Atelier Microbiologie Appliquée

PREFACE
Ces travaux pratiques se déroulent dans un laboratoire de Microbiologie
Il est essentiel de respecter et surtout de garder la propreté de votre laboratoire, les produits
et le matériel qui s’y trouvent.
Après chaque usage vous devrez bien nettoyer et ranger les produits, les réactifs et le
matériel.
Il est important de vous dire que vous pouvez être en contact direct avec des produits
périssables et/ou dangereux.
Il faut porter une blouse, boutonnée et bien propre.
Il est important d’être concentré (e), vigilant (e) et de travailler en silence.
En cas de danger et/ou pour tout problème technique adressez vous à votre professeur et
éventuellement au technicien du laboratoire.
Atelier microbiologie appliquée
Pre-requis
Etre formé aux techniques de base de microbiologie générale.
Objectifs : à la fin de ces travaux pratiques, chaque étudiant doit être capable de :
Réaliser les analyses microbiologiques d'une denrée alimentaire selon les protocoles
imposés par la réglementation.
Acquérir et maintenir une compétence dans les techniques microbiologiques.
Etre capable de mettre en œuvre ces techniques.
Mettre à jour ses connaissances en matière de réglementation.
Connaitre les différentes méthodes de mesure de la biomasse.
SOUIY Z. et HAJJI H. Page 2

Sommaire
page
TPN°1: Recherche et Dénombrement des germes totaux 04
TP N°2: Recherche et Dénombrement des levures et moisissures 07
TPN°3:Recherche et Dénombrement des coliformes totaux, coliformes fécaux et

09
E.coli
TP N°4: Recherche et Dénombrement des Anaérobies Sulfito-réducteurs (ASR) 15
TP N°5: Dénombrement de Staphylococcus Aureus 18
TP N°6: Etude de l’influence de la concentration en substrat 19
TP N°7: Suivi de l’évolution d’une population de levure 21
Références bibliographiques 23
Annexes 24

TP N°1
Recherche et dénombrement des germes totaux
1. Définition
Les germes totaux sont tous micro-organismes se développant en aérobiose à 30°C sur le
milieu gélose nutritive.
La microflore totale peut comprendre :
- Germes aérobies mésophiles a 30°C ;
- Anaérobies a 30°C ;
- Flore psychrotrophe (4°C, 7°C, 14°C) ;
- Flore sporulée aérobie à 30°C ;
- Flore sporulée anaérobie à 30°C ;
- Microorganismes contaminants.
2. Principe
On ensemence un millilitre de l’échantillon a analyser dans une boite de pétri, et on ajoute le

milieu de culture défini, puis on incube la boite de pétri à 30°C pendant 72 heures, ensuite on
calcule le nombre de germe totaux par millilitre ou par gramme d’échantillon.
3. Milieu de culture
La gélose glucosée à l’extrait de levure, appelée par les Anglo-Saxons “Plate Count Agar” ou
PCA, est utilisée en bactériologie alimentaire pour le dénombrement des bactéries aérobies
psychrotrophes, mésophiles dans le lait, les viandes, les produits à base de viande, les autres
produits alimentaires, ainsi que pour l’analyse des produits pharmaceutiques, des produits
cosmétiques et de leurs matières premières.
Pour sa préparation on met 23,5g de poudre de PCA dans un litre d’eau distillée, on chauffe
le mélange jusqu’à ébullition et dissolution total après la préparation. Après le chauffage de
ce mélange, il est nécessaire de faire une stérilisation, pour cela on le met dans l’autoclave à
121° C pendant 15 minutes.

FORMULE - TYPE
(Pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales)

Pour 1 litre de milieu :
- Tryptone...........................................................................................5,0 g
- Extrait autolytique de levure.............................................................2,5 g
- Glucose............................................................................................1,0 g
- Agar agar bactériologique..............................................................12,0 g
pH du milieu prêt -à- l’emploi à 25°C : 7,0 ± 0,2.
4. Mode opératoire
Après la dilution, on prend 1 ml de l’échantillon et on le met dans une boite de pétri stérile,
puis on fait couler la gélose PCA, on fait des mouvements de rotation. On laisse refroidir et se
solidifier, puis on incube.
 Incubation
Les boites seront incubées à 30°C pendant 72 heures avec :
- première lecture à 24 heures,
- deuxième lecture à 48 heures, et
- troisième lecture à 72 heures.
5. lecture
Après incubation des boites à 37°C pendant 24 heures, on compte les colonies des germes
totaux. Les colonies des G A M T (germes aérobies mésophiles totaux) se présentent sous
forme lenticulaire en masse.
6. Expression de résultat
 Dénombrement
 Il s’agit de compter toutes les colonies ayant poussées sur les boites en tenant compte
des facteurs suivants :
o ne dénombrer que les boites contenant entre 15 et 300 colonies,
o multiplier toujours le nombre trouvé par l’inverse de sa dilution,
o faire ensuite la moyenne arithmétique des colonies entre les différentes
dilutions.

 On calcule le nombre des colonies comptées dans la boite retenue x.

 Le nombre de micro-organismes par gramme de produit est égal à :.
 Le nombre de micro-organismes par millilitre de produit est égal à :
 d : étant la dilution de la suspension mère
Exemple
Inoculum Nombre de Colonies Pour revenir à 1

Nombre réel Moyenne arithmétique
10-1 160 X 10 1600
10-2 70 X 100 7000 27600 / 3 = 9200
10-3 19 X 1000 19 000 GAMT/gr

TP N°2
Recherche et Dénombrement des levures et moisissures (NT 16.16 (1983)
microbiologie alimentaire, directive générale pour le dénombrement des levures et moisissures)
1. Définition
Les levures et moisissures sont des micro-organismes qui vivent à 25°C, forment des colonies
dans un milieu sélectif.
 Les levures ont une grande capacité d’adaptation à de nombreux substrats, elles sont très
largement répandues dans l’environnement. Ce sont des champignons chez lesquels la forme
unicellulaire est prédominante (figure 1). La forme la plus fréquente est ovalaire ou
sphérique. Elles sont classées par genres et espèces, et sont regroupées elles aussi au sein de
famille, selon leur morphologie et leur mode de reproduction.
Figure N°1 : levures
 Tout comme les levures, les moisissures peuvent être véhiculées par l’environnement et se
retrouver dans les aliments. Ce sont des micro-organismes filamenteux qui sont disséminés
par l’émission de spores.
2. Principe
Un milieu, contenant des éléments nutritifs nécessaires à la croissance de la plupart des
levures et des moisissures et des antibiotiques qui inhibent le développement de la plupart des
bactéries, est ensemencé avec une quantité donnée du produit à analyser. On incube à une
température de 22 à 25 °C pendant 3 à 5 jours. Les colonies qui apparaissent dans le milieu de
culture sont ensuite dénombrées et/ou examinées.

3. Mode opératoire
 Préparation de milieu de culture : ex : Sabouraud, PDA, … (voir flacon)
 Prise d’essai : préparation de la suspension mère et la dilution.
 Ensemencement et incubation :
- Prendre une boite de pétri stérile. A l’aide d’une pipette stérile transférer, dans cette boite 1
ml de l’échantillon.
- Couler environ 10 ml de Gélose à l’extrait de levure, au glucose et au chloromphénicol dans
la boite précédente.
- Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture et laisser se solidifier en posant la
boite de pétri sur une surface fraîche et horizontale.
- Couler environ de 15 ml de Gélose à l’extrait de levure, au glucose et au chloromphénicol
dans une nouvelle boite de pétri stérile qui servira de témoin.
- Retourner les boites ainsi préparées et les incuber dans l’étuve à 25°C pendant 5 jours.
- Examiner les boites de préférence tous les jours dés le premier jour d’incubation.
4. Expression des résultats

Retenir pour comptage les boites contenant au moins 150 colonies ;
Dénombrer les colonies en caractérisant les deux types plus fréquemment observés :
- Levures : aspect souvent identique aux colonies bactériennes. Elles peuvent avoir des bords
réguliers ou irréguliers des formes convexes ou plates, pigmentées, souvent opaques ;
- Moisissures : colonies toujours pigmentées en vert ou noir, à structure filamenteuse
étendues.

TPN°3
Recherche et Dénombrement des coliformes totaux, coliformes fécaux et
E.Coli
1. Définitions
En microbiologie alimentaire, on appelle coliformes, les entérobactéries fermentant le lactose
avec production du gaz à 30°C. Il s’agit d’un type issu de plusieurs tribus qui comprend les
genres Escherchia, citrobacter, Enterobacter et Klebshiella.
Les coliformes fécaux, ou coliformes thermotolérants, sont un sous-groupe des coliformes
totaux capables de fermenter le lactose à une température de 44°C. L’espèce la plus
fréquemment associée à ce groupe bactérien est l'Escherichia coli (E. coli) et, dans une
moindre mesure, certaines espèces des genres Citrobacter, Enterobacter et Klebsiella.
Bien que la présence de coliformes fécaux témoigne habituellement d’une contamination
d’origine fécale, plusieurs coliformes fécaux ne sont pas d’origine fécale, provenant plutôt
d’eaux enrichies en matière organique, tels les effluents industriels du secteur des pâtes et
papiers ou de la transformation alimentaire. C’est pourquoi il serait plus approprié d’utiliser le
terme générique « coliformes thermotolérants » plutôt que celui de « coliformes fécaux ».
E. Coli (Escherichia Coli) est un coliforme thermotolérant. Les propriétés biochimiques de
E.coli sont : fermentation de glucose et du lactose avec production de gaz, formation d’Indole
en eau peptonnée.
Dans les aliments, les Coliformes sont dénombrés :
 soit en milieu liquide à l’aide du bouillon BLBVB (bouillon lactosé bilié au vert brillant)
réparti à raison de 10 ml par tubes munis d’une cloche de Durham.
 soit en milieu solide, sur le milieu au Désoxycholate à 1‰.
A. Culture en milieu solide : le désoxycholate

Ce milieu contient le désoxycholate à la concentration de 0.1 % inhibitrice des bactéries
gram+, mais non des coliformes ; le lactose est le seul glucide et le rouge neutre l’indicateur
de pH.

I. Dénombrement des coliformes totaux (NT 16.10 (1995) microbiologie alimentaire,

directive générale pour le dénombrement des coliformes)
1. Définition
Les coliformes totaux sont des bactéries qui forment des colonies caractéristiques à 30°C dans
la gélose lactosée bilié au cristal violet ou rouge neutre (VRBL) ou gélose au desoxycholate et
qui peuvent fermenter le lactose avec production de gaz.
2. principe
- Ensemencement en profondeur d’un milieu sélectif solide, coulé dans deux boites de pétri
avec une quantité déterminée de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide,
ou avec une quantité déterminée de la suspension mère dans le cas d’autres produits.
- Incubation des boites à 30°C pendant 24 h.
Calcul de nombre de coliforme par millilitre ou par gramme d’échantillon, à partir du nombre
de colonies obtenues dans les boites de pétri retenues.
3. Mode opératoire
 prise d’essai : suspension mère et dilutions ;
 ensemencement et incubation :
- prendre une boite de pétri stérile, à l’aide d’une pipette stérile transférer, dans cette
dernière, 1 ml de l’échantillon.
- couler environ 10 ml de gélose au desoxycholate dans la boite précédente.
- Mélanger soigneusement l’inoculum au milieu de culture et laisser se solidifier.
- Couler environ de 15 ml de milieu de culture dans une nouvelle boite de pétri stérile qui
servira de témoin.
- Retourner les boites ainsi préparées et les incuber dans l’étuve à 30°C pour les coliformes
totaux.
4. Expression des résultats

Les germes de bactéries coliformes se représentent sous formes des colonies rouge foncée
(lactose +) de plus de ½ mm de diamètre. Le dénombrement est effectué par comptage de ces
colonies et le résultat est rapporté en ml de produit ou de son émulsion.

II. Dénombrement des coliformes fécaux
1. Définition
Les coliformes fécaux sont des bactéries thermo-tolérantes qui fermentent le lactose avec
production de gaz à la température de 44°C.
2. Mode opératoire
Même mode opératoire que celui de Coliforme Totaux (CT) à la condition d’incuber les
milieux ensemencés à 44°C pendant 24 heures.
B- Culture en milieu liquide : BLBVB+ cloche (NPP : Nombre le plus probabale)
1. Définition
Ce milieu est utilisé pour confirmer la présence des coliformes en inhibant la plupart des
autres germes. L’apparition de gaz en moins de 24 heures peut être considérée comme la
preuve de la fermentation du lactose par les coliformes. Ce milieu est constitué de (pour 1
litre) :
 Bile de boeuf : inhibe les bacilles Gram -…………….20ml
 Vert brillant : agent sélectif……………………………0.0013g
 Lactose : Source de carbone (sélectif) …………………10g
 Peptone : Source de carbone…………………………….10g
Il n’y a pas d’indicateur de pH. La production de gaz ne se faisant pas à partir des peptones,
elle sera due à la fermentation du lactose.
2. Mode opératoire
 Préparer dans un portoir une série de tubes contenant le milieu sélectif (BLBVB) à raison
de trois tubes par dilution.
 A partir des dilutions décimales exemple : 10-5 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans
chacun des trois tubes correspondant à une dilution donnée comme l’indique le schéma ci-
dessous :

Chassez le gaz présent éventuellement dans les cloches de Durham et bien mélanger le
milieu et l’inoculum.
3. Incubation
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures pour la recherche des coliformes totaux et
à 44°C pendant 24 à 48 heures pour la recherche des coliformes fécaux.
4. Lecture :
Sont considérés comme positifs les tubes présentant à la fois :
- Un dégagement gazeux (supérieur au 1/10 de la hauteur de la cloche),
- Un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui constitue le
témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu).
Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les conditions
opératoires décrites.

Exemple :
Inoculum Nombre Caractéristique

VLBVB. Test de Présomption
10-1 + + + 3
10-2 + + - 2
10-3 - - + 1
Le nombre caractéristique est donc « 321 » ; ce qui correspond sur la table de Mac Grady au
nombre 15.
On considère alors qu’il y a 15 Coliformes par gramme de produit à la dilution 10 -1.
Pour obtenir le nombre réel de Coliformes totaux, il suffit de multiplier ce nombre par
l’inverse de la première dilution pour revenir à 1 soit :
15 X 10 = 150 Coliformes totaux par gr de produit à analyser.
Remarque :
Etant donné que les Coliformes fécaux font partie des Coliformes totaux, il est pratiquement
impossible de trouver plus de Coliformes fécaux que de Coliformes totaux.
III. Dénombrement d’Escherichia.Coli:

1. Définition
E.Coli est un coliforme fécal produisant de l’indole et résistant au phénol à 0,085% à 44°C.
2. mode opératoire
 Préparation de milieu de culture : Bouillon Lactosé au Vert Brillant+cloche (BLBVB).
 Ensemencement :
- Introduire dans chaque tube précédemment préparé 1 ml de la solution mère.
- Agiter par un vortex
- Incuber à 44°C pendant 24 heures.
 Pour chaque tube positif (présentant un trouble avec des gaz dans la cloche), prélever une
anse de culture et le rapporter dans un tube d’eau peptonée. Incuber à 44°C pendant 24
heures.
 Rechercher l’indole, en ajoutant dans le tube 0,5 ml du réactif d’Ehrlich Kovacs.

 Interprétation
Lactose + avec gaz (à 44°C) Présence d’au moins un E.coli

Indole+ dans le tube initial.
Donc E.Coli
Lactose + avec gaz (à 44°C) Présence d’au moins un

Indole- coliforme thermo-tolérant et
Donc coliformes thermo- moins de un E.coli dans le
tolérants différents d’E.coli tube initial.
Lactose- (ou+ sans gaz) (à Présence de moins de un

44°C) E.coli ou de un coliforme
Indole + ou – thermo-tolérant dans le tube
Donc : ni E.coli ni Coliformes initial.
thermo-tolérants

TPN°4
Recherche et dénombrement des anaérobies sulfito réducteurs (ASR)
1. But
La recherche et le dénombrement des anaérobies sulfito réducteurs sont réalisés
pour déterminer:
- Clostridium perfringens de type A : Le principal agent des toxi-infections alimentaires qui
soit en même temps anaérobie et sulfito- réducteurs ;
- Clostridium sulfito réducteurs (ou leurs spores) : bactéries commensales de l’intestin ou
saprophytes de sol, comme test de contamination fécale, éventuellement ancienne, vu la
résistance des spores à l’extérieur.
Remarque : Clostridium perfringens fait parti des Clostridium sulfito réducteurs ;
Les Clostridium thermophiles (ainsi que les Bacillus) sont recherchés dans les conserves où
ils peuvent proliférer, puisque leurs spores sont les seuls êtres vivants survivants après
traitement thermique.
2. Principe
Clostridium perfringens et les Clostridium sulfito réducteurs réduisent les sulfites en

sulfures :
6H+ + 6é + SO32- S2- + 3H2O

Les principales caractéristiques des deux catégories sont :
Clostridium perfringens Clostridium sulfito

réducteurs
Caractères - Anaérobies stricts - Anaérobies stricts
- Cultivant à 46°C - Cultivant a 37°C
- Sulfito réducteurs - Sulfito- réducteurs
- Résistant a la - Possédant des spores
cyclosérine résistant au moins 10
minutes à 80°C
Milieu de culture Milieu solide anaérobie Milieu solide anaérobie
contenant des sulfites et un contenant des sulfites et un
indicateur de sulfure (fer II ou indicateur de sulfure (fer II ou
III et la cyclosérine) III et la cyclosérine) avec
traitement pour le
dénombrement des seules
spores, 10 minutes à 80°C
Température d’incubation 46°C 37°C
3. Composition des milieux utilisés

La recherche des Clostridium sulfito-réducteurs et de Clostridium perfringens peut s’effectuer
par dénombrement des formes végétatives et sporulées ou uniquement des formes sporulées
selon le produit. Elle est basée pour la plupart des milieux de culture sur :
- Une croissance dans des milieux contenant de sodium ;
- Leur pouvoir de réduire le sulfite donne en présence de fer du sulfure de fer de coloration
noire.
Pour cultiver les Clostridiums, une exigence principale :
 Créer une anaérobiose. Ceci se réalise aux moyens suivants :
a. Régénérer tous les milieux de culture avant utilisation par maintient dans un bain
d’eau à ébullition 10-15 minutes ;
b. Culture en anaérobiose obtenue par :
- emploi de jarre pour anaérobie (pour les boites de pétri)
- introduction à la surface des milieux de culture de paraffine

 inoculation en gélose profonde (culture en tube)

On peut utiliser les milieux suivants :
Le milieu Trypsine Sulfate Néomycine (TSN) ou Trypsine Sulfate Cyclosérine (TSC).
4. Technique
 En tube
- Mettre la prise d’essai dans le milieu en surfusion ;
- Mélanger sans faire des bulles et solidifier sous l’eau froide.
 En boite
- Mettre l’inoculum dans la boite et recouvrir de milieu puis couler une double couche ;
- Incuber 24h a 48h à 46°C pour les ASR et à 37°C pour les spores ASR.
5. Lecture
Après l’incubation, on va compter le nombre des colonies des germes anaérobies sulfito-
réducteur qui sont noire et a contour bien net puis multiplier le résultat trouver par l’inverse
de la dilution pour convertir en unité de ml.
Les colonies des ASR sur milieu TSN

TP N°5
Dénombrement de Staphylococcus aureus
1. Introduction
Les Staphylocoques sont des Cocci à Gram positif classiquement disposés en amas.
Actuellement, on distingue 44 espèces. L’espèce S. aureus (plus communément appelé
staphylocoque doré) se distingue généralement des autres staphylocoques appelés
Staphylocoques à coagulase négative (SCN) par la présence d’une coagulase. S. aureus est un
germe très important aussi bien dans les infections communautaires que nosocomiales.
2. But
Contrôler les produits alimentaires en détectant les Staphylococcus aureus qu’ils
contiennent et en identifiant leurs différents types.
3. Principe
Il s’agit de la numération des Staphylococcus aureus sur le milieu chapman par étalement
des différentes dilutions de la suspension bactérienne.
4. Mode opératoire
 Préparation des dilutions
- Peser 1g du produit alimentaire.
- Faire un broyage dans un mixeur jusqu’à obtenir un mélange homogène : broyat
- Effectuer à partir de ce broyat nos différentes dilutions : 10 -1, 10-2, 10-3 et 10-4
- Etalement de 100µl de chaque dilution sur Milieu chapman.
Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, permettant la croissance des germes halophiles
car il contient une forte concentration en chlorure de sodium (75 g.L-1). Parmi ces germes
figurent au premier rang les bactéries du genre Staphylococcus, mais aussi les
Micrococcus, les Enterococcus, les Bacillus, et de rares bactéries à Gram négatif.
 Incubation de 24h à 72 h à 30°C
 lecture

TP N°6
Etude de l’influence de la concentration en substrat
1. But : Déterminer l’influence de la concentration en glucose sur la croissance de la

population des levures.
2. Matériel
- 5 erlenmeyers de 1000 ml
- Micro-pipette
- Lame de Mallasses
- Microscope optique
- Tube à essai (pour dilution)
- Agitateur
3. Mode opératoire
a) Préparation de milieu de culture
Composition de base g/l d’eau distillée
Sulfate d’ammonium (NH4)2SO4 10
KH2PO4 6
MgSO4, 7H2O 3
CaCl2, 2H2O 0,1
Solution de vitamines (extrait de levure) 0,5
Glucose 10
- Préparer le milieu de culture dans 5 erlenmeyers de 1000 ml, contenant un milieu de culture
de 100 ml
- les erlenmeyers contiennent différentes concentrations de glucose (5, 10, 20, 30 et 50 g/l).
- Ajuster le pH de la culture à 5,6 en utilisant le pH-mètre.
- Stériliser les erlens dans l’autoclave (à 121 °C pendant 30 min).
b) Ensemencement et incubation
Apres refroidissement, ensemencer avec 1 ml d’une suspension de levure fraichement
préparée.

c) Incubation : l’incubation est réalisée pendant 24 h à 30-32°C.

d) Dénombrement cellulaire (cellule/l)
Il s’agit de faire la numération des cellules vivantes dans un ml de mout fermenté en
utilisant une lame de Mallassez avec un microscope optique calibré. Cette lame est menue
d’un quadrillage des carreaux de 0,01 µl chacun.
- Bien agiter l’échantillon
- Verser à l’aide d’une pipette pasteur quelques gouttes de l’échantillon sur le quadrillage.
- Régler le microscope, voir avec l’objectif 40.
- Compter les cellules qui sont à l’intérieur des carreaux :
- Si le nombre des cellules est incomptable, réaliser l’opération de dilution.
e- Détermination de la concentration cellulaire (biomasse en g/l)
La concentration cellulaire signifie la quantité de biomasse dans un litre de mout fermenté,
elle s’exprime en (g/l).
Appareillage :
-2 tubes coniques
-Centrifugeuses (6000 tr/min)
- Pipette de 10 ml graduée
- Balance électronique
Mode opératoire :
- Peser deux tubes coniques vides (m1)
- Verser 10 ml de l’échantillon dans chacun de deux tubes coniques
- Centrifuger pendant 5 min à 6000 tr/min
- Verser le surnagent et sauvegarder le culot
- Peser le culot (m2)
- Appliquer la formule suivante : la concentration cellulaire (g/l) =

- Pour les deux méthodes de mesure de la biomasse ; tracer la courbe X = f(G), faire
l’interprétation.

TP N°7
Suivi de l’évolution d’une population de levure
1. But
Trouver un modèle mathématique permettant de prévoir l’évolution de nombre de levure dans
une culture.
2. Mode opératoire
a. Préparation de milieu de culture (voir TP N°6)
b. Préparation de pré culture
- Le milieu utilisé contient 3g/l d’extraits de levures, 3g/l d’extrait de malt, 5g/l de peptone et
10g/l de glucose dans un erlenmeyers de 1 l, à 100 ml de milieu.
- Stériliser à l’autoclave.
- Apres refroidissement maintenir à l’agitation dans un shaker à 30°C pendant 24h.
c. Stérilisation de bioréacteur et de milieu de culture
d. Suivi de la fermentation : les paramètres physico-chimiques des fermentations sont
maintenues constants à des valeurs supposées optimales :
- Température 30°C
- pH 4,5 durant l’expérience cette valeur est maintenue constante par addition de (NH 4OH)
2N.
- oxygène : en aérobiose, le débit d’air est fixé à 2 vvm (ou maximum).
- Vitesse d’agitation : 500 tr/mm.
- Inoculer le fermenteur avec environ 300 ml de préculture
e. Suivi de l’évolution de la population
Le suivi est réalisé en effectuant un prélèvement de 10 ml toutes les 30 minutes en ajoutant
quelques gouttes de formol pour arrêter tout métabolisme.
Teneur en matière sèche :
Principe : dessiccation par évaporation d’une certaine quantité de levure et pesée le résidu.
Appareillage :
- dessiccateur
- balance électronique
Mode opératoire

- Peser 5 g de levure (m1)

- Dessiccation pendant 15 min à 150 °C
- Peser la levure séchée (m2)
-
 Détermination de la densité optique
- Régler le spectrophotomètre à une longueur d’onde égale à 600 nm
- Verser l’échantillon dans la cuve spécifique de spectrophotomètre
- Régler à zéro avec de l’eau distillée à 600 nm.
- Si la valeur trouvée est supérieure à 1, faire des dilutions.
3. Exploitation des résultats

- Tracer les courbes X=f(t)
- Etablir une relation entre DO et MS,
- Tracer les vitesses spécifiques de croissance.

Références bibliographiques
-Joseph-Pière, Guiraud ; Microbiologie alimentaire, édition DUNOD, Paris, 2003.

-Laurent Sutra, Michel Federighi, Jean- Louis Jouve, Manuel de Bactériologie
Alimentaire, édition Polytecnica, 1998.

Annexes

Matériel et équipements
Pour réaliser les essais permettant de prélever et analyser les différents échantillons, a fin de
qualifier le type de microorganismes existants dans un aliment, on a besoin des matériels
suivants :
1- la verrerie
Pipettes graduées, éprouvettes, béchers, erlenmeyer, tubes à essais, flacons de divers volumes,
pots, boites de pétri, tube à essais bouchés, pipettes pasteurs, tubes à hémolyse.
2-Appareil producteurs de chaleur

Autoclave : appareil de stérilisation, nécessite l’utilisation de vapeur d’eau et la
pression, leur température entre 100°C et 130°C pendant des temps variés.
Etuve : appareil à température réglable pour créer un milieu favorable à la croissance

d’un microorganisme bien déterminé.
Bec bunsen : pour stériliser certains matériels et pour obtenir une zone stérile pendant
l’analyse.

Bain-marie : appareil producteur de la chaleur et plein d’eau à température réglable,

utilisé pour éviter la gélification du milieu de culture.
3-Appareils producteurs de froid
Réfrigérateur : utilisés pour la conservation des échantillons à analyser, des milieux

non ensemencés et des réactifs.
4-Autres matériels
Balance électronique : utilisé pour la pesée de la prise d’essai et de l’échantillon à

analyser et des composantes des milieux de cultures.
Agitateur mécanique : mélange et homogénéise le contenu des tubes à essai avec un

mouvement circulaire

Micropipette à volume variable
Portoirs des tubes a essai.

Panier métallique : utilisé pour regrouper les boites de pétri
5- Préparation des dilutions

BUT :
Un produit peut contenir de très nombreuses bactéries, par exemple 290000 par cm3. On
comprendra facilement que 1cm3 de ce produit, placé dans un milieu de culture d’une boite de
Pétri, ne permettra pas de compter 290000 colonies bactériennes que l’on devrait attendre,
seule une nappe rassemblant toutes les colonies sera visible.
Il est donc nécessaire de diluer, par exemple au 1/1000, auquel cas on observera 290 colonies
environ sur le milieu.
PRINCIPE :
On parle de diluer au 1/X (exemple 1/10)
Il faut bien comprendre que cela signifie que 1cm3 de produit initial sera placé dans :
(X - 1 cm3) de diluant (exemple pour diluer au 1/10 : 1 cm3 dans 9 cm3).
Les dilutions utilisées en microbiologie alimentaire sont en général sous- multiples de 10 : au
1/10 ou 10-1
: au 1/100 ou 10-2 etc
On va fréquemment jusqu’a 10 -6

Si le produit est solide, on ne peut pas le pipeter, l’analyse comprend, alors obligatoirement,
la confection d’une suspension de l’aliment broyé, dans un liquide qui le diluera forcément.
On s’arrange toujours pour que la dilution soit alors au 1/10.
Exemple : 10 g de viande mis dans 90 cm3 de liquide de dilution.
Ou bien dans des pots stériles contenant 25 g d’aliment on verse 225 g de diluant. Les diluants
peuvent être : soit une eau peptonnée tamponné ou une eau physiologique. Le diluant réduit la
mortalité des bactéries pendant la préparation de l’échantillon.
Préparation d’un échantillon

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PREFACE

Ces travaux pratiques se déroulent dans un laboratoire de Microbiologie

Etre formé aux techniques de base de microbiologie générale.

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 2

TPN°1: Recherche et Dénombrement des germes totaux 04

TP N°2: Recherche et Dénombrement des levures et moisissures 07

TPN°3:Recherche et Dénombrement des coliformes totaux, coliformes fécaux et

TP N°4: Recherche et Dénombrement des Anaérobies Sulfito-réducteurs (ASR) 15

TP N°5: Dénombrement de Staphylococcus Aureus 18

TP N°6: Etude de l’influence de la concentration en substrat 19

TP N°7: Suivi de l’évolution d’une population de levure 21

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 3

Recherche et dénombrement des germes totaux

On ensemence un millilitre de l’échantillon a analyser dans une boite de pétri, et on ajoute le

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 4

(Pouvant être ajustée de façon à obtenir des performances optimales)

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 5

 On calcule le nombre des colonies comptées dans la boite retenue x.

Inoculum Nombre de Colonies Pour revenir à 1

10-1 160 X 10 1600

10-2 70 X 100 7000 27600 / 3 = 9200

10-3 19 X 1000 19 000 GAMT/gr

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 6

Figure N°1 : levures

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 7

4. Expression des résultats

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 8

A. Culture en milieu solide : le désoxycholate

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 9

I. Dénombrement des coliformes totaux (NT 16.10 (1995) microbiologie alimentaire,

4. Expression des résultats

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 10

II. Dénombrement des coliformes fécaux

B- Culture en milieu liquide : BLBVB+ cloche (NPP : Nombre le plus probabale)

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 11

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 12

Inoculum Nombre Caractéristique

III. Dénombrement d’Escherichia.Coli:

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Lactose + avec gaz (à 44°C) Présence d’au moins un E.coli

Lactose + avec gaz (à 44°C) Présence d’au moins un

Lactose- (ou+ sans gaz) (à Présence de moins de un

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 14

Recherche et dénombrement des anaérobies sulfito réducteurs (ASR)

Clostridium perfringens et les Clostridium sulfito réducteurs réduisent les sulfites en

6H+ + 6é + SO32- S2- + 3H2O

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 15

Les principales caractéristiques des deux catégories sont :

Clostridium perfringens Clostridium sulfito

3. Composition des milieux utilisés

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 inoculation en gélose profonde (culture en tube)

Les colonies des ASR sur milieu TSN

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 17

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 18

1. But : Déterminer l’influence de la concentration en glucose sur la croissance de la

SOUIY Z. et HAJJI H. Page 19

c) Incubation : l’incubation est réalisée pendant 24 h à 30-32°C.

- Appliquer la formule suivante : la concentration cellulaire (g/l) =

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Suivi de l’évolution d’une population de levure

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- Peser 5 g de levure (m1)

3. Exploitation des résultats