voir cours). 3. Rfrentiels. Norme NF EN ISO 9308 1 : Recherche et dnombrement des Escherichia coli et des bactries Coliformes partie 1. Mthode par filtration sur membrane. Norme NF T90-413 : Recherche et dnombrement des coliformes et des coliformes thermo tolrants. Mthode gnrale par ensemencement en milieu liquide (NPP). Norme NF V 08-051 : Dnombrement des Coliformes par comptage des colonies, mthode de routine. Norme NF V 08-017 : Dnombrement des Coliformes fcaux et d'Escherichia coli (annexe NF V 08-015 et NF V 08-016). Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Mode opratoire. La recherche des Salmonella par filtration sur membrane ncessite une prparation au pralable, qui se droule selon les tapes suivantes : Tout dabord, il faudrait striliser lentonnoir gradu en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse laide dun bec bunsen. Les refroidir tout de suite aprs, avec leau analyser si on en dispose en quantit suffisante ou bien avec de leau distille strile. Mettre en place de faon aseptique une membrane de 0,45 entre la membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile. Fixer ce dispositif la pince correspondante. Dposer ensuite 250 ml, 500 ml ou plus selon disponibilit jusqu 1 voire 5 litres deau analyser, devant un bec bunsen. Actionner ensuite la pompe vide pour absorber leau travers la membrane. Retirer la membrane laide dune pince strile puis la placer dans un flacon contenant le milieu Eau Peptone Tamponne. Bien mlanger le filtre dans le milieu, puis incuber ce dernier 36 2C pendant 20 2 heures. Cette tape constitue lenrichissement primaire. Aprs incubation, procder un enrichissement secondaire en transfrant 1 ml de lenrichissement primaire sur le milieu Rappapport Vassiliadis. Bien mlanger le milieu et linoculum, puis incuber ce dernier 42 0,5C pendant 20 4 heures voire 44 4 heures. Aprs lincubation, procder lisolement sur milieu Hektoen ou XLD incuber 36 2C pendant 20 2 heures. 5. Lecture et interprtation. Reprer les colonies caractristiques. Faire une identification biochimique base essentiellement sur ONPG, TSI, Ure Indole, LDC Si ncessaire faire une identification antignique base essentiellement sur lagglutination laide des srums de groupe OMA et OMB ou bien sadresser un laboratoire comptent en vue dune confirmation. Remarque : Au cas o la quantit deau analyser nest pas trs suffisante, transfrer 10 ml directement sur Milieu Eau Peptone Tamponne incuber 36 2C pendant 20 2 heures. Cette tape constitue lenrichissement primaire. Poursuivre les autres tapes comme dcrit ci-dessus.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et Salmonella dans les eaux. Mthode par filtration.
Code : MO.SL.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Filtration de 250 ml 5 litres deau Eau Analyser

Entonnoir Membrane 0,45

Rampe de

Filtration Pompe 3 postes

Eau Pep Tamp


36 2C pendant 20 2 heures

1 ml

Milieu RV
42 0,5C pendant 20 4 heures voire 44 4 heures.

Glose Hektoen ou XLD

36 2C pendant 20 2 heures. ONPG, TSI, Ure Indole, LDC, Agglutination (OMA, OMB ) 37

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Mode opratoire / Enregistrement


Code : MO.VC.ML

LOGO

Version : 00 Recherche de Vibrion cholrique dans les eaux. Mthode en milieu liquide. Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire. 1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation.

1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode consiste en la recherche et lidentification des Vibrionacae prsents dans les eaux desti nes la consommation humaine, en milieu liquide. 2. Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par les Vibrionacae, des bactries qui se prsentent sous forme de Bacilles Gram Ngatifs droits ou incurvs (BGN), trs mobiles, possdant une oxydase, aro-anarobies facultatifs, fermentant le glucose sans production de gaz ni d'H2S, hautement pathognes. (Voir cours). 3. Rfrentiels. Norme ISO / TS 21 872-1. Recherche de Vibrions pathognes par voie digestive. Vibrion paraheamolyticus, autres vibrions. Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

4. Mode opratoire. Jour 1. Enrichissement primaire. Lenrichissement primaire seffectue sur le milieu Eau Peptone Alcaline 10 fois concentr contenant 50 ml de milieu, auquel on ajoute aseptiquement 450 ml deau analyser au point et au moment du prlvement. Ce dernier sera par la suite incub 36 2C pendant 20 4 heures. Jour 2. Enrichissement secondaire et Isolement. Aprs incubation, le flacon constituant lenrichissement primaire fera lobjet : dune part, dun enrichissement secondaire sur milieu EPA en tube auquel on ajoute 1 ml par tube. dautre part, dun isolement sur glose GNAB 1. Dans les deux cas, lincubation se fait 36 2C pendant 20 4 heures. 38

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Jour 3. Lecture des boites et Identification. Dune part, le tube dEPA fera lobjet dun isolement sur GNAB 2 qui sera incub son tour 36 2C pendant 20 4 heures. Dautre part, la boite de glose GNAB 1 subira une lecture en tenant compte du fait que les Vibrions se prsentent le plus souvent sous forme de grosses colonies lisses, transparentes et trs caractristiques. Identification morphologique et biochimique. Cinq colonies caractristiques et distinctes feront lobjet dune identification morphologique et biochimique base essentiellement sur : Etat frais (bacilles, mobilit), Coloration de Gram (bacilles Gram ngatifs), Oxydase (+), Ensemencement dun tube de KIA qui sera incub 37C, 24 h (Saccharose, Glucose, Gaz et H2S), Ensemencement dun tube de glose nutritive incline qui sera incub 36 2C pendant 20 4 heures. qui servira lagglutination sur lame, comme suit : Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au srum polyvalent O1 est ngative, faire une mini-galerie biochimique base sur l'tude des acides amins en vue de diffrencier les Vibrions, des Pleisiomonas et des Aromonas selon le tableau suivant : LDC + + ODC + + ADH + +

Vibrions Aromonas Pleisiomonas

S'il s'agit du genre Vibrion, rpondre : Vibrion NON Agglutinable (NAG). Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au srum polyvalent O1 est positive, il s'agit d'un vibrion rough (auto agglutinable). Si l'agglutination avec l'eau physiologique est ngative et positive au srum polyvalent O1, rpondre : Vibrion cholrique.

39

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Mode opratoire / Enregistrement


Code : MO.VC.ML

LOGO

Version : 00 Recherche de Vibrion cholrique dans les eaux. Mthode en milieu liquide. Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Eau Analyser

450 ml

Bouillon EPA 10X [ ]

36 2C pendant 20 4 heures. Isolement sur GNAB 1 1 ml Deuxime enrichissement

36 2C pendant 20 4 heures. Oxydase Gram Etat frais KIA LDC, ODC, ADH GN incline Agglutination

GNAB 2 36 2C pendant 20 4 h

Suite Idem 40

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche de Staphylocoques coagulase positive dans les eaux destines la consommation humaine. Mthode par filtration sur membrane.
1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation Code : MO.SA.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire.

1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode de rfrence, consiste en la recherche et le dnombrement des Staphylocoques coagulase positive dans les eaux destines la consommation humaine, par filtration sur membrane. 2. Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par Staphylocoques coagulase positive, bactries qui se prsentent sous forme de cocci Gram positive, sphriques, isoles ou regroupes formant ainsi des grappes de raisin, possdant lenzyme catalase et la coagulase. Ils sont capables de se dvelopper en 24 48 heures 36 2C sur un milieu slectif Chapman au mannitol. Lespce type du genre est Staphylococcus aureus, elle est pathogne et la plus redoute. 3. Rfrentiels. Norme NF T 90 421. Recherche et dnombrement des Staphylocoques coagulase positive dans les eaux destines la consommation humaine. Mthode par filtration. Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

41

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Mode opratoire. La recherche des Staphylocoques coagulase positive ou plus particulirement Staphylococcus aureus, par filtration sur membrane ncessite une prparation au pralable, qui se droule selon les tapes suivantes : Tout dabord, il faudrait striliser lentonnoir gradu en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse laide dun bec bunsen. Les refroidir tout de suite aprs, avec leau analyser si on en dispose en quantit suffisante ou bien avec de leau distille strile. Mettre en place de faon aseptique une membrane de porosit nominale de 0,45 entre la membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile. Fixer ce dispositif avec la pince correspondante. Dposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml deau analyser, selon les types deaux analyser, devant un bec bunsen. Actionner ensuite la pompe vide pour absorber leau travers la membrane. Retirer lentonnoir puis transfrer immdiatement et aseptiquement la membrane laide dune pince bouts arrondis strile, la surface dune plaque de glose Chapman au mannitol pralablement prpare. Cette dernire sera incube couvercle en bas 36 2C pendant 44 4 heures.

5.

Lecture et interprtation Aprs la priode dincubation spcifie, les Staphylocoques coagulase positive ou plus particulirement Staphylococcus aureus, apparaissent sous forme de petites colonies lisses lgrement bombes contours rguliers et pigmentes en soit en jaune ( fermentation du mannitol) ou en blanc. Prendre 3 5 colonies au hasard, une demi colonie servira au test la catalase, lautre demi sera triturer dans un tube contenant du bouillon BHIB, incuber 36 2C pendant 20 4 heures. Staphylococcus aureus, possde ces deux enzymes. Test la catalase. Placer sparment deux gouttes dune solution de peroxyde dhydrogne 20 volumes sur une lame de microscope. Prlever une demi colonie avec une tige de verre (pipette Pasteur) ou en plastique (surtout pas de fil mtallique) et lmulsionner doucement dans une des deux gouttes. Observer immdiatement et aprs 5 minutes sil y a apparition (catalase positive) ou absence (catalase ngative) de bulles doxygne. Dans le cas o il y a doute, recouvrir chacune des gouttes avec lamelle de microscope et comparer lapparition des bulles sous les deux lamelles. Les observations peuvent se faire macroscopiquement ou laide dun microscope faible grossissement. Test la coagulase libre. Aprs incubation du bouillon BHIB, ajouter strilement 0,1 ml de cette culture 0,3 ml de plasma de lapin contenu dans un tube strile hmolyse, et inc uber de nouveau 36 2C pendant 2 6 heures. Examiner la coagulation du plasma de lapin sinon r-incuber et examiner de nouveau 20 4 heures. Considrer que la raction la coagulase est positive quand le coagulum occupe plus des trois quart du volume initialement occup par le liquide. 42

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Le tableau suivant rsume quelques caractres biochimiques de diffrentes espces de Staphylocoques. Staphylocoque Catalase Coagulase Mannitol en anarobie Rsistance la Novobiocine (5 Micro-gr ) aureus + + + intermedius + + saprophyticus + epidermitis + -

Coagulase

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche de Staphylocoques coagulase positive dans les eaux destines la consommation humaine. Mthode par filtration sur membrane.
Code : MO.SA.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Filtration de 100 ml deau Eau Analyser

Entonnoir Membrane 0,45

Pompe

Rampe de Filtration 3 postes

Glose Chapman au mannitol Incuber 36 2C, 20 4 h puis 44 4 heures Distinguer les colonies caractristiques

Catalase

Coagulase

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche de Pseudomonas aeruginosa dans les eaux destines la consommation humaine. Mthode par filtration sur membrane.
1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation Code : MO.PA.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire.

1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode de rfrence, consiste en la recherche Pseudomonas aeruginosa dans les eaux destines la consommation humaine, par filtration sur membrane. 2. Dfinition. Au sens de cette mthode, on entend par Pseudomonas aeruginosa, une bactrie qui se prsente sous forme de bacille Gram ngatif possdant lenzyme oxydase et capable de produire de lammoniac partir de lactamide. Pseudomonas aeruginosa, est galement une bactrie hautement pathogne et rsistante plusieurs antibiotiques. (Voir cours). 3. Rfrentiels. Norme NF EN 12780. Dtection et dnombrement de Pseudomonas aeruginosa dans les eaux destines la consommation humaine. Mthode par filtration. Norme NF ISO 7218 : Rgles gnrales pour les examens microbiologiques. Norme XP V 08-102 : Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats : cas des dnombrements en milieu solide. Norme NF ISO 17025 : Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Mode opratoire. La recherche de Pseudomonas aeruginosa par filtration sur membrane ncessite une prparation au pralable, qui se droule selon les tapes suivantes : Tout dabord, il faudrait striliser lentonnoir gradu en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse laide dun bec bunsen. Les refroidir tout de suite aprs, avec leau analyser si on en dispose en quantit suffisante ou bien avec de leau distille strile. Mettre en place de faon aseptique une membrane de porosit nominale de 0,45 entre la membrane poreuse et lentonnoir laide dune pince strile. Fixer ce dispositif avec la pince correspondante. Dposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml deau analyser, selon les types deaux analyser, devant un bec bunsen. Actionner ensuite la pompe vide pour absorber leau travers la membrane. Retirer lentonnoir puis transfrer immdiatement et aseptiquement la membrane laide dune pince bouts arrondis strile, la surface dune plaque de glose au Ctrmide pralablement prpare. Cette dernire sera incube couvercle en bas 36 2C pendant 44 4 heures. 5. Lecture et interprtation Aprs la priode dincubation spcifie : les colonies pigmentes en bleu vert donc productrices de pyocyanine sont considres demble comme des colonies de Pseudomonas aeruginosa : compter le nombre de colonies. Les colonies qui prsentent une fluorescence sous UV, ncessitent une confirmation biochimique base essentiellement sur un repiquage sur bouillon lactamide qui sera incub 36 2C pendant 20 4 heures. Aprs incubation, la production dammoniac partir du bouillon lactamide, aprs avoir ajouter une deux gouttes du ractif de Nessler est caractrise par une dcoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : compter le nombre de colonies. Les colonies prsentant une pigmentation brun rougetre sans fluorescence, ncessitent galement une confirmation biochimique base dabord et avant tout sur loxydase. Les colonies oxydase positives seront ensuite repiques dune part, sur bouillon lactamide qui sera incub 36 2C pendant 20 4 heures et dautre part, sur milieu King B. Aprs incubation : o La production dammoniac partir du bouillon lactamide, aprs avoir ajouter une deux gouttes du ractif de Nessler est caractrise par une dcoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : compter le nombre de colonies. o Lapparition dune fluorescence sur milieu King B expos aux UV (360 nm) est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : compter.

46

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 6. Expression des rsultats. Le nombre total de colonies de Pseudomonas aeruginosa N, prsent dans le volume deau analyser (100 ou 250 ml) est calcul par lquation mathmatique suivante :

N = P + F (cF / nF) + R (cR / nR)

O :

P : Nombre total de colonies bleu vert (pyocyanine), caractristiques de


Pseudomonas aeruginosa.

F : Nombre total de colonies fluorescentes. nF : Nombre de colonies fluorescentes testes pour la production dactamide. cF : Nombre de colonies fluorescentes positives pour la production dactamide. R : Nombre total de colonies pigmentes en Brun-rougetre nR : Nombre de colonies Brun-rougetre testes pour la production dactamide,
doxydase et de fluorescence sur milieu King B. cR : Nombre de colonies Brun-rougetre positives pour la production dactamide, doxydase et de fluorescence sur milieu King B.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche de Pseudomonas aeruginosa dans les eaux destines la consommation humaine. Mthode par filtration sur membrane.
Code : MO.PA.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06 Page : 1 / 3

Filtration de 100 ou 250 ml deau Eau Analyser

Entonnoir Membrane 0,45

Pompe

Rampe de Filtration 3 postes

Glose au Ctrmide 36 2C, 20 4 h puis 44 4 heures

Colonies Bleu Vert ( compter)

Colonies Fluorescentes

Colonies Brun-rougetre Oxydase (+)

King B Bouillon lactamide 36 2C, 20 4 h puis 20 4 heures 48

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Table NPP 1 X 50 ml
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 X 10 ml
0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

5 X 1 ml
0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5

Nombre Limites de confiance caractristique Infrieure Suprieure


<1 1 2 1 2 3 2 3 4 3 5 5 1 3 4 6 3 5 7 9 5 7 10 12 8 11 14 18 21 13 17 22 28 35 43 24 35 54 92 160 >240 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 1 2 <0,5 1 3 3 2 3 4 5 6 4 5 7 9 12 15 8 12 18 27 39 4 6 4 6 8 6 8 11 8 13 13 4 8 11 15 8 13 17 21 13 17 23 28 19 26 34 53 66 31 47 59 85 100 120 75 100 140 220 450

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SOMMAIRE Analyse des Boissons


Intitul
Recherche et Dnombrement des Microorganismes revivifiables. Mthode par comptage des colonies obtenues 30C, dans les boissons. Recherche et Dnombrement des Levures et Moisissures dans les boissons. Mthode par comptage des colonies.

Codification
MO.MR.BS

Version
00

Date
02 / 1 / 06

MO.LM.BS

00

02 / 1 / 06

50

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Mode opratoire / Enregistrement Recherche et dnombrement des Microorganismes. Mthode par comptage des colonies obtenues 30C, dans les boissons.
Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation. Code : MO.MR. BS Version : 00 Date : 02 / 1 / 06 Page : 1 / 3

1. Objet et domaine dapplication.


Cette mthode consiste en la recherche et le dnombrement des microorganismes revivifiables dans les boissons et boissons gazeuses destines la consommation humaine par comptage des colonies 30C.

2. Dfinition.
Dans le sens de cette mthode, on entend par microorganismes revivifiables : Bactries, Levures, Moisissures se dveloppant en arobiose, lorsque lessai est effectu selon la mthode spcifie.

3. Rfrentiels.
Norme NF V 08-051 : Microbiologie des aliments. Recherche et dnombrement des micro-organismes revivifiables. Mthode par comptage des colonies obtenues 30C. Norme XP V 08-102. Rgles gnrales pour le comptage des colonies et lexpression des rsultats. Norme NF V 08-002 : Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour les examens microbiologiques. Norme NF V -057-2 Microbiologie alimentaire Directives gnrales pour la prparation des dilutions en vue de lexamen microbiologique. Norme NF ISO 17025. Prescriptions gnrales concernant la comptence des laboratoires dtalonnage et dessais.

4. Mode Opratoire.
A partir des dilutions dcimales allant de 10 -3 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans une boite de Ptri vide prpare cet usage et numrote. Complter ensuite avec environ 19 ml de glose TGEA ou TDYM fondue puis refroidie 47 1C. Le temps qui scoule entre le moment o lon a distribu linoculum dans la boite et celui o le milieu est coul ne doit pas excder 15 minutes. 51

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de 8 pour permettre linoculum de se mlanger la glose, sur une surface frache et horizontale. Laisser solidifier sur paillasse, puis rajouter une deuxime couche denviron 4 ml de la mme glose ou de glose blanche. Cette doub le couche a un rle protecteur contre les contaminations diverses. Les boites seront incubes couvercle en bas 30C pendant 70 2 heures avec :

premire lecture 20 4 heures, deuxime lecture 40 4 heures, et troisime et dernire lecture 70 2 heures. 5. Lecture et interprtation.
Retenir les boites contenant moins de 300 colonies, au niveau de deux dilutions successives, mais il faut quune boite renferme au moins 15 colonies. Calculer le nombre N, de microorganismes revivifiables dnombrs 30C par ml de produit en tant que moyenne pondre, laide de lquation suivante :

c N= 1,1 x d
o : c : est la somme des colonies comptes sur les deux boites retenues. d: est le taux de dilution correspondant la premire dilution. Arrondir les rsultats calculs deux chiffres significatifs. Le rsultat final de microorganismes dnombrs 30C par ml de produit est not par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multipli par 10x o x est la puissance approprie de 10. Exemple : Un dnombrement de microorganismes 30C a donn les rsultats suivants : -2 la premire dilution retenue 10 : on a 158 colonies. A la seconde dilution retenue 10
-3

: on a 14 colonies.

c 158 + 14 172 N = -------------- = ------------------------ = --------------- = 15636 -2 1,1 x d 1,1 x 10 0,011 Arrondir deux chiffres significatifs, soit 16000 ou mieux : 1,6 x 104 microorganismes par ml de produit.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Levures et Moisissures dans les boissons. Mthode par comptage des colonies.
Code : MO.LM. MS Version : 00 Date : 02 / 1 / 06 Page : 1 / 3

Sommaire : 1. 2. 3. 4. 5. Objet et domaine dapplication. Dfinition. Rfrentiels. Mode opratoire. Lecture et interprtation.

1. Objet et domaine dapplication. Cette mthode consiste en la recherche et le dnombrement des Levures et des Moisissures dans toutes les catgories de denres alimentaires, par comptage des colonies sur milieu solide. 2. Dfinitions. Les Levures et Moisissures sont des champignons htrotrophes, organismes eucaryotes uni ou multicellulaires. La structure de la cellule est celle dune cellule eucaryote. Les Levures sont des champignons unicellulaires qui constituent un groupe morphologique et physiologique relativement homogne. Les Moisissures sont des champignons filamenteux uni ou multicellulaires. 3. Mode opratoire. Par cette mthode, les Levures et Moisissures sont recherches et dnombres dans toutes les catgories de denres alimentaires, selon le protocole suivant, en recherchant les Levures part et les Moisissures part, comme le montre les schmas n1 et 2 ci-aprs. 3.1 Recherche et Dnombrement des Levures. A partir des dilutions retenues, transfrer 1 ml de lchantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la suspension mre si le produit est solide, dans une boite de Ptri, pralablement prpare et numrote pour cet usage. Dans les mmes conditions, et de la mme manire, transfrer laide dune nouvelle pipette, 1 ml de la premire dilution dcimale de lchantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la seconde dilution dcimale, si le produit est solide, dans une boite de Ptri, pralablement prpare et numrote pour cet usage. 53

Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Dans les mmes conditions, et de la mme manire, transfrer laide dune nouvelle pipette, 1 ml de la seconde dilution dcimale de lchantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la troisime dilution dcimale, si le produit est solide, dans une boite de Ptri, pralablement prpare et numrote pour cet usage. Couler dans chacune des boites de Ptri, environ 15 ml de glose Sabouraud au Chloramphnicol, fondue, refroidie et maintenue 47 2C dans un bain deau. Mlanger soigneusement milieu et inoculum et laisser le mlange se solidifier sur une paillasse frache et hori zontale. Aprs solidification complte du mlange et uniquement dans le cas o on suspecte le produit analyser de contenir des microorganismes dont les colonies envahissent la surface du milieu, couler la surface du milieu ensemenc environ 4 ml de le glose blanche fondue, refroidie et maintenue 47 2C dans un bain deau. Retourner les boites ainsi prpares puis les incuber selon accord, 30C pendant 70 2 h ou plus. 3.2 Recherche et Dnombrement des Moisissures. A partir des dilutions dcimales, 10-3 10-1, ensemencer respectivement et par talement 0,1 ml dans une srie de trois boites de Ptri contenant de la glose Sabouraud au Chloramphnicol. Laisser les boites sur paillasse pendant 15 minutes temprature ambiante, pour permettre la diffusion de linoculum puis les incuber 30C pendant 70 2 heures ou plus. Dans le souci de ne pas se trouver en face de boites envahies par les Moisissures, on doit effectuer des lectures et des dnombrements tous les jours.

4. Lecture et interprtation.
4.1. Cas des Levures Aprs la priode dincubation spcifie, compter les colonies de Levures ayant pouss en profondeur dans chacune des boites contenant entre 15 et 150 colonies, puis calculer la valeur du nombre N de Levures prsentes dans la prise dessai en tant que moyenne pondre partir des deux dilutions successives laide de lquation suivante :

c N= 1,1 x d
o : c : est la somme des colonies comptes dans deux boites de dilution successives. d : est la valeur de la premire dilution retenue parmi les deux boites. Exemple : (concernant les Levures) o la SM soit (10 ) : 80 colonies de Levures, o la seconde dilution (10 ) : 15 colonies de Levures, o N = 80 + 15 / 1,1 x 0,1 = 863,63 2 Aprs arrondissement, le rsultat est de : 9.10 Levures par gr de produit 54
-2 -1

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4.2. Cas des Moisissures Aprs la priode dincubation spcifie, compter les colonies de Moisissures ayant pouss en surface dans chacune des boites contenant entre 15 et 150 colonies, puis calculer la valeur du nombre N de Moisissures prsentes dans la prise dessai en tant que moyenne pondre partir des deux dilutions successives laide de lquation suivante :

c
N= V x 1,1 x D
O :

c : est

la somme des colonies de Moisissures prsentes sur les deux boites

retenues. D : est le taux de dilution correspondant la premire dilution retenue (la suspension mre est une dilution) V : est le volume tal sur chaque boite. Arrondir les rsultats calculs deux chiffres significatifs. Pour cela : si le dernier chiffre est infrieur 5, le chiffre prcdent nest pas modifi, si le dernier chiffre est suprieur ou gal 5, le chiffre prcdent est augment dune unit. Procder de proche en proche jusqu ce que lon ait deux chiffres significatifs. Exemple. Un dnombrement direct dun produit solide aprs ensemencement avec 0,1 ml de produit a donn les rsultats suivants : -1 la SM soit (10 ) : 45 colonies de Moisissures, la seconde dilution (10 ) : 6 colonies de Moisissures,
-2

La valeur du N sera calcule ainsi :

45 + 6 N= 0,1 x 1,1 x 10
-1

51 = 0,011 = 4636,36

Aprs arrondissement, le rsultat est de : 4,6 x 10 Moisissures par gr de produit


3

55

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Remarques importantes : 1. Oprer de la mme faon et dans les mmes conditions, avec le diluant (TSE), c'est--dire quil faut prendre 0,1 ml du diluant (TSE), les taler avec un taleur part et les incuber dans les mmes conditions que les boites tests, cette boite constitue le tmoin diluant (TD). 2. Incuber telle quelle, une boite du milieu utilis savoir le milieu Sabouraud au chloramphnicol, cette dernire sera incube galement telle quelle dans les mmes conditions de temprature, elle constitue alors, le tmoin du milieu (TM). 3. Au moment de la lecture, commencer obligatoirement par les deux boites tmoins (TM et TD), si lune dentre elles est contamine, lanalyse est ininterprtable donc refaire.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Levures et Moisissures dans les boissons. Mthode par comptage des colonies. LOGIGRAMME : LEVURES
A partir des dilutions dcimales : Code : MO.LM. MS Version : 00 Date : 02 / 1 / 06 Page : 1 / 3

10-1 1ml

10-2 1ml

10-3 1 ml

Ajouter ensuite environ 15 ml de glose Sabouraud au Cmp. Laisser solidifier sur paillasse pendant 15 mn, puis Incuber : 30C, 72 2 heures

Dnombrer les colonies caractristiques, puis calculer la valeur N.

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Mode opratoire / Enregistrement LOGO Recherche et dnombrement des Levures et Moisissures dans les boissons. Mthode par comptage des colonies.
Code : MO.LM. MS Version : 00 Date : 02 / 1 / 06 Page : 1 / 3

LOGIGRAMME : MOISISSURES
A partir des dilutions dcimales :

10-1 0,1ml 0,1ml

10-2

10-3 0,1 ml

Etalement la surface de la glose Sabouraud au Cmp. Laisser diffuser linoculum sur paillasse pendant 15 mn, puis Incuber : 30C, 72 2 heures

Dnombrer les colonies caractristiques, puis calculer la valeur N.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 Contrle Microbiologique des boissons 1. Introduction. Les jus de fruits sont des produits dont les caractristiques sont gnralement assez peu favorables au dveloppement des contaminants incidence sanitaire. A titre dexemple, leurs principales caractristiques sont : leur bas pH, leur faible concentration en oxygne, leur forte concentration en acides amins, leur forte concentration en sucres, leur forte concentration en vitamines. Ces caractres limitent considrablement le nombre despces susceptibles de sy multiplier : le plus souvent elles ne permettent que la multiplication des levures. 2. Quelles peuvent tre les diffrentes altrations ? A. Modification de laspect. Apparition dune opalescence ou dun trouble dans les boissons limpides (levures). Formation dun anneau (levures). Apparition de flocons surtout dans les sirops, (levures). Apparition de dpt (levures). Augmentation de viscosit, glification (bactries lactiques). Diminution du trouble dans les boissons naturellement troubles, Dcoloration de boissons aux colorants naturels (levures ou de bactries). B. Augmentation de la pression dans les rcipients. Ce phnomne peut avoir diffrentes consquences qui vont du bombage de contenants non rigides jusqu' lclatement mme (levures, bactries lactiques ou Clostridium). C. Modification de lodeur et du got. Diminution du got (levures), Odeur et got de bire (levure), Got aigre (bactries lactiques ou actiques), Odeur de moisi (moisissures), Le seuil d'altration se situe le plus souvent entre 50 000 et 100 000 microorganismes par ml. 3. La prvention des altrations : Les efforts de prvention doivent porter sur : La rduction voire l'limination des contaminations. Cette dernire s'obtient par : la matrise des Points Critiques, la mise en place des BPF. La mise en place de protocoles de nettoyage et de dsinfection. Le blocage de la multiplication des contaminants ventuellement prsents.

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Cours dHygine et de Microbiologie des Eaux Institut Pasteur dAlgrie Mai 2008 4. Quels sont les agents d'altration ? Dans 90 % des cas, il s'agit de levures car : * elles supportent des bas pH, * elles peuvent utiliser l'azote inorganique, * elles n'ont pas besoin de Vitamine B, * elles tolrent un taux de CO2 lev, * elles rsistent de fortes concentrations en sucres. Dans 10 % des cas restants, il s'agit de Clostridium butyricum, le plus souvent responsable du bombage des boites 5. Le Contrle Microbiologique proprement dit doit porter sur : * Les matires premires (eau, sirop de sucre, jus de fruits), * La chane de fabrication (points critiques), * Les produits finis. Il comporte : * La recherche de micro-organismes capables d'altrer la sant publique, * La recherche de micro-organismes capables d'altrer la qualit hyginique du produit ainsi que ses caractres organoleptiques. Dans le cas des jus de fruits conditionns en Tetra pack, le Contrle microbiologique des produits finis consiste en : Un test de Stabilit, Une prise de pH, Un test de Strilit. En Conclusion, Les jus de fruits sont des boissons rafrachissantes trs slectives de par leurs caractristiques "physico-chimiques", gnralement ils ne posent pas de problme d'ordre sanitaire ou hyginique mais uniquement des problmes de conservation. Elles s'altrent rarement sous l'action des levures ou de bactries lactiques, deux groupes bien adapts aux conditions slectives du milieu.

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